Cristalización ABCG5/G8 en un entorno de bicelas lipídicas para cristalografía de rayos X
25 de agosto de 2023
Este protocolo describe una configuración para la cristalización del transportador de esteroles ABCG5/G8. ABCG5/G8 se reconstituye en biceles para la cristalización en gotas colgantes. El protocolo no requiere materiales ni sustratos especializados, por lo que es accesible y fácil de adaptar en cualquier laboratorio para la determinación de la estructura de la proteína mediante cristalografía de rayos X.
Hola, mi equipo estudia el tipo de pérdida de proteínas que se extiende a través de la membrana celular, y estamos analizando la relación con la medicina y la biología. Específicamente, estamos viendo una proteína en particular que requeriría ATP para impulsar su función, y luego, el nombre se llama transportador de casetes de unión a ATP. En particular, estamos analizando su relación fundamental entre la estructura y la función, y luego la usamos para comprender muchas enfermedades crónicas, especialmente las enfermedades cardiovasculares.
Debido a la complejidad de la purificación de las proteínas de membrana y su estabilidad a temperaturas nativas, la obtención de cristales de proteínas 3D es el principal desafío en el campo, y también limita las aplicaciones de descubrimiento de fármacos. Nuestro equipo ha establecido métodos en crio-EM y cristalografía de rayos X para los estudios estructurales de proteínas transportadoras de membrana. Y anteriormente, nuestro laboratorio también resolvió la estructura cristalina del primer heterodímero humano obligado ABCG5/G8, tanto en estado apo como unido al colesterol.
Nuestros resultados pueden proporcionar un gran avance en el descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas o en la reutilización de fármacos. La obtención de cristales de proteínas en 3D también puede permitir experimentos de remojo para la cocristalización de complejos de proteínas y ligandos. Nuestro laboratorio tiene como objetivo determinar las bases moleculares del reconocimiento y translocación lipídica por proteínas transportadoras de lípidos dependientes de ATP.
Y también pretendemos establecer nuevos métodos en el desarrollo de fármacos para estudiar la dinámica molecular y los aspectos estructurales de los transportadores ABC.
Descripción general
Este protocolo describe un método para cristalizar el transportador de esteroles ABCG5/G8, utilizando bicapas en forma de bicelos para la cristalización por gota colgante. El enfoque está diseñado para ser sencillo y adaptable a diversos entornos de laboratorio, facilitando la determinación de la estructura proteica mediante cristalografía de rayos X.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Estructural
- Proteínas de Transporte de Membrana
Antecedentes
- ABCG5/G8 es un transportador de la caja de unión a ATP implicado en el transporte de lípidos.
- Comprender su estructura es fundamental para obtener información sobre enfermedades crónicas, particularmente afecciones cardiovasculares.
- Los desafíos en la purificación de proteínas de membrana obstaculizan los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.
- Estudios previos han elucidado la estructura cristalina de ABCG5/G8 en varios estados.
Objetivo del estudio
- Investigar la base estructural del reconocimiento y la translocación de lípidos por los transportadores ABC.
- Desarrollar nuevas metodologías para el descubrimiento de fármacos relacionados con proteínas de transporte de membrana.
- Posibilitar experimentos de cocrystalización para estudiar las interacciones proteína-ligando.
Métodos Utilizados
- Modificación química de fracciones proteicas mediante metilación reductiva.
- Uso de columnas de NTA con níquel para la purificación de proteínas.
- Preparación de la solución stock de linfocitos B para cristalización.
- Método de difusión de vapor en gota colgante para el montaje de cristalización.
Resultados principales
- Se observó una cristalización exitosa de ABCG5/G8 dentro de una a dos semanas.
- Los cristales adecuados para la recopilación de datos midieron típicamente 50 micrones por 100 micrones por 2 micrones.
- La metodología permite realizar más estudios sobre las interacciones con lípidos y el desarrollo de fármacos.
- Los resultados contribuyen a comprender la relación entre la estructura y la función de los transportadores ABC.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar la estructura de ABCG5/G8.
- Los hallazgos podrían facilitar avances en el descubrimiento de fármacos para enfermedades relacionadas.
- Los trabajos futuros se centrarán en explorar la dinámica de los mecanismos de transporte de lípidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La elucidación estructural de alta resolución de ABCG5/G8 en un entorno de bicapas lipídicas aborda un cuello de botella crítico en el descubrimiento de fármacos dirigidos a proteínas de membrana. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la validación de dianas y apoya la reducción de riesgos mecanicistas en carteras centradas en transportadores. La cristalización confiable de transportadores ABC permite el diseño de ligandos guiado por estructura y acelera las decisiones de cribado en etapas tempranas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de los mecanismos de transporte de lípidos dependientes de ATP con resolución atómica.
- Apoya la validación funcional de objetivos al preservar la conformación nativa de las proteínas en entornos de bicelas.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas para dianas transportadoras implicadas en enfermedades crónicas.
- Proporciona plantillas estructurales para la triage de carteras basada en hipótesis.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona cristales de proteínas validados adecuados para estudios de inmersión con ligandos y co-cristalización.
- Normaliza la preparación de proteínas de membrana para flujos de trabajo de cribado posteriores reproducibles.
- Permite la evaluación cuantitativa de interacciones proteína-ligando mediante cristalografía de rayos X.
- Apoya el desarrollo de ensayos escalables para bibliotecas de compuestos dirigidos a transportadores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona los conocimientos estructurales con la función de transportadores relevantes para enfermedades en la investigación cardiovascular.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento molecular hasta la validación preclínica de moduladores de transportadores.
- Reduce el riesgo de traslación al informar estudios de biomarcadores y estudios mecanicistas.
- Permite el diseño racional de modelos preclínicos basados en las relaciones estructura-función de los transportadores.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
Este método de cristalización basado en bicapas integra la continuación del descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la investigación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías para la función de los transportadores ABC.
- Tamizaje: Proporciona cristales de alta calidad y reproducibles para tamizaje basado en estructuras y evaluación de ligandos.
- Análisis: Permite lecturas estructurales cuantitativas para comparar estados con ligando unido y estados apó.
- Investigación Traducional: Conecta la estructura molecular con la actividad del transportador relevante para enfermedades y la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la cristalización de diversas proteínas de membrana en las líneas de descubrimiento de fármacos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas transportadoras.
- Valor operativo: Estandariza la cristalización de proteínas de membrana para lograr reproductibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos y mejora la eficiencia del capital en programas centrados en transportadores.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas transportadoras y el avance de activos guiados por estructura.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de purificación y cristalización de proteínas de membrana.
- Exige acceso a infraestructura analítica para difracción de rayos X y caracterización de proteínas.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de bicelas y cristalización.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes familias de transportadores o composiciones lipídicas.
- La estabilidad y el rendimiento de la proteína pueden limitar el rendimiento y la escalabilidad en algunos sistemas.
