Name: Procesamiento de tejidos y aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a aislar fibroblastos primarios de tejido vaginal humano mediante digestión mecánica y enzimática. Este protocolo optimizado mejora el rendimiento en muestras postmenopáusicas para investigar el prolapso de órganos pélvicos.

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<ol><li>Mirin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+disparity+in+the+funding+of+diseases+by+the+U.S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Womens+Health%22%5BJournal%5D)">Gender disparity in the funding of diseases by the U.S.</a> J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).</li>
<li>MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+pelvic+floor+disorders+and+their+relationship+to+gender%2C+age%2C+parity%2C+and+mode+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery.</a> BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+show+differential+mechanoresponses+depending+on+surface+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Urogynecol+J+Pelvic+Floor+Dysfunct%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates.</a> Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Rorteau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+chronological+aging+features+in+culture+of+normal+human+dermal+fibroblasts+from+old+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors.</a> Cells. 11 (5), 858(2022).</li>
<li>Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+murine+vaginal+fibroblast+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines.</a> MethodsX. 7, 101100(2020).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((comparative+characterization+of+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+and+without+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+fibroblastic+cells+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+produce+matrices+with+increased+stiffness+and+collagen+content%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content.</a> Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).</li>
<li>Khan, M., Gasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+fibroblast+cultures+from+mouse+ear+and+tail+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues.</a> J Vis Exp. (107), e53565(2016).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+mechanical+loading+influences+the+expression+of+extracellular+matrix+and+cell+adhesion+proteins+in+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).</li>
<li>Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+primary+vaginal+fibroblasts+to+absorbable+and+nonabsorbable+implant+materials+coated+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Female+Pelvic+Med+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma.</a> Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).</li>
<li>Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+risk+factors%2C+and+predictors+of+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse.</a> Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).</li>
<li>Waise, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+isolate+human+fibroblasts+from+tissue+for+ex+vivo+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis.</a> Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).</li>
<li>Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+primary+foreskin+fibroblasts+to+study+cellular+damage+and+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction.</a> Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).</li>
<li>Da Silva Lara, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menopause+Leading+to+Increased+Vaginal+Wall+Thickness+in+Women+with+Genital+Prolapse%3A+Impact+on+Sexual+Response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sex+Med%22%5BJournal%5D)">Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response.</a> J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).</li>
<li>Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oral+epithelial+thickness+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography.</a> Diagnostics. 9 (3), 90(2019).</li>
<li>Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+the+fibroblastic+differon+of+the+dermis%3A+role+in+skin+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Anfotericina B</td><td>Bio Techne</td><td>B23192</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (100 &mu; m)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos (15 mL)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí Desechable de Plumas Nº 15</td><td>Socorex</td><td>FB.15</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Sigma Aldrich NC1983075</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de alta claridad (50 mL)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer Mezclador de muestras</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Humana DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY1918-05</td><td></td></tr><tr><td>Pro-Colágeno Humano I alfa 1 DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY6220-05</td><td></td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05 401 119 001</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (5000U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, poliestireno (100 mm x 20 mm)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (10 mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas estériles (5 mL)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-458</td><td></td></tr></tbody></table>

procesamiento de tejidos y aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana

Tissue Processing and Isolation of Primary Fibroblasts from the Human Vagina

Se recolectó tejido vaginal de 10 donantes independientes sometidas a cirugía de prolapso de órganos pélvicos. Utilizando el protocolo descrito, se aislaron células de tejido vaginal humano. Las poblaciones celulares tenían una apariencia característica alargada, plana y en forma de huso. Al igual que otros estudios, observamos una capacidad de duplicación celular significativamente más lenta y una menor capacidad clonogénica de los fibroblastos con el aumento de la edad del donante. Estas diferencias fueron marcadas al comparar los fibroblastos aislados de individuos mayores (75-78 años) con los aislados de individuos jóvenes (35-47 años). Las células de donantes de mediana edad mostraron un perfil intermedio (56-61 años). Las tasas de proliferación celular se estimaron inicialmente mediante visualización directa utilizando un microscopio de contraste de fase con la misma densidad de siembra conocida.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La Figura 1 muestra una representación esquemática del protocolo de disociación y aislamiento. Siguiendo estos pasos, este protocolo produjo una tasa de éxito del 90% en el aislamiento primario de fibroblastos en nueve de cada diez donantes en un número de células suficiente para permitir el subcultivo de células. La mediana de edad de los donantes fue de 59 años.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Protocolo (Autor, año)</td>
			<td>Tejido del donante del protocolo original</td>
			<td>Número de donantes</td>
			<td>Edad del donante en años</td>
			<td>Fibroblastos obtenidos</td>
			<td>Morfología</td>
		</tr><tr><td>Ruiz-Zapata et al., 2013</td>
			<td>Vagina humana</td>
			<td>3</td>
			<td>56-78</td>
			<td>No</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Khan et al., 2016</td>
			<td>Oreja y cola de ratón</td>
			<td>2</td>
			<td>48-65</td>
			<td>No</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Waise et al., 2019</td>
			<td>Tejido humano</td>
			<td>3</td>
			<td>56-75</td>
			<td>No</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Nadalutti et al., 2020</td>
			<td>Prepucio humano</td>
			<td>1</td>
			<td>65</td>
			<td>No</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Actual</td>
			<td>Vagina humana</td>
			<td>10</td>
			<td>35-79</td>
			<td>Sí</td>
			<td>En forma de husillo</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Comparación de protocolos para el aislamiento exitoso de fibroblastos vaginales humanos. Comparación de los diferentes protocolos existentes con el nuestro y evidenciado por los resultados morfológicos.
En la Tabla 1 se muestran los resultados del uso de otros protocolos para intentar el aislamiento de fibroblastos vaginales en este estudio. Desarrollamos un protocolo estándar para el aislamiento de fibroblastos primarios de la mucosa vaginal y de donantes mayores5.
Probamos varios protocolos establecidos, incluidos los enumerados en la Tabla 1, y no observamos éxito en el aislamiento celular utilizando estos protocolos en nuestro estudio. Proponemos las siguientes razones para sus limitaciones.
El protocolo publicado por Ruiz et al.3 consiste en raspar la fascia y cortar el tejido en trozos pequeños. En nuestra experiencia, es difícil distinguir la fascia, y los intentos de raspado pueden resultar en una reducción significativa en el rendimiento celular. Si bien este método es sencillo, carece de detalles críticos, lo que limita su generalización. Además, la digestión mecánica en este protocolo parece insuficiente para el tejido postmenopáusico, que tiende a ser más denso.
Los protocolos publicados por Khan et al.9 y Waise et al.13 emplean tijeras para el picado de tejidos, que no introducen fuerzas de cizallamiento multidireccionales significativas en comparación con la técnica del bisturí. En nuestra experiencia, el método de las tijeras tampoco funcionó de manera efectiva.
Por último, el protocolo de Nadalutti et al.14 , que utilizó el método del explante, no logró producir fibroblastos en nuestras manos. Este método puede ser menos efectivo debido a la naturaleza del tejido posmenopáusico, que puede requerir un procesamiento mecánico y enzimático más agresivo para disociar los fibroblastos con éxito.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig02.jpg"> Figura 2: Imagen de contraste de fase de las células suspendidas en el día 0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La Figura 2 muestra las celdas suspendidas en el día 0 utilizando nuestro protocolo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig03.jpg"> Figura 3: Imagen de contraste de fase de fibroblastos primarios vaginales en el día 14 de cultivo con un aumento de 100x de una suspensión celular combinada de tres biopsias de tejido de 1cm2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La Figura 3 muestra fibroblastos primarios con un aumento de 100x a partir de una suspensión celular combinada de 3 biopsias de tejido de 1 cm² de dimensiones.
La identidad de los fibroblastos se investigó mediante técnicas de inmunofluorescencia como se describió anteriormente, con modificaciones menores. Para verificar el origen celular de las células vaginales primarias, utilizamos biomarcadores específicos de origen fibroblástico mediante tinción inmunofluorescente. Las células se identificaron como fibroblastos a partir de la tinción positiva de vimentina (Figura 4), F-actina y α-SMA de muestras de tejido premenopáusico y posmenopáusico (Figura 5). Los fibroblastos se cultivaron hasta la expansión con alta viabilidad (&gt;90%) para su uso en experimentos.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig04.jpg"> Figura 4: Tinción positiva de vimentina de fibroblastos vaginales. Los fibroblastos primarios aislados de tejido premenopáusico y postmenopáusico se sometieron a análisis de FI y las imágenes se tomaron con un aumento de 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig05.jpg"> Figura 5: Tinción positiva de F-actina y α-SMA de fibroblastos vaginales. Los resultados de la expresión de proteínas en comparación con el control de IgG. Las imágenes se recogieron con un aumento de 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Procesamiento de tejidos y aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana

Pelvic organ prolapse is a disorder that seriously impacts the quality of life of women. It occurs when muscles and ligaments weaken and cause pelvic ...

tissue-processing-isolation-primary-fibroblasts-from-human

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento y mantenimiento de cultivos primarios de fibroblastos de la piel y el tejido pulmonar de los roedores salvajes.

El establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos de adultos de los roedores

El explante protocolo de cultivo de fibroblastos humanos de biopsias punch de piel es una manera técnicamente robusta y sencilla de obtener células de la piel dentro de 4-8 semanas para la banca de unos 15-20 millones de células en un número bajo pasaje.

Piel biopsia en sacabocados explante cultura para Derivación de fibroblastos humanos primarios

Se presenta un método para aislar precursoras derivadas de la piel (SKP) células multipotentes ingenuos de cultivos de fibroblastos humanos primarios. Se demuestra que estos SKPs derivados de cultivos de fibroblastos comparten propiedades de células madre similares a los obtenidos directamente a partir de biopsias de piel humana. Estas células expresan el marcador de la cresta neural, nestina, además de los marcadores multipotentes, tales como Oct4 y Nanog.

Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y establecer cultivos primarios de fibroblastos/miofibroblastos (MF) a partir de células gástricas, del intestino delgado y de colon congeladas productoras de tejido con un fenotipo MF. Estas células expresan CD90, α-SMA y vimentina. Los MF se pueden utilizar para una variedad de ensayos funcionales, incluida la actividad enzimática y la producción de citocinas.

Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes

Este manuscrito describe un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana. Elude la cultura in vitro que era inevitable con el protocolo de aislamiento de uso común a través de culturas explantes. Los subconjuntos de fibroblastos que emanan son funcionalmente distintos y muestran la expresión génica diferencial y la localización dentro de la dermis.

Aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana mediante la clasificación celular activada por fluorescencia

Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).

Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Este artículo describe un método basado en el cultivo de explantes para el aislamiento y cultivo de células primarias del músculo liso aórtico humano específico del paciente y fibroblastos dérmicos. Además, se presenta un nuevo método para medir la contracción celular y el análisis posterior, que se puede utilizar para estudiar las diferencias específicas del paciente en estas células.

Aislamiento de células primarias del músculo liso aórtico específicas del paciente y mediciones semicuantitativas de contracción en tiempo real in vitro

El estudio de la cicatrización de heridas asociada con la lesión musculoesquelética a menudo requiere la evaluación de las interacciones in vitro entre las células de Schwann (SC), los queratinocitos y los fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de estas células primarias del prepucio humano.

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Este estudio describe un protocolo optimizado para establecer fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides que puedan proporcionar fibroblastos puros y viables de manera efectiva y constante.

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Aprenda a aislar fibroblastos primarios de tejido vaginal humano mediante digestión mecánica y enzimática. Este protocolo optimizado mejora el rendimiento en muestras postmenopáusicas para investigar el prolapso de órganos pélvicos.

Procesamiento de tejidos y aislamiento de fibroblastos primarios de la vagina humana

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