Name: El ensayo de micronúcleos en sangre entera criopreservada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprende el ensayo de micronúcleos en sangre entera criopreservada para evaluar daño del ADN por radiación ionizante. Este protocolo optimizado permite análisis repetidos sin muestreo adicional en estudios multicéntricos.

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Los autores desean agradecer a L. Pieters, T. Thiron y G. De Smet por su apoyo técnico. Agradecemos a todos los voluntarios que donaron sangre para el estudio. El trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO) en el marco de una subvención (T000118N).

Para este estudio, se recogieron muestras de sangre por venopunción de 30 donantes sanos con edades comprendidas entre los 17 y los 65 años. Se reutilizaron los datos de MN de 20 donantes del artículo de Beyls et al.8 La recogida de las muestras de sangre se realiza de acuerdo con las directrices del Comité de Ética del Hospital Universitario de Gante (número de registro: 2019/1565), Bélgica. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Recogida de muestras de sangre
<ol><li>Antes de comenzar, asegúrese de que se dispone del consentimiento informado por escrito de los participantes y de que se siguen adecuadamente las pautas éticas.</li>
	<li>Recoja la sangre en tubos de heparina de litio y guárdela a temperatura ambiente hasta que esté lista para su procesamiento para la criopreservación.</li>
</ol>2. Criopreservación de sangre total
NOTA: Todos los pasos hasta la recolección celular se realizan asépticamente en un flujo de aire laminar estéril.
<ol><li>Para criopreservar 1 ml de sangre, prepare 1 ml de medio de congelación mezclando 800 μl de suero fetal para terneros (FCS) y 200 μl de dimetilsulfóxido (DMSO). NOTA: El medio de congelación se prepara en un volumen igual a las muestras de sangre que deben congelarse.</li>
	<li>Para la criopreservación de sangre entera, transfiera la muestra de sangre del tubo heparinizado a tubos centrífugos de 15 o 50 ml NOTA: La capacidad del tubo depende del volumen de sangre.</li>
	<li>Agite la sangre a baja velocidad con la adición continua pero gota a gota de un volumen igual de medio de congelación.</li>
	<li>Transfiera 2 ml de mezcla de congelación de sangre a crioviales (2 ml) donde cada alícuota tiene 1 ml de muestra de sangre mezclada con 1 ml de mezcla de congelación.</li>
	<li>Congelación gradual por pasos<ol><li>Transfiera los crioviales a una caja criogénica que contenga isopropanol y colóquelos en un congelador (-80 °C) durante toda la noche.</li>
		<li>Transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su uso a largo plazo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Descongelación de sangre criopreservada
NOTA: Para limitar el tiempo total del proceso de descongelación, se debe manipular un máximo de 8 crioviales (2 ml cada uno) a la vez.
<ol><li>Preparación<ol><li>Precalentar 200 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C antes de descongelar la sangre.</li>
		<li>Preparar una solución de trabajo del medio de cultivo requerido en condiciones estériles. Asegúrese de que el medio por cultivo incluya 1,6 ml de medio completo: medio Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con penicilina/estreptomicina (0,5%), 0,2 ml de FCS, 20 μl de piruvato de sodio y 2 μl de β-mercaptoetanol. NOTA: Dado que se puede perder una cantidad significativa de células sanguíneas durante la descongelación, la sangre descongelada se cultiva en pocillos pequeños como placas de 24 pocillos con un volumen total de 2 ml. Se utiliza una placa multipocillos por dosis.</li>
		<li>Para cada pocillo de cultivo, indique el código del donante y A/B en la tapa junto con la fecha y la dosis, como se sugiere a continuación (Figura 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig01.jpg"> Figura 1: Diseño sugerido de una placa de 24 pocillos para cultivar sangre completa para el ensayo de micronúcleos. Marque los pocillos e indique los códigos de los donantes en los lugares apropiados de la tapa. Para cada muestra de paciente, los pocillos duplicados deben ser adyacentes entre sí. Tenga en cuenta que es un diseño sugerente para un colimador de 10 x 10 y se puede cambiar según el tamaño del colimador o de las muestras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2"><li>Pasos para descongelar y cultivar sangre entera<ol><li>Calentar el baño maría a 37 °C.</li>
		<li>Saque los crioviales necesarios del nitrógeno líquido (el número depende de los requisitos, como el número de dosis). NOTA: Un criovial contiene 1 mL de sangre y 1 mL de medio de congelación. Por lo tanto, se pueden establecer dos cultivos con sangre de un criovial.</li>
		<li>Descongele parcialmente los crioviales en el baño de agua tibia (hasta que aún se vean pequeños cristales de hielo).</li>
		<li>Saque los viales del baño de agua y limpie el exterior de los viales con papel de seda estéril.</li>
		<li>En una campana de flujo de aire laminar estéril, abra los viales muy lentamente para evitar que se derramen las burbujas de aire formadas dentro de los tubos.</li>
		<li>Resuspender el contenido de cada vial y transferirlo individualmente a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL (1 tubo por vial).</li>
		<li>A los tubos respectivos, agregue gota a gota 1 ml de PBS tibio (37 °C) mientras agita suavemente el tubo. Vuelva a suspender con una pipeta P1000.</li>
		<li>Para una dilución y un lavado uniforme, añadir gota a gota 7 ml de PBS precalentado (37 °C) y volver a suspender con una pipeta P1000.</li>
		<li>Centrifugar la sangre durante 8 min a 180 × g (con ajuste en aceleración 1, freno 1) a temperatura ambiente.</li>
		<li>Durante este paso de espera, llene los pocillos vacíos (que no sean aquellos en los que se cultivarán las células) con 500 μL de PBS.</li>
		<li>Vuelva a colocar las placas de pocillos en la incubadora para precalentarlas.</li>
		<li>Una vez finalizada la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 ml para evitar perturbar el gránulo celular.</li>
		<li>Vuelva a suspender el gránulo en el sobrenadante restante con una pipeta P1000.</li>
		<li>Agregue gota a gota 8 ml de PBS tibio (37 °C) en los tubos respectivos mientras agita suavemente los tubos. A continuación, vuelva a suspender con una pipeta P1000.</li>
		<li>Centrifugar la sangre resuspendida durante 8 min a 180 × g (con ajuste a aceleración 9, freno 9).</li>
		<li>Durante este paso de espera, transfiera 200 μL de medio de cultivo a cada uno de los pocillos marcados.</li>
		<li>Mantenga las placas en la incubadora para que permanezcan a 37 °C.</li>
		<li>Después de la centrifugación, retire el sobrenadante con un movimiento continuo (para evitar perturbar el gránulo de células sueltas), pero deje aproximadamente 80 μL del sobrenadante.</li>
		<li>Al gránulo, añadir 280 μL de FCS (temperatura ambiente) y volver a suspender (hasta un volumen total de 360 μL).</li>
		<li>Transferir 180 μL de la suspensión celular a cada pocillo y resuspender (= 0,5 mL de "sangre"/cultivo). El volumen total en cada pocillo es ahora de 380 μL, lo que da como resultado una capa media de 2 mm.</li>
		<li>Incubar las placas en una incubadora de CO2 a 37 °C durante al menos 10 minutos antes de la irradiación.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Ensayo G0 MN
<ol><li>Saque las placas de la incubadora e irradie el cultivo celular con las dosis requeridas, como radiografías de 0,5, 1 y 2 Gy (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) a temperatura ambiente. Utilice muestras irradiadas simuladas como controles para identificar los rendimientos espontáneos de MN.</li>
	<li>Inmediatamente después de la irradiación, añadir 1,62 ml de medio de cultivo (37 °C) a cada pocillo.</li>
	<li>Para estimular la división celular en los linfocitos T, agregue 40 μL de fitohemaglutinina (PHA) a cada pocillo y vuelva a suspender completamente.</li>
	<li>Vuelva a colocar estas placas en la incubadora (5% CO2, 37 °C). NOTA: Esta será la hora de inicio del ensayo.</li>
	<li>Bloquear la citocinesis 23 h después de la estimulación añadiendo 8 μL de citocalasina B (6 μg/mL) por pocillo y resuspender adecuadamente.</li>
	<li>Cosechar los cultivos celulares 70 h después de la estimulación/tiempo de cultivo. Vuelva a suspender y transfiera las células a un tubo de 15 ml. Enjuague cada pocillo con 2 ml de PBS y agregue este PBS al tubo de 15 ml correspondiente.</li>
	<li>Centrifugar los tubos durante 8 min a 180 × g, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante pero deje aproximadamente 500 μL sobre el gránulo.</li>
	<li>Agite el pellet (a toda velocidad) y, durante el vórtice, agregue lentamente gota a gota 2 ml de cloruro de potasio frío (KCl, 4 °C).</li>
	<li>Centrifugar inmediatamente las células a 180 × g durante 8 min.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante, dejando aproximadamente 500 μL del sobrenadante.</li>
	<li>Agite el gránulo (a toda velocidad) y, mientras lo hace en vórtice, agregue lentamente gota a gota 2 ml de fijador frío 1 (solución de metanol / ácido acético / Ringer en una proporción de 4: 1: 5).</li>
	<li>Dejar los tubos de muestra durante la noche a 4 °C (mínimo 12 h y máximo 96 h).</li>
	<li>Centrifugar durante 8 min a 180 × g.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Agite el gránulo (a toda velocidad) y, mientras lo hace, agregue lentamente gota a gota 2 ml de fijador frío 2 (metanol/ácido acético en una proporción de 4:1).</li>
	<li>Centrifugar durante 8 min a 180 × g.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Agite el gránulo (a toda velocidad) y luego agregue lentamente (gota a gota), mientras se agita el vórtice, 2 ml de fijador frío 2 al gránulo.</li>
	<li>Dejar los tubos de muestra a 4 °C (mínimo 12 h y máximo 96 h).</li>
	<li>Limpie los portaobjetos con isopropanol y etiquételos correctamente. NOTA: Utilice pegatinas impresas para etiquetar, ya que la tinta del marcador se limpia fácilmente durante el procesamiento.</li>
	<li>Centrifugar los tubos de muestra durante 8 min a 180 × g.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a otro tubo para concentrar las células de acuerdo con el tamaño del gránulo.</li>
	<li>Vórtice el pellet.</li>
	<li>Deje caer 40 μL de las células fijas en un portaobjetos seco y limpio.</li>
	<li>Deja que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente. Guarde los portaobjetos en una caja o tinte inmediatamente para observarlos.</li>
</ol>5. Tinción de naranja acridina (AO)
<ol><li>Sumerja los portaobjetos en tinte AO durante 1 minuto, seguido de un lavado rápido en el agua destilada, y luego, coloque los portaobjetos en tampón de fosfato (pH 6.8) durante 1 minuto.</li>
	<li>Saque los portaobjetos de la solución tampón y, con papel de seda limpio, seque la parte posterior de los portaobjetos y colóquelos sobre un papel de seda limpio.</li>
	<li>Deje caer 20 μL del tampón de fosfato en la parte superior del portaobjetos y cúbralo suavemente con un cubreobjetos limpio, evitando burbujas de aire.</li>
	<li>Sella estos portaobjetos con cemento de silicona. NOTA: Dado que AO es sensible a la luz y se desvanece con el tiempo, para obtener un buen contraste y fluorescencia, se recomienda marcar los portaobjetos dentro de los 5 días posteriores a la tinción. Guarde siempre los portaobjetos en una cámara frigorífica (4 °C), cuando no los examine.</li>
</ol>6. Puntuación de portaobjetos manchados
<ol><li>Coloque su portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia y examine 1,000 células binucleadas (BN). Recuento manual de MN, que es uno de los seis biomarcadores de toxicidad. Para ello, pida a dos evaluadores independientes que examinen 500 células BN/portaobjetos con el mismo aumento. NOTA: A continuación se presentan algunos aspectos destacados de los criterios de puntuación, según lo recomendado por Fenech para puntuar los portaobjetos teñidos9<ol><li>Seleccione una célula BN buscando células bien redondeadas con citoplasma intacto, con dos núcleos bien distinguidos de aproximadamente el mismo tamaño, forma regular y patrón de tinción. Asegúrese de que el citoplasma de la célula BN se distinga del citoplasma de la célula adyacente.</li>
		<li>Puntúe un MN, señalando que es morfológicamente idéntico pero más pequeño que los núcleos principales; incluso el MN más grande no puede tener más de 1/3 del diámetro de los núcleos principales. Marque un MN solo si no toca los núcleos principales o al menos el límite micronuclear es distinguible del límite de los núcleos principales.</li>
	</ol></li>
</ol>

Examen de los rendimientos de micronúcleos en muestras de sangre entera irradiadas

<ol><li>Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+chromosomal+aberrations+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Results+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors.</a> Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).</li>
<li>Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+cell+death+and+its+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced cell death and its mechanisms.</a> Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+the+human+immune+system%3A+a+bioresource+for+autoimmunity+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis.</a> Cell. 161 (2), 387-403 (2015).</li>
<li>Bankoglu, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+DNA+damage+and+DNA+repair+activity+in+human+blood+samples+in+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay.</a> Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).</li>
<li>Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+cryopreserved+isolated+lymphocytes+for+the+analysis+of+micronuclei+with+the+cytokinesis-block+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method.</a> Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).</li>
<li>Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+on+human+isolated+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Personalized+Medicine%22%5BJournal%5D)">The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells.</a> Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125(2020).</li>
<li>Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserving+whole+blood+for+functional+assays+using+viable+lymphocytes+in+molecular+epidemiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies.</a> Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).</li>
<li>Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+for+cryopreserved+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood.</a> International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li>
<li>Ramachandran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+thawing+of+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+use+in+high-throughput+human+immune+monitoring+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies.</a> Cells. 1 (3), 313-324 (2012).</li>
<li>Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).</li>
<li>Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+lymphocyte+subset+analysis+using+material+from+frozen+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunoassay+and+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood.</a> Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).</li>
<li>Langenskiöld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+blood+cell+subtype+concentrations+from+frozen+whole+blood+samples+using+TruCount+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).</li>
<li>Braudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+and+reliable+whole+blood+freezing+method+for+flow+cytometry+immuno-phenotyping+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).</li>
<li>Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+dosimetry+using+the+micronucleus+assay+for+lymphocytes%3A+interindividual+differences+in+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response.</a> Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).</li>
<li>Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micronucleus+assay+as+a+biological+dosimeter+of+in+vivo+ionising+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).</li>
<li>Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micronucleus+and+G2-phase+assays+for+human+blood+lymphocytes+as+biomarkers+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation%3A+limitations+imposed+by+intraindividual+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability.</a> Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).</li>
<li>Pajic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-individual+variability+in+the+response+of+human+peripheral+blood+lymphocytes+to+ionizing+radiation%3A+comparison+of+the+dicentric+and+micronucleus+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+and+Environmental+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).</li>
<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+inter-laboratory+variation+in+the+scoring+of+micronuclei+and+nucleoplasmic+bridges+in+binucleated+human+lymphocytes%3A+results+of+an+international+slide-scoring+exercise+by+the+HUMN+project%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project.</a> Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).</li>
<li>Miszczyk, J., Rawojć, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+culturing+technique+on+human+peripheral+blood+lymphocytes+response+to+proton+and+X-ray+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El protocolo modificado para la aplicación del ensayo CBMN es una forma relativamente fácil y conveniente de almacenar muestras de sangre a granel. El procedimiento describe todos los detalles minuciosos pero importantes que deben tenerse en cuenta durante la criopreservación y el ensayo CBMN. Otros protocolos de laboratorio normalmente usan un 10% de DMSO en la mezcla de congelación, mientras que nuestra mezcla de congelación contiene un 20% de DMSO junto con un 80% de FCS7. Como esta mezcla de congelación se agrega en volúmenes iguales a la muestra de sangre total, la concentración final también es 10% de DMSO. Para mejorar la tasa de supervivencia celular y estimular la división celular, añadimos piruvato de sodio al 1% y beta-mercaptoetanol al 0,1% al medio de cultivo completo (cRPMI). Esto de acuerdo con el protocolo de cultivo celular establecido por nuestro grupo de investigación 6,8.
Aunque el problema de la aglomeración celular durante la descongelación no pudo resolverse completamente en este protocolo, la segregación celular fue mejor que los otros protocolos convencionales. En lugar de la adición constante y abrupta de medios de cultivo para recuperar las células después de la descongelación, obtuvimos mejores resultados cuando se agregó PBS precalentado (37 °C) gota a gota durante los pasos de lavado. Esta mejora ayuda a reducir el estrés celular y minimiza la aglomeración con una alta recuperación comprobada de células. Además, no se pudo observar una diferencia clara en la viabilidad celular cuando se utilizó PBS sobre RPMI. El grupo ha validado que la duración del período de criopreservación (hasta 1 año) no afectará los rendimientos de MN, tanto en muestras irradiadas como no irradiadas 6,8. Los estudios sugieren que se puede lograr una buena viabilidad celular y proliferación de PBMC con congelación gradual a bajas temperaturas (nitrógeno líquido), seguida de la adición gradual de medio precalentado mientras se descongela10,11. Los investigadores han demostrado que las subpoblaciones de linfocitos T en la sangre total descongelada son comparables a las observadas en las PBMC descongeladas12. Además, está comprobado que los subtipos celulares recuperados de muestras de sangre entera criopreservadas son similares a los observados en muestras de sangre total fresca13,14.
Si examinamos los resultados indicativos obtenidos en el informe, vemos que el aumento cuadrático lineal con la dosis (Figura 3) está de acuerdo con otros informes de la literatura sobre micronúcleos inducidos por transferencia lineal de energía (LET)15,16. La variabilidad en los rendimientos de MN observada en las muestras de sangre total criopreservada (Tabla 1) está en rango con la reportada para los cultivos de sangre total fresca 8,17,18. El protocolo descrito en detalle fue validado en sangre entera fresca y criopreservada de 20 voluntarios sanos8. El índice de división nuclear (NDI), que es un parámetro importante de la proliferación celular observado en ese relato8, estuvo de acuerdo con el sugerido para la sangre total fresca19,20. En conjunto, este protocolo optimizado de criopreservación de sangre total y ensayo de micronúcleos modificados proporciona un mejor rendimiento celular y, por lo tanto, se recomienda la adaptación de este protocolo para las evaluaciones de radiosensibilidad. Dado que la reproducibilidad del protocolo ya ha sido validada8, se sugiere su aplicabilidad en estudios a gran escala y multicéntricos.

Desde su descubrimiento, el uso de la radiación ionizante (IR) ha sido objeto de debate entre los investigadores debido a sus efectos adversos sobre los seres vivos. El efecto perjudicial suele manifestarse por daños en el ADN, como roturas de bicatenario (DSB), y la falta de reparación de estos DSB conduce a aberraciones cromosómicas y mutaciones, que son características importantes del cáncer 1,2. Estas aberraciones cromosómicas pueden examinarse mediante ensayos citogénicos, como el ensayo de micronúcleos de bloque de citocinesis (CBMN). Los micronúcleos son fragmentos cromosómicos rezagados que no pueden incorporarse a los núcleos hijos y, por lo tanto, quedan atrás durante la mitosis.
La CBMN es una técnica citogenética fiable y de uso común para evaluar el daño cromosómico en individuos expuestos a radiación ionizante in vivo o in vitro. En el ensayo CBMN se pueden utilizar células mononucleares de sangre entera fresca o células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMC). La sangre entera fresca es principalmente el material biológico de elección, ya que el aislamiento y el procesamiento de las PBMC pueden llevar mucho tiempo y se acompañan de una pérdida de plasma sérico que actúa como medio de apoyo para la supervivencia y el crecimiento celular. Para lograr un buen rendimiento de células binucleadas, la sangre entera fresca debe procesarse inmediatamente después de la recolección. Sin embargo, la necesidad de un procesamiento inmediato puede ser un desafío logístico durante las limitaciones de tiempo. Además, cuando se supone que muchas muestras deben adquirirse durante un período prolongado o recogerse en puntos alejados de los centros de procesamiento, el almacenamiento de muestras de sangre fresca puede ser un factor limitante 3,4.
Además, para permitir el análisis repetido de MN en el mismo individuo/paciente, sería beneficioso congelar las muestras de sangre. Una forma de almacenar linfocitos para su posterior aplicación del ensayo CBMN es mediante la congelación de PBMCs aisladas 5,6. Esta técnica, sin embargo, requiere varios pasos de procesamiento antes de que los PBMC puedan congelarse. Por lo tanto, la criopreservación de sangre entera representaría una alternativa simple y eficiente en el tiempo a la criopreservación de PBMC aisladas. Se dispone de poca información sobre el uso de sangre entera congelada para ensayos citogenéticos o ensayos que requieren la proliferación de linfocitos. Solo un artículo reporta el uso de sangre entera criopreservada para el análisis de metafase7.
Dado que la criopreservación de sangre total ofrecería muchas ventajas en el campo de la biomonitorización, la biodosimetría y la evaluación de la radiosensibilidad, nuestro grupo optimizó un protocolo de criopreservación de sangre total que permite la aplicación del ensayo CBMN8. Demostramos que los linfocitos presentes en cultivos de sangre total criopreservados conservan su integridad genómica y capacidad de proliferación durante al menos 1 año. En este artículo de métodos, describimos en detalle el procedimiento de criopreservación y el protocolo de ensayo CBMN, que fue optimizado por Beyls et al.8, y reportamos los hallazgos obtenidos para muestras de sangre congelada de 30 individuos sanos. Para el ensayo CBMN, los hemocultivos se irradiaron in vitro con dosis de 0,5, 1 y 2 Gy para evaluar la respuesta de MN en linfocitos de muestras de sangre entera criopreservadas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>placa de suspensión de celdas de 24 pocillos&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2779</td><td></td></tr><tr><td>96% de alcohol</td><td>ChemLab</td><td>CL00.1807.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck ciencias de la vida</td><td>8,18,75,52,500</td><td></td></tr><tr><td>Naranja de acridina</td><td>Merck ciencias de la vida</td><td>235474-5g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck ciencias de la vida</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>631-1365</td><td>22 x 50</td></tr><tr><td>Cryobox (Mr.Frosty)</td><td>Nalgene, Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryovials 2ml</td><td>Novolab</td><td>A04573</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalsin B&nbsp;</td><td>Merck ciencias</td> de la vida <td>C6762-10</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo (DMSO)</td><td>Merck ciencias de la vida</td><td>D4540-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternero (FCS)</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fijador 1</td><td></td><td></td><td>Metanol/ácido acético/ringer en una proporción de 4:1:5</td></tr><tr><td>Fijador 2</td><td></td><td></td><td>Metanol/ácido acético en una proporción de 4:1</td></tr><tr><td>GURR tampón</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>10582013</td><td>tampón de fosfato (pH 6,8)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck ciencias de la vida</td><td>1,04,93,60,250</td><td>75 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck ciencias de la vida</td><td>1,04,87,30,250</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de heparina de litio</td><td>BD Ciencias de la vida</td><td>367526-LH170 U.I.</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>fisher cinitificado</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO2</td><td>Merck ciencias de la vida</td><td>10,65,80,500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck ciencias de la vida</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>VWR</td><td>MENZAA00000112E04</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/mL + 10.000 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>de fitohemaglutinina (PHA-M)</td><td>La solución</td><td></td> Thermo Fischer scientific 10576-015 <td></td></tr><tr><td>Ringer</td><td>contiene NaCl, KCl, CaCl2 disuelto en agua destilada</td>RPMI-1640 Thermo Fischer scientific 52400041 Sellador adhesivo de caucho de silicona collall CF-100 Piruvato de sodio <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>PBS estéril en caliente (37 &deg; C)</td><td></td><td></td><td>contiene NaCl,&nbsp; Na2HPO2, KH2PO4 disuelto en agua destilada</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr></tbody></table>

el ensayo de micronúcleos en sangre entera criopreservada

The Micronucleus Assay on Cryopreserved Whole Blood

El ensayo in vitro de micronúcleos de bloque de citocinesis (CBMN) es una técnica ampliamente utilizada en la investigación radiobiológica, la dosimetría biológica, los estudios de genotoxicidad y las pruebas de radiosensibilidad in vitro . Este método citogenético se basa en la detección de micronúcleos en células binucleadas resultantes de fragmentos cromosómicos rezagados durante la división celular. Las muestras de sangre entera fresca son el tipo de muestra preferido para el ensayo CBMN. Sin embargo, las desventajas de trabajar con muestras de sangre fresca incluyen el procesamiento inmediato después de la extracción de sangre y el número limitado de análisis repetidos que se pueden realizar sin una muestra de sangre adicional. 
Dado que la necesidad de muestras de sangre fresca puede ser un desafío logístico, el ensayo CBMN en muestras de sangre entera criopreservadas sería una gran ventaja, especialmente en estudios de pacientes a gran escala. En este artículo se describe un protocolo para congelar muestras de sangre entera y realizar el ensayo CBMN en estas muestras de sangre congelada. Las muestras de sangre de voluntarios sanos se han congelado y descongelado en diferentes momentos y, a continuación, se han sometido a un protocolo de ensayo de micronúcleos modificado. Los resultados demuestran que este procedimiento optimizado permite la realización del ensayo CBMN en muestras de sangre congelada. El protocolo de criopreservación descrito también puede ser muy útil para otros ensayos citogenéticos y una variedad de ensayos funcionales que requieren linfocitos proliferantes.

Para validar la reproducibilidad del protocolo, se realizó el ensayo MN en muestras de sangre criopreservadas de 30 voluntarios sanos con edades comprendidas entre los 17 y los 65 años. La edad media del grupo es de 35 años. El tiempo de criopreservación osciló entre 1 semana y 154 semanas. Después de exponer el cultivo de células sanguíneas enteras a diferentes dosis de radiación (0,5, 1 y 2 Gy), se examinó bajo un microscopio el rendimiento de micronúcleos en 1.000 células BN. Las células binucleadas bien redondeadas (como se puede ver en la Figura 2) indican una recuperación exitosa de células viables sanas a partir de muestras de sangre entera criopreservadas. Cabe destacar que la respuesta a la radiación de los linfocitos se mantuvo estable después del almacenamiento a largo plazo a temperaturas ultrabajas (nitrógeno líquido). Esta observación está en línea con la respuesta esperada de las muestras de sangre fresca.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig02v2.jpg"> Figura 2: Micronúcleos observados en células binucleadas recuperadas de una muestra de sangre entera congelada que fue criopreservada hace 1 año. (A) Aumento 200x, (B) Aumento 400x; Flechas que apuntan a los MNs. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Con el aumento de las dosis de radiación (0,5, 1 y 2 Gy), se observó un aumento lineal-cuadrático en el rendimiento de micronúcleos (Tabla 1 y Figura 3). Los rendimientos de MN en muestras de control irradiadas simuladas (0 Gy) representan los rendimientos de MN de fondo que son principalmente el resultado de cromosomas rezagados.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Dosis (Gy)</td>
			<td>0</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Promedio</td>
			<td>18</td>
			<td>107</td>
			<td>247</td>
			<td>601</td>
		</tr><tr><td>SD</td>
			<td>10.8</td>
			<td>23.9</td>
			<td>53.3</td>
			<td>101.1</td>
		</tr><tr><td>CV (%)</td>
			<td>59.9</td>
			<td>22.3</td>
			<td>21.6</td>
			<td>16.8</td>
		</tr><tr><td>Gama</td>
			<td>5-41</td>
			<td>62-140</td>
			<td>139-324</td>
			<td>395-755</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Rango y coeficiente de variación junto con el rendimiento promedio de MN, observado en muestras de sangre total criopreservadas de 30 donantes sanos, indicativo de variabilidad interindividual. Abreviaturas: CV = coeficiente de variación; DE = desviación estándar.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig03.jpg"> Figura 3: Rendimientos de micronúcleos observados en muestras de sangre entera control e irradiadas criopreservadas de 30 donantes. Los períodos de criopreservación oscilaron entre 1 semana y 154 semanas. El gráfico de diagrama de dispersión muestra valores individuales. Las líneas de los clústeres representan la media ± la desviación estándar del grupo. Abreviaturas: MN = micronúcleos; BN = binucleado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para investigar la variación interindividual en el rendimiento de MN de las personas, se calculó el coeficiente de variación (CV) (ver Tabla 1). Para la MN inducida por radiación, se obtuvo un CV &lt; 25% para todas las dosis (0,5, 1 y 2 Gy), lo que indica una buena reproducibilidad del protocolo modificado.

Aquí presentamos un protocolo optimizado para el ensayo de micronúcleos de bloques de citocinesis en muestras de sangre entera criopreservadas. Este método optimizado de criopreservación de sangre entera para el análisis de micronúcleos es una técnica fiable para el muestreo a gran escala y los estudios multicéntricos, y también puede utilizarse para otros ensayos relacionados con la sangre.

El ensayo de micronúcleos en sangre entera criopreservada

The in vitro cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay is a widely used technique in radiobiology research, biological dosimetry, genotoxicity studies, ...

Nuestra investigación se centra principalmente en examinar el impacto de la radiación ionizante en los tejidos sanos. Estamos estudiando la radiosensibilidad cromosómica de individuos con cáncer y aquellos con trastornos de reparación del ADN. Además, estamos involucrados en la disimetría biológica, donde evaluamos el daño en el ADN inducido por la exposición a radiaciones ionizantes.Para avanzar en la investigación en nuestro campo, utilizamos sistemas microscópicos automatizados para el análisis de alto rendimiento. Las muestras de sangre entera fresca son el tipo de muestra preferido para el ensayo de micronúcleos, ya que es fácil de obtener con una molestia mínima para el paciente. Sin embargo, la necesidad de un procesamiento inmediato puede ser un desafío logístico durante las limitaciones de tiempo.La congelación de muestras de sangre entera permite repetir el análisis sin necesidad de tomar muestras adicionales. Este procedimiento es una forma fácil y eficiente de almacenar muestras de sangre en estudios a gran escala y multicéntricos. El protocolo de criopreservación de sangre total no solo ofrecerá ventajas para el ensayo de micronúcleos, sino también para otros ensayos citogenéticos o funcionales que requieran la proliferación de linfocitos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Describimos una metodología para el procesamiento de sangre total para obtener una variedad de componentes para su posterior análisis. Hemos optimizado un protocolo simplificado que permite el procesamiento simultáneo rápido y de alto rendimiento de muestras de sangre completa en un entorno no clínico.

Fraccionamiento rápida y aislamiento de componentes de sangre total en las muestras obtenidas a partir de una configuración basada en la comunidad

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El ensayo de micronúcleos en sangre entera criopreservada

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