Name: Modelo de explante de extremidad posterior murina para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a desarrollar un modelo de explante de extremidad posterior murina para estudiar la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles. Esta plataforma experimental permite recrear patrones multiaxiales de tensión mecánica.

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Los autores agradecen el apoyo y la asistencia brindados por Jeff Fox y Vidya Venkatramani del Centro de Investigación Musculoesquelética de la Universidad de Rochester, financiado en parte por P30AR06965. Además, los autores desean agradecer al Centro de Microscopía Óptica y Nanoscopía (CALMN) del Centro Médico de la Universidad de Rochester por su ayuda con la microscopía multifotónica. Este estudio fue financiado por R01 AR070765 y R01 AR070765-04S1, así como por 1R35GM147054 y 1R01AR082349.

Comprensión del pinzamiento del tendón: modelo de explante murino para el estudio de la mecanobiología

Los autores no tienen nada que revelar.

La plataforma experimental de explante de extremidades posteriores murinas, junto con el protocolo de cultivo de tejidos descrito en este estudio, proporciona un modelo adecuado para estudiar la mecanobiología de la formación de fibrocartílago impulsada por el pinzamiento en la inserción del tendón de Aquiles. La utilidad de este modelo de explante queda demostrada por los resultados representativos, que indican el mantenimiento de la viabilidad celular concomitante con un cambio significativo y espacialmente heterogéneo...

Una multitud de tendones, incluidos el tendón de Aquiles y los tendones del manguito rotador, experimentan pinzamiento óseo debido a la posición anatómica normal1,2,3,4. El pinzamiento del tendón genera una tensión compresiva dirigida transversalmente al eje longitudinal de la fibra5,6,7. Las regiones de pinzamiento del tendón demuestran un fenotipo único de fibrocartílago en el que las células redondas y encogidas (fibrocondrocitos) están incrustadas dentro de una red de colágeno desorganizada con un contenido marcadamente mayor de glicosaminoglicanos (GAG)2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Estudios anteriores sugieren que el entorno mecánico dispar producido por el pinzamiento del tendón sostiene esta matriz rica en GAG al impulsar la deposición de grandes proteoglicanos agregantes, sobre todo agrecano, aunque los mecanismos subyacentes no están claros1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Si bien el fibrocartílago es una característica normal en las regiones afectadas de tendones sanos, el metabolismo aberrante de los proteoglicanos asociado con la formación excesiva de fibrocartílago es una característica distintiva de la tendinopatía, una enfermedad común y debilitante que surge de manera desproporcionada en los tendones con afectación crónica1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. En consecuencia, el pinzamiento del tendón se reconoce clínicamente como un factor extrínseco importante que impulsa varias de las tendinopatías más comunes, incluida la enfermedad del manguito rotador y la tendinopatía insercional del tendón de Aquiles (IAT)50,51,52. En la actualidad, el tratamiento de la tendinopatía es ineficiente. Por ejemplo, aproximadamente el 47% de los pacientes con TAI requieren intervención quirúrgica después de un tratamiento conservador fallido, con resultados postoperatorios variables53,54,55,56. A pesar de la aparente relación entre el pinzamiento y la tendinopatía, los mecanismos mecanobiológicos por los cuales las células del tendón pinzado sienten y responden a su entorno mecánico están mal descritos, lo que oscurece la comprensión de la patogénesis de la tendinopatía y da lugar a un tratamiento inadecuado.
Los modelos de explantes son herramientas útiles en el estudio de la mecanobiología tendinosa57,58. Como primer paso hacia la comprensión de la mecanobiología del pinzamiento tendinoso, varios estudios previos han explorado la respuesta celular tras la aplicación de la compresión uniaxial simple a las células o explantes tendinosos extirpados 27,29,30,31,32,33,34,39. Sin embargo, las células in vitro carecen de matrices extracelulares y pericelulares que faciliten la transferencia de cepas, secuestren importantes factores de crecimiento y citocinas liberadas por deformación mecánica, y proporcionen sustrato para complejos de adhesión focal que desempeñan un papel en la mecanotransducción57,59. Además, tanto los estudios in vitro como los de explantes extirpados no logran recapitular el ambiente de deformación mecánica multiaxial generado por el pinzamiento tendinoso in vivo, que depende de las características anatómicas de la región afectada 5,6. En el contexto de la inserción del tendón de Aquiles afectado, esto incluye los tejidos circundantes como la bolsa retrocalcánea y la almohadilla de grasa de Kager 60,61,62,63. Por el contrario, los modelos in vivo de pinzamiento tendinoso 25,28,36,37,38,64,65,66 permiten un control mínimo sobre la magnitud y frecuencia de la carga aplicada directamente al tendón, lo cual es una limitación bien reconocida de los modelos in vivo para el estudio de la mecanobiología del tendón 57,58,67,68,69,70. Dados los desafíos en la medición de la deformación tendinosa in vivo, el entorno de deformación interna generado dentro de estos modelos a menudo está mal caracterizado.
En este manuscrito, presentamos una plataforma experimental personalizada que recrea el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles sobre el calcáneo dentro de explantes de extremidades posteriores murinas enteras que, cuando se combina con este protocolo de cultivo de tejidos, mantiene la viabilidad durante 7 días en cultivo de explantes y permite el estudio de las secuelas biológicas del pinzamiento del tendón. La plataforma está construida sobre una base de ácido poliláctico (PLA) impresa en 3D que proporciona la base para la fijación de las empuñaduras y el inserto de reducción de volumen de PLA impreso en 3D. Las empuñaduras se utilizan para sujetar la parte superior de la pierna y la rodilla proximales a la unión miotendinosa del tendón de Aquiles con la cara caudal de la extremidad posterior hacia arriba, lo que permite obtener imágenes del tendón de Aquiles desde arriba utilizando una sonda de ultrasonido o un microscopio invertido (Figura 1A). El inserto de reducción de volumen se desliza a lo largo de una pista en la base y reduce el volumen requerido de medios de cultivo de tejidos. Una línea trenzada envuelta alrededor de la pata trasera se enruta fuera de la plataforma utilizando el diseño de la base y un clip de PLA impreso en 3D. Al tirar de la cuerda, la pata trasera se flexiona dorsal y la inserción del tendón de Aquiles se incita contra el calcáneo, lo que resulta en una tensión compresiva transversal elevada 5,6 (Figura 1A). La plataforma está contenida dentro de un baño acrílico que mantiene los explantes de la extremidad posterior sumergidos en medios de cultivo de tejidos. Asegurar la cuerda tensa al exterior de la bañera con cinta adhesiva mantiene la dorsiflexión del tobillo para producir un pinzamiento estático de la inserción del tendón de Aquiles. Los archivos CAD para componentes impresos en 3D se proporcionan en múltiples formatos (Archivo complementario 1), lo que permite la importación a una gama de software CAD comercial y gratuito de código abierto para su modificación y adaptación a las necesidades experimentales. Si el acceso a las impresoras 3D no está disponible para la fabricación, se pueden proporcionar archivos CAD a los servicios de impresión 3D en línea que imprimirán y enviarán las piezas a bajo costo.
Es importante destacar que el complejo musculotendinoso tríceps sura-tendón de Aquiles abarca las articulaciones de la rodilla y el tobillo 71,72,73. En consecuencia, la tensión de tracción en el tendón de Aquiles se ve influenciada por la flexión de la rodilla. La extensión de la rodilla pone el tendón de Aquiles bajo tensión, mientras que la flexión de la rodilla reduce la tensión. Al extender primero la rodilla y luego dorsiflexionar pasivamente el tobillo, las tensiones de compresión en la inserción impactada se pueden superponer a las tensiones de tracción. Por el contrario, al flexionar pasivamente el tobillo con la rodilla flexionada, se reduce la tensión de tracción y queda la tensión de compresión. El protocolo actual explora tres de esas condiciones. 1) Para el pinzamiento estático, el pie se flexiona dorsal a < 110° con respecto a la tibia para incidir la inserción, con la rodilla flexionada para reducir la tensión. 2) Para el grupo de tensión basal, el tobillo se extiende por encima de los 145° de dorsiflexión con la rodilla extendida, generando predominantemente tensión de tracción en la inserción. 3) Para el grupo descargado, los explantes se cultivan en una placa de Petri con la rodilla y el tobillo en posiciones neutras en ausencia de carga aplicada externamente. Los ángulos mencionados anteriormente se miden fotográficamente en relación con un sistema de coordenadas en el que el pie y la tibia son paralelos en un ángulo de 180° y perpendiculares en un ángulo de 90°.
Los pasos clave del protocolo incluyen: 1) la disección de los explantes de las extremidades posteriores y la extracción cuidadosa de la piel y el tendón plantar; 2) cultivo de explantes después de un pretratamiento de 48 h con dexametasona; 3) corte de tejido y tinción histológica; y 4) análisis de imágenes en color para evaluar la formación de fibrocartílago. Después de la disección, cada explante de extremidad posterior se pretrata durante 48 h en medios de cultivo suplementados con dexametasona74. Las extremidades contralaterales de cada ratón se asignan a grupos experimentales separados para su comparación por pares, lo que ayuda a controlar la variabilidad biológica. Después del pretratamiento, los explantes se colocan en plataformas como se describió anteriormente y se cultivan durante 7 días más (Figura 1B). Se realizan comparaciones adicionales con un grupo pretratado (día 0) en el que los explantes se retiran inmediatamente después del pretratamiento de 48 h.
Después del cultivo del explante, las extremidades posteriores se recortan, se fijan en formol, se descalcifican y se incrustan en parafina. El corte en serie en orientación sagital proporciona una visualización del tendón de Aquiles desde la unión miotendinosa hasta la inserción del calcáneo, al tiempo que permite realizar un seguimiento de la profundidad de la sección a través de todo el tendón. El marcaje X-nick de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL) se utiliza para visualizar el daño en el ADN secundario a la apoptosis y evaluar la viabilidad. La histología del azul de toluidina y el análisis de imágenes en color personalizadas se realizan para cuantificar los cambios en la tinción de GAG. A continuación, se utilizan secciones de tejido teñidas con azul de toluidina para la obtención de imágenes de SHG con el fin de caracterizar las alteraciones en la organización de las fibras del collage (Figura 1B).
Los resultados representativos proporcionados sugieren una tinción histológica alterada de la matriz rica en GAG y una desorganización de la red de colágeno extracelular generada por 7 días de pinzamiento estático dentro del modelo. Este modelo se puede utilizar para explorar los mecanismos moleculares que subyacen al cambio fibrocartilaginoso impulsado por el pinzamiento.

<table><tbody><tr><td>Almohadillas absorbentes</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>Para disección de sobremesa</td></tr><tr><td>Baño acrílico</td><td>Source One</td><td>X001G46CB1</td><td>Contiene la plataforma de explante sumergida en medios de cultivo</td></tr><tr><td>Contenedor de autoclave</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-361-20</td><td>Utilizado como contención secundaria, contiene dos plataformas</td></tr><tr><td>Base</td><td>:</td><td></td> <td>impresa en 3D a partir de archivos CAD proporcionados como archivos complementarios</td></tr><tr><td>Línea trenzada</td><td>Prueba KastKing</td><td>de 30 lb</td><td>Se utiliza para envolver la pata y aplicar la dorsiflexión del tobillo</td></tr><tr><td>Clip</td><td>:</td><td></td> <td>impreso en 3D a partir de archivos CAD proporcionados como archivos complementarios</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-034</td><td>Rectangular, n.º 2, 50 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>VWR</td><td>8312-4</td><td>Medios de montaje a base de xileno para el deslizamiento de cubreobjetos Tejido teñido con azul de toluidina secciones</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>MP Biomedical LLC 194561</td><td></td><td>CAS#50-02-2</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO), anhidro</td><td>Invitrogen de ThermoFisher</td><td>D12345</td><td>CAS#67-68-5, uso para solubilizar dexametasona en soluciones madre concentradas</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara</td><td>Scotch Brand</td><td>34-8724-5195-9</td><td>Para colocar papel de lija en las platinas de agarre</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td><td>Gibco de ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>alto contenido de glucosa, (-) piruvato, (+) glutamina</td></tr><tr><td>EDTA sal tetrasódica dihidratada</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J15700. A1</td><td>CAS#10378-23-1, utilizado para hacer una solución de EDTA al 14% para la descalcificación de muestras</td></tr><tr><td>Etanol, 200 grados</td><td>Thermo Scientific</td><td>T038181000</td><td>CAS#64-17-5, suministro de 1 L</td></tr><tr><td>Almohadillas de biopsia de espuma</td><td>Leica</td><td>3801000</td><td>Utilizadas con casetes de procesamiento, ayudan a mantener las articulaciones del tobillo en la posición deseada durante la fijación y la descalcificación</td></tr><tr><td>Pinzas, #SS estándar Inox Dumont</td><td></td><td>11203-23</td><td>Recto, liso, fino </td></tr><tr><td>puntas Pinzas, Micro-Adson 4.75"</td><td>Fisherbrand</td><td>13-820-073</td><td>Puntas rectas y finas con dientes dentados</td></tr><tr><td>Papel de lija granate, grano 50-D</td><td>Norton</td><td>M600060 01518</td><td>U otro papel de lija de grano grueso</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-500</td><td>CAS#64-19-7, para ajustar el pH del tampón de acetato de sodio utilizado para la histología del azul de toluidina, así como la solución de descalcificación de EDTA al 14%</td></tr><tr><td>Empuñaduras</td><td>ADMET</td><td>GV-100NT-A4</td><td>Se incluyen mordazas, tornillos y resortes de acero inoxidable descritos en el protocolo</td></tr><tr><td>Portaobjetos adhesivos para microscopio Histobond</td><td>VWR</td><td>16005-108</td><td>Las secciones sagitales de los explantes de las extremidades traseras se adhieren de forma fiable a estos portaobjetos a través de todos los protocolos de tinción</td></tr><tr><td>Kit de detección de muerte celular in situ, TMR Ensayo</td><td>ROKE</td> rojo <td>12156792910</td><td>TUNEL</td></tr><tr><td>Cinta de etiquetado</td><td>Fisherbrand</td><td>15-959</td><td>O cualquier otra cinta de etiquetado de preferencia</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td>CAS#50-81-7, para la formulación de medios de cultivo</td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra, 10%</td><td>Leica</td><td>3800600</td><td>Para la fijación de muestras, suministro de 5 galones</td></tr><tr><td>Placas de Petri Nunc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741-1CS</td><td>100 mm de diámetro x 25 mm de altura, mantener los explantes sumergidos en 70 mL de medios de cultivo como se describe en el protocolo</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (100X)</td><td>Gibco de ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Agregue de 5 mL a 500 mL 1X DMEM para una concentración de trabajo del 1% v/v (1X)</td></tr><tr><td>Ácido poliláctico (PLA) Filamento de 1,75 mm</td><td>Hatchbox-Elija</td><td></td> <td>el diámetro del filamento compatible con su extrusora de impresora 3D, en el color de su elección.</td></tr><tr><td>Casetes de procesamiento</td><td>Leica</td><td>3802631</td><td>Para la fijación, descalcificación e inclusión en parafina</td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración Prolong Gold con DAPI</td><td>Invitrogen de ThermoFisher</td><td>P36931</td><td>Medios de montaje para secciones de tejido deslizantes después de TUNEL</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1700-50</td><td>CAS#39450-01-6, utilizados para la recuperación de antígenos en el protocolo TUNEL</td></tr><tr><td>Tijeras, finas</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td>Juego</td>de</tr> tinción de portaobjetos recto y afilado<tr><td>, 12 plazas</td><td>Mercedes Scientific&nbsp;</td><td>MER 1011</td><td>Gradilla con 12 placas de tinción y cucharones deslizantes para la histología del azul de toluidina</td></tr><tr><td>Acetato de sodio, anhidro</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>A1318430</td><td>CAS#127-09-3, utilizado para fabricar tampón para la histología del azul de toluidina</td></tr><tr><td>Hojas de micrótomo de perfil bajo Tissue-Tek Accu-Edge</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td>Para el corte de parafina</td></tr><tr><td>Azul de toluidina O</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>348601000</td><td>CAS#92-31-9</td></tr><tr><td>Inserto de reducción de volumen</td><td>:</td><td></td> <td>impreso en 3D a partir de archivos CAD proporcionados como archivos complementarios</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>, Leica 3803665</td><td></td><td>suministro de 4 galones para tinción histológica</td></tr></tbody></table>

modelo de explante de extremidad posterior murina para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento del tendón de aquiles

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

El pinzamiento tendinoso sobre el hueso genera un ambiente de deformación mecánica multiaxial con una deformación compresiva transversal marcadamente elevada, que provoca un fenotipo de fibrocartílago localizado caracterizado por la acumulación de matriz rica en glicosaminoglicanos (GAG) y la remodelación de la red de colágeno. Si bien el fibrocartílago es una característica normal en las regiones afectadas de tendones sanos, el exceso de depósito de GAG y la desorganización de la red de colágeno son características distintivas de la tendinopatía. En consecuencia, el pinzamiento se reconoce clínicamente como un factor extrínseco importante en el inicio y la progresión de la tendinopatía. Sin embargo, la mecanobiología que subyace al pinzamiento del tendón sigue siendo poco estudiada. Los esfuerzos anteriores para dilucidar la respuesta celular al pinzamiento del tendón han aplicado compresión uniaxial a las células y extirpado explantes de tendones in vitro. Sin embargo, las células aisladas carecen de un entorno extracelular tridimensional crucial para la mecanorespuesta, y tanto los estudios in vitro como los de explantes extirpados no logran recapitular el entorno de deformación multiaxial generado por el pinzamiento del tendón in vivo, que depende de las características anatómicas de la región afectada. Además, los modelos in vivo de pinzamiento tendinoso carecen de control sobre el entorno de deformación mecánica. Para superar estas limitaciones, presentamos un novedoso modelo de explante murino de extremidad posterior adecuado para estudiar la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles. Este modelo mantiene el tendón de Aquiles in situ para preservar la anatomía local y reproduce el entorno de tensión multiaxial generado por el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles sobre el calcáneo durante la dorsiflexión del tobillo aplicada pasivamente, al tiempo que retiene las células dentro de su entorno nativo. Describimos un protocolo de cultivo de tejidos integral para este modelo y presentamos datos que establecen la viabilidad sostenida del explante durante 7 días. Los resultados representativos demuestran un aumento de la tinción histológica de GAG y una disminución de la alineación de las fibras de colágeno secundaria al pinzamiento, lo que sugiere una formación elevada de fibrocartílago. Este modelo se puede adaptar fácilmente para investigar diferentes regímenes de carga mecánica y permite la manipulación de vías moleculares de interés para identificar mecanismos que median el cambio fenotípico en el tendón de Aquiles en respuesta al pinzamiento.

Las imágenes representativas de las secciones de tejido teñidas con TUNEL demuestran núcleos apoptóticos mínimos dentro del cuerpo del tendón de Aquiles después de 7 días de cultivo de explantes en grupos experimentales (Figura 2A). La cuantificación de estas imágenes proporciona evidencia de que el protocolo de cultivo de tejidos mantiene hasta un 78% de viabilidad en promedio dentro del tendón de Aquiles después de 7 días de cultivo de explantes en condiciones de carga (<strong class="xfig...

Presentamos una plataforma experimental personalizada y un protocolo de cultivo de tejidos que recrea el cambio fibrocartilaginoso impulsado por el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles en explantes de extremidades posteriores murinas con viabilidad celular sostenida, proporcionando un modelo adecuado para explorar la mecanobiología del pinzamiento tendinoso.

Modelo de explante de extremidad posterior murina para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Estudiamos la mecanobiología subyacente al pinzamiento del tendón y el proceso por el cual esta demanda mecánica única impulsa la formación de cartílago de fibra localizada en la salud y la enfermedad. En este trabajo se busca caracterizar la matriz para modelarla en relación con patrones espacialmente heterogéneos de deformación mecánica multiaxial, generados por el impacto e identificar los mecanismos moleculares que median esta respuesta. Los modelos in vitro para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento han aplicado la compresión simple a células tendinosas aisladas o la compresión uniaxial artificial a explantes tendinosos parciales y completos.Se establecieron modelos animales de pinzamiento tendinoso, manipulando la fuente externa de pinzamiento tendinoso in vivo, la mayoría de las veces quirúrgicamente, y explorando la biología después de reanudar la actividad física. Los modelos in vitro presentan limitaciones significativas ya que las células aisladas carecen de su entorno extracelular tridimensional, crucial para la mecano-respuesta. Si bien los modelos de explantes extirpados eluden esta limitación, ambos no logran recrear los patrones de deformación multiaxial g

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