Name: Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprende a aislar fibras musculares de diferentes longitudes de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones mediante disociación enzimática. Este método permite estudiar la cinética de calcio y el acoplamiento excitación-contracción.

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Los autores expresan su agradecimiento al profesor Robinson Ramírez de la UdeA por su ayuda con los animales y algunas fotos y a Carolina Palacios por su apoyo técnico. Johan Pineda de Kaika nos ayudó a configurar las cámaras de color y fluorescencia. Shyuan Ngo, de la Universidad de Queensland, tuvo la amabilidad de revisar el manuscrito. Este estudio fue financiado por el CODI-UdeA (2020-34909 del 22 de febrero de 2021 y 2021-40170 del 31 de marzo de 2022, SIU), y la Oficina de Planeación-UdeA (E01708-K y ES03180101), Medellín, Colombia, a JCC. Los financiadores no participaron en la recopilación y el análisis de datos, ni en la redacción ni en la presentación de manuscritos.

Aislamiento enzimático y caracterización de fibras musculares de ratón de longitud variable

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Para complementar los modelos disponibles para estudiar la biología del músculo esquelético maduro, aquí demostramos la disociación enzimática exitosa de una variedad de músculos de ratón con fibras cortas, intermedias y largas. Estas fibras permiten la demostración de la generalización de la cinética MT-II de los transitorios de Ca2+ en el músculo esquelético. Además, se clasificaron los tipos de fibras en los músculos enteros intactos. Dado que el FDB es el músculo más utilizado para experimentos fisiológico...

El músculo esquelético maduro de los mamíferos es un tejido multifuncional. Regula fuertemente el metabolismo, es la principal fuente de producción de calor y sus propiedades dinámicas le confieren un papel clave en la respiración, el movimiento de segmentos corporales o el desplazamiento de un punto a otro 1,2,3. El músculo esquelético también es relevante para la fisiopatología de muchas enfermedades, incluidas las hereditarias y crónicas, como las miopatías, las distrofias o la sarcopenia, así como muchas afecciones crónicas no musculares, como las enfermedades cardiometabólicas 3,4,5,6,7,8.
El estudio ex vivo de las propiedades estructurales y funcionales del músculo esquelético maduro en el contexto de la salud y la enfermedad ha sido posible principalmente a través de dos modelos experimentales: músculo entero y fibras aisladas. Enel siglo XX, los investigadores explotaron las propiedades de los músculos extensor largo de los dedos (EDL) intactos, el sóleo, el tibial anterior y el gastrocnemio de diferentes especies pequeñas como modelos fundamentales para aprender sobre las unidades motoras, los tipos de fibras y las propiedades dinámicas, como la fuerza y la cinética de contracción yrelajación.16. Sin embargo, el advenimiento de estudios de biología celular más refinados movió el área hacia el estudio de fibras musculares individuales. Un trabajo pionero permitió entonces aislar fibras intactas del flexor corto de los dedos (FDB) de ratas mediante disociación enzimática para su posterior caracterización 17,18,19. Aunque las fibras FDB también pueden obtenerse por disección manual20, la facilidad y el alto rendimiento de la disociación enzimática de los músculos murinos, además de su idoneidad para una variedad de enfoques experimentales, han hecho que este último modelo sea ampliamente utilizado durante las últimas dos décadas.
Las fibras cortas FDB son adecuadas para estudios electrofisiológicos y otros estudios biofísicos, análisis bioquímicos, metabólicos y farmacológicos, experimentos de microscopía electrónica y de fluorescencia, transfección para enfoques de biología celular o como fuente de células madre en estudios de miogénesis 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Sin embargo, el uso exclusivo de fibras FDB en experimentos musculares reduce el alcance de la investigación que se ocupa de los tipos de fibras y limita la cantidad de material biológico disponible para algunas técnicas metodológicas o para obtener más información de un animal. Estas limitaciones dificultan una clara correlación de los fenómenos fisiológicos celulares con estudios bioquímicos y dinámicos previos realizados en diferentes músculos enteros e intactos (por ejemplo, EDL, sóleo, peroneo).
Superando estas limitaciones, algunos grupos lograron disociar los músculos EDL y sóleo más largos 24,33,34,35,36,37,38,39,40, abriendo la puerta a extender aún más el método a otros músculos relevantes. Sin embargo, el uso de EDL y fibras de sóleo es aún escaso, probablemente debido a la falta de detalles metodológicos para obtenerlas como fibras intactas. Aquí, describimos en detalle cómo aislar fibras de diferentes longitudes y tipos de seis músculos: tres de ellos ya descritos (FDB, EDL y sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo [EHL], peroneo largo [PL] y peroneo de los dedos del cuarto [PDQA]). Los resultados del presente trabajo confirman que el modelo de fibras disociadas enzimáticamente es apto para una amplia gama de estudios y futuras correlaciones con datos publicados previamente, aumentando así la disponibilidad de modelos para estudios de músculo esquelético maduro.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Gibco BRL</td><td>15512-015</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Panreac</td><td>141138.1610</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo antimiosina I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4276</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Anticuerpo antimiosina II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8421</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Anticuerpo antimiosina IIA</td><td>American Type Culture Collection</td><td>SC-71</td><td>Anticuerpo primario. Derivado del hibridoma HB-277</td></tr><tr><td>Anticuerpo antimiosina IIB</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>BF-F3-c&nbsp;</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Bis-acrilamida</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Thermo Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Bradford</td><td>Merck</td><td>1.10306.0500</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Carlo Erba</td><td>428658</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato cálcico</td><td>Merck</td><td>102066</td><td></td></tr><tr><td>Dicloruro cálcico (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>2389</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 2</td><td>Worthington</td><td>CLS-2/LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Consul-Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990440</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul brillante R 250&nbsp;</td><td>Merck</td><td>112553</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AMRESCO</td><td>0281</td><td></td></tr><tr><td>Ácido edético (EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>0322</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1423291211</tr><tr><td>Glicina</td><td>Panreac</td><td>151340.1067</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Thermo Scientific</td><td>6765015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AMRESCO</td><td>0511</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AMRESCO</td><td>M136</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4, AM</td><td>Invitrogen</td><td>M14206</td><td>Preparado solo en DMSO. El ácido plurónico no es necesario y no debe usarse para evitar el deterioro de la fibra.</td></tr><tr><td>Mercaptoetanol</td><td>Applichem</td><td>A11080100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Protokimica MP10043</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones</td><td>Varios</td><td></td><td>Varios Para este manuscrito, solo utilizamos ratones C57BL/6. Sin embargo, algunos resultados preliminares han demostrado que el protocolo funciona bien para ratones Swiss Webster de la misma edad y peso.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletano-1,2-diamina (TEMED)</td><td>Promega</td><td>V3161</td><td></td></tr><tr><td>N-bencil-p-tolueno sulfonamida (BTS)</td><td>Tocris</td><td>1870</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto de corte óptimo (OCT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11001</td><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo de sodio</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1323631209</tr><tr><td>TRIS 0,5 M, pH 6,8&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>J832</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>AMRESCO</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AMRESCO</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte>Cámara de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>disección</td><td>Portaobjetos</td> cargados a <td></td><td></td>medida</tr><tr><td></td><td>Erie Scientific</td><td>5951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de baño experimental</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27NE2 Cámara de</td><td>baño estrecha con estimulación de campo, ensamblada sobre una plataforma calefactada PH-6</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338, 500230</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>World Precision Instruments</td><td>Vannas Tijeras 501778</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio</td><td>Varias</td><td></td><td>puntas</td></tr> <tr><td>pulidas al fuegoViales de vidrio con tapón</td><td>Varios</td><td></td><td>Volumen de 2-3 mL</td></tr><tr><td>Tijeras de funcionamiento</td><td>World Precision Instruments</td><td>501223-G</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>SL 8R</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>La cámara digital</td><td>Zeiss</td><td>Erc 5s y Axio 305</td><td>Axio 305, acoplada al estereoscopio Stemi 508, se utilizó para tomar imágenes durante la disección; mientras que Erc 5s o Axio 208, acopladas al microscopio Axio Observer A1, se utilizaron para tomar imágenes de las fibras aisladas y los ensayos</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>de inmunofluorescencia.Microscopio invertido Mini-Protean IV</td><td></td></tr><tr><td>acoplado a fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer A1</td><td>Acoplado a una fuente de luz, filtros y objetivos adecuados para fluorescencia</td></tr><tr><td>Fotomultiplicador</td><td>Horiba</td><td>R928 tubo, Hamamatsu, en un fotómetro D104, Horiba</td><td>Acoplado al puerto lateral del microscopio de fluorescencia</td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador&nbsp;</td><td>Instrumentos de hierba&nbsp;</td><td>S6</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNE-22</td><td></td></tr><tr><td>Xilol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>808691</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software libre para análisis de electroforesis</td> Universidad <td>de Kentucky</td><td>GelBandFitter v1.7</td><td>http://www.gelbandfitter.org</td></tr><tr><td>Software libre para análisis de imágenes y morfometría</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td>ImageJ v1.54</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Software con licencia para la adquisición y análisis de señales Ca2+</td><td>Molecular Devices</td><td>pCLAMP v10.05</td><td>https://www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>Software con licencia para análisis estadísticos y gráficos</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2019</td><td>https://www.originlab.com/</td></tr></tbody></table>

fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Las fibras musculares esqueléticas obtenidas por disociación enzimática de los músculos de ratón son un modelo útil para experimentos fisiológicos. Sin embargo, la mayoría de los trabajos se ocupan de las fibras cortas del flexor corto de los dedos (FDB), lo que restringe el alcance de los resultados relacionados con los tipos de fibras, limita la cantidad de material biológico disponible e impide una conexión clara entre los fenómenos fisiológicos celulares y los conocimientos bioquímicos y dinámicos previos obtenidos en otros músculos.
Este artículo describe cómo obtener fibras intactas de seis músculos con diferentes perfiles y longitudes de tipo de fibra. Utilizando ratones adultos C57BL/6, mostramos el protocolo de disección muscular y aislamiento de fibras y demostramos la idoneidad de las fibras para estudios transitorios de Ca2+ y su caracterización morfométrica. También se presenta la composición de tipo de fibra de los músculos. Cuando se disociaron, todos los músculos quedaron intactos, fibras vivas que se contraen enérgicamente durante más de 24 h. La BDF dio fibras cortas (<1 mm), peroneo corto (PDQA) y peroneo largo (PL) intermedias (1-3 mm), mientras que los músculos extensor largo de los dedos (EDL), extensor largo de los dedos (EHL) y sóleo liberaron fibras largas (3-6 mm).
Cuando se registraron con el colorante rápido Mag-Fluo-4, los transitorios de Ca2+ de las fibras PDQA, PL y EHL mostraron una cinética rápida y estrecha que recuerda a la morfología tipo II (MT-II), que se sabe que corresponde a las fibras tipo IIX y IIB. Esto es consistente con el hecho de que estos músculos tienen más del 90% de fibras tipo II en comparación con FDB (~80%) y sóleo (~65%). Más allá de la FDB, demostramos por primera vez la disociación de varios músculos, que dan lugar a fibras que abarcan un rango de longitudes entre 1 y 6 mm. Estas fibras son viables y dan transitorios rápidos de Ca2+ , lo que indica que el MT-II se puede generalizar a fibras rápidas IIX y IIB, independientemente de su fuente muscular. Estos resultados aumentan la disponibilidad de modelos para estudios de músculo esquelético maduro.

Concentración de Ca2+ sarcoplasmática durante una contracción Para demostrar la viabilidad de los experimentos fisiológicos en el conjunto de fibras disociadas y ampliar nuestros hallazgos previos sobre el acoplamiento excitación-contracción (ECC) y los tipos de fibras, se adquirieron transitorios de Ca2+ en fibras de todos los músculos. En primer lugar, FDB (n = 5) y EDL (n = 7) mostraron una cinética de Ca2+ conocida como morfología tipo II (MT-II). Se trata de señal...

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

En este estudio, describimos un método para aislar fibras de diferentes longitudes y tipos de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones. Además, probamos la idoneidad de las fibras para experimentos fisiológicos relacionados con el estudio del mecanismo de acoplamiento excitación-contracción. Durante años, la obtención de fibras musculares largas fue un desafío, lo que limitó el alcance de muchos estudios en el campo.Ahora demostramos que es posible obtener fibras magras con flexores, extensores y evertores de ratón con longitudes de hasta seis milímetros. A modo de ejemplo, la obtención de fibras de seis músculos diferentes nos ha permitido demostrar que la cinética transitoria del calcio conocida como morfología tipo II, puede generalizarse a tipo IIB y IIX independientemente de la localización o función de su fuente muscular. Creemos que el modelo de fibras aisladas enzimáticamente es adecuado para una variedad de enfoques experimentales con diferentes tipos de tecnologías que nos permiten responder preguntas mecanicistas dentro del rango de la bioquímica, la fisiología, la biofísica, la biología celular y la biología molecular.

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Investigación

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Biología

Myo-mecánico Análisis de músculo esquelético aislado

Se describe un método para medir directamente la fuerza muscular, la fuerza muscular, la cinética de contracción y fatigabilidad de los músculos esqueléticos aislados en...

Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

Este video muestra el aislamiento de miofibras individuales del músculo extensor largo de los dedos murino (EDL) recolectado. Las miofibras aisladas se pueden cultivar para estudiar la actividad de las células madre musculares asociadas a las miofibras.

Aislamiento de miofibras: una técnica para obtener miofibras individuales a partir de músculo extensor largo de los dedos (EDL) de ratón

Presentamos protocolos detallados para realizar experimentos de difracción de rayos X de ángulo pequeño utilizando músculos esqueléticos de ratón intactos. Con la amplia disponibilidad de modelos de ratón transgénicos para enfermedades humanas, esta plataforma experimental puede formar un banco de pruebas útil para esclarecer la base estructural de las enfermedades musculares...

Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

La función del músculo esquelético se puede evaluar cuantificando la contractilidad de las fibras musculares aisladas, tradicionalmente utilizando enfoques laboriosos y de bajo rendimiento. Aquí, describimos un método de alto rendimiento basado en la óptica para cuantificar la contractilidad de las fibras musculares incrustadas en hidrogel. Este enfoque tiene aplicaciones para la detección de fármacos y el desarrollo terapéutico.

Mediciones contráctiles de alto rendimiento de fibras musculares intactas de ratón incrustadas en hidrogel utilizando un sistema basado en óptica

Este protocolo tiene como objetivo aislar y purificar vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético (SkM-EVs) de tejidos musculares de roedores mediante desprendimiento mecánico, disociación enzimática, filtración y ultracentrifugación diferencial. Demuestra consistencia y confiabilidad. Los SkM-EV aislados proporcionan información sobre la homeostasis muscular y las enfermedades, con posibles aplicaciones como biomarcadores de diagnóstico o vehículos terapéuticos.

Aislamiento enzimático de vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Este protocolo describe el aislamiento de fibras musculares individuales intactas del sóleo oxidativo y el establecimiento de cultivos de mioblast altamente purificados derivados de estas fibras. El procedimiento optimizado proporciona de forma fiable aproximadamente 300–500 miofibras intactas por ratón, permitiendo análisis moleculares y celulares posteriores.

Ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras

Aprende a aislar fibras musculares de diferentes longitudes de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones mediante disociación enzimática. Este método permite estudiar la cinética de calcio y el acoplamiento excitación-contracción.

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos (Video) | JoVE Journal

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

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