Desarrollo de ensayos multiplex de RT-qPCR en tiempo real para la detección de SARS-CoV-2, influenza A/B y MERS-CoV
10 de noviembre de 2023
Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado.
El objetivo general de este ensayo es administrar un enfoque múltiple para la detección simultánea de virus respiratorios que circulan comúnmente, como el SARS-CoV-2, el MERS, la influenza A y la influenza B. Las tecnologías predominantes que impulsan los avances en nuestro campo incluyen CRISPR, ensayos de aminoácidos de flujo lateral, sensores biomoleculares basados en papel, pruebas Sherlock en una olla, aptámeros de ADN y RT-qPCR múltiplex integrada con amplificación isotérmica mediada por bucles. LÁMPARA. Sin embargo, la RT-qPCR multiplex es la más sensible, la más común y es el estándar de oro para el diagnóstico de varios virus. El desafío experimental actual es establecer un protocolo que se pueda utilizar para detectar copias de ARN de tan solo 10 copias.
Utilizamos un kit interno de RT-qPCR para el ensayo, que es rentable y en tiempo y costo. Para comenzar, prepare el tampón 2x para RT-qPCR en agua libre de ADN/ARN Almacene el tampón a menos 20 grados centígrados hasta su uso posterior. A continuación, mezcle los cebadores y las sondas en un tubo de 1,5 mililitros.
Aumente el volumen con tampón de elución, luego almacene el tubo a menos 20 grados centígrados. Prepare una mezcla de enzimas con taq polimerasa y MMLV-RT en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo. Compensar el volumen con tampón de almacenamiento de polimerasa taq.
Ahora vuelva a suspender los ARN sintéticos virales en tubos separados con 100 microlitros de tampón Tris-EDTA para hacer existencias de 10 a la sexta copia de ARN por microlitro. Para mezclar las existencias del virus, agregue cinco microlitros de SARS-CoV-2, influenza A y B a 50 microlitros de tampón Tris-EDTA. Del mismo modo, mezcle el SARS-CoV-2 y el MERS-CoV para obtener una segunda mezcla viral.
Diluir ambas mezclas diez veces para obtener una dilución final de 10 copias de ARN por microlitro. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos, pipetee 2x tampón, cebador, enzima, agua libre de ADN/ARN y las mezclas de ARN correspondientes. Selle la placa con un sello de placa adhesiva.
A continuación, centrifugar la placa durante un minuto para recoger el líquido en el fondo del pozo. A continuación, programe la máquina de PCR para que acepte el tipo de bloque rápido de 96 pocillos con el tipo experimental configurado en la curva estándar. Establezca los reactivos en reactivos TaqMan y seleccione las propiedades de ejecución estándar.
Defina las dianas genéticas y el colorante reportero. A continuación, defina los nombres de las muestras para cada reacción que se va a probar y asigne objetivos y muestras al diseño de la placa. Ahora introduzca el programa de ciclo en el instrumento.
Transfiera la placa a la máquina QPCR en tiempo real en la orientación correcta y presione ejecutar para iniciar el ciclo. Elija la ubicación del archivo para guardar los datos experimentales. A continuación, examine los gráficos de amplificación proporcionados por el programa QPCR.
Los dos kits desarrollados fueron capaces de amplificar con éxito los tres genes diana simultáneamente, con tan solo 10 copias de ARN por reacción. Las eficiencias de amplificación para todas las titulaciones virales estuvieron por encima del 99%
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Descripción general
Este estudio presenta el desarrollo de dos kits basados en sondas para RT-qPCR en un solo paso, diseñados para la detección simultánea de virus respiratorios comunes, incluyendo SARS-CoV-2, MERS y diversas cepas de Influenza. Estos kits mejoran las capacidades diagnósticas de laboratorios especializados mediante un enfoque rentable y eficiente en tiempo.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Detección de virus respiratorios
- Técnica de RT-qPCR
- Desarrollo de ensayos multiplex
Antecedentes
- La necesidad de un diagnóstico rápido y sensible de los virus respiratorios.
- Las limitaciones de las tecnologías actuales de detección.
- La importancia de un enfoque múltiple para la detección simultánea.
Métodos Utilizados
- Kits de RT-qPCR desarrollados internamente
- Detección de ARN viral
- RT-qPCR multiplex combinada con sondas específicas
Resultados principales
- Detectó con éxito SARS-CoV-2 y MERS junto con Influenza A y B.
- Logró amplificación con copias de ARN tan bajas como 10 por reacción.
- Mostró eficiencias de amplificación superiores al 99 % para los genes diana.
Conclusiones
- Los kits de RT-qPCR desarrollados son efectivos para la detección multiplex de virus respiratorios.
- Este estudio contribuye a mejores estrategias diagnósticas en la investigación virológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los ensayos de RT-qPCR multiplex en tiempo real para SARS-CoV-2, Influenza A/B y MERS-CoV abordan la necesidad crítica de detección rápida, sensible y específica de virus respiratorios que circulan simultáneamente en la investigación básica y traslacional. Estos ensayos permiten diferenciar con alta confianza los objetivos virales, apoyando una validación robusta de dianas y reduciendo la ambigüedad en el desarrollo temprano de diagnósticos. Su integración mejora la confianza predictiva y la eficiencia operativa en carteras de I+D centradas en amenazas de enfermedades infecciosas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación precisa de dianas virales para la validación funcional en modelos de enfermedades respiratorias.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al distinguir patógenos virales estrechamente relacionados en muestras complejas.
- Facilita la confianza predictiva en la selección y triaje de dianas para programas diagnósticos y terapéuticos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas de ensayo multiplex validados para el cribado posterior de compuestos antivirales o diagnósticos.
- Proporciona salidas estandarizadas, reproducibles y cuantitativas para la evaluación de referencia y optimización de ensayos.
- Permite la preparación para cribado escalable y de alto rendimiento, facilitando la evaluación rápida de intervenciones candidatas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con las estrategias traslacionales de biomarcadores al permitir la detección simultánea de múltiples virus respiratorios.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante una detección viral cuantitativa y robusta.
- Reduce el riesgo en el avance de candidatos al garantizar la identificación precisa de patógenos en sistemas relevantes para la enfermedad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Los ensayos de RT-qPCR múltiple se integran en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, apoyando la prueba temprana de hipótesis, el desarrollo de ensayos y la investigación traslacional en portafolios de enfermedades infecciosas.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona detección de alta sensibilidad para la validación de objetivos virales basada en hipótesis.
- Tamizaje: Ofrece resultados cuantitativos y reproducibles para la estandarización de ensayos y evaluación de compuestos.
- Análisis: Proporciona datos robustos de amplificación y métricas de especificidad para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Permite la alineación de biomarcadores y continuidad a través de las fases de investigación.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable y adaptable para la detección multiplex de virus en diversos entornos de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la detección viral.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo diagnósticos.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir una diferenciación temprana y precisa de los patógenos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas contra enfermedades infecciosas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en virología molecular y diseño de ensayos de PCR cuantitativa.
- Necesita acceso a instrumentación de PCR en tiempo real y a infraestructura de software analítico.
- Exige estandarización entre equipos para la configuración del ensayo, interpretación de datos y control de calidad.
- Puede requerir adaptación para diferentes tipos de muestras o variantes virales emergentes.
- El rendimiento depende de la especificidad de los cebadores/sondas y de la calidad del ARN, según lo respaldado por la fuente.
