Name: Análisis en tiempo real de la comunicación neuronal intestino-cerebro: dinámica del calcio en toda la corteza en respuesta a la estimulación intestinal de la glucosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende a analizar la comunicación intestino-cerebro mediante inyección intragástrica de glucosa en ratones. Este método revela cambios en la dinámica del calcio cortical y mejora la comprensión de las señales neuronales derivadas del intestino.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ochanomizu, Japón (protocolos de estudio en animales 2017). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices para la experimentación con animales de la Universidad de Ochanomizu que se ajustan a las Directrices Fundamentales para la Realización Adecuada de Experimentos con Animales y Actividades Relacionadas en Instituciones Académicas de Investigación (Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón). Se tomaron medidas para minimizar el número de animales utilizados. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE.
1. Preparación de ratones transgénicos
<ol>
	<li>Para seguir este experimento, utilice la línea de ratones transgénicos BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 machos y hembras adultos, es decir, G7NG817 ratones24,25 (mayores de 8 semanas). La cepa de fondo de G7NG817 ratones25 es C57BL/6J.</li>
	<li>Aloje a los ratones en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h / 12 h y críalos en grupos de hasta cinco ratones.</li>
</ol>
2. Creación de catéteres
<ol>
	<li>Utilice unas tijeras para ajustar el tubo de silicona (diámetro interior de 0,5 mm, diámetro exterior de 1,0 mm) a una longitud precisa de 7 cm (Figura 1A-a). NOTA: Antes de los procedimientos, se esterilizaron las tijeras y el tubo de silicona.</li>
	<li>Adherir diminutas perlas de plástico (diámetro interior 3 mm, diámetro exterior 5 mm) al tubo a medida, asegurándose de que estén situadas a 3 mm de su extremo (Figura 1A-b). Fije las cuentas de forma segura con pegamento de cianoacrilato (se aceptan variantes médicas o estándar).</li>
	<li>Extraer el ápice de una aguja de 23 G y posteriormente cortar a 1,5 cm de la punta de la aguja (Figura 1A-c).</li>
	<li>Introduzca la aguja seccionada de 23 G del paso 2.3 en la extremidad del tubo de silicona, opuesta a donde se fijaron las cuentas (Figura 1A-d).</li>
</ol>
3. Creación de inyectores
<ol>
	<li>Utilice alicates estériles para extirpar a 1 cm de la punta de la aguja (Figura 1B-a). NOTA: Asegúrese de que el orificio en el extremo cortado conserve su integridad y no se deforme, ya que cualquier distorsión podría obstruir el flujo de la solución de inyección.</li>
	<li>Acople la aguja de inyección de 23 g adaptada del paso 3.1.1 a una jeringa de 2,5 ml (figura 1B-b).</li>
	<li>Segmente un tubo de silicona a la longitud requerida (un tubo de silicona de 15 cm en este experimento) y colóquelo sobre la aguja de inyección de 23 G (Figura 1B-c). NOTA: El volumen de solución dispensada fluctuará según la longitud del tubo. Por ejemplo, con un tubo de 15 cm, aproximadamente 50 μL de solución permanecerán después del experimento.</li>
	<li>Corte la aguja de inyección de 23 g a 1,5 cm de la punta de la aguja.</li>
	<li>Unir la porción seccionada del paso 3.4 con el catéter de silicona diseñado en el paso 3.3 (Figura 1B-d). NOTA: Asegúrese de que los orificios creados en los pasos 3.1 y 3.4 permanezcan sin distorsiones después de la incisión. Si es necesaria una rectificación, emplee alicates para restaurar su configuración circular.</li>
</ol>
4. Localización gástrica
<ol>
	<li>Administrar anestesia al ratón mediante inhalación de isoflurano al 3,0% en una cámara específica. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad ocular.</li>
	<li>Transfiera delicadamente el ratón anestesiado de la cámara de inhalación a la mesa quirúrgica después de verificar el estado anestesiado del ratón. Proporcionar soporte térmico durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Coloque al ratón en decúbito supino, alineando su boca cerca del aparato de inhalación, y module la concentración de isoflurano de 3,0% a 2,0%. NOTA: Desenganche el segmento inferior de la mascarilla de isoflurano de su contraparte superior y ancle la mascarilla separada (segmento superior) a la mesa quirúrgica con cinta adhesiva.</li>
	<li>Complemente la cavidad oral, las extremidades anteriores y las extremidades traseras del ratón con cinta adhesiva. NOTA: Al fijar el ratón a la mesa, se pueden prevenir los errores quirúrgicos debidos al movimiento incluso si el ratón está anestesiado.</li>
	<li>Retire el pelo del ratón de la parte superior izquierda del abdomen (150% del área alrededor del sitio quirúrgico) usando crema depilatoria. Aplique un analgésico local por vía tópica en el sitio de la cirugía y espere 5 minutos antes de continuar.</li>
	<li>Aplique un gel anestésico local en la piel abdominal y espere de 5 a 10 minutos. Luego, desinfecte el área quirúrgica 3 veces con rondas alternas de yodoforo y etanol al 70%. Confirme la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie y cubra al animal con paños quirúrgicos estériles. Realice una incisión en la piel de aproximadamente 1,5 cm de longitud (Figura 1C-b), situada 1 cm a la derecha de la mediana abdominal y 5 mm por debajo de la apófisis xifoides (Figura 1C-c). A continuación, realiza una incisión de 1,5 cm en la pared abdominal en el mismo lugar que la incisión cutánea inicial. NOTA: Tenga cuidado para evitar infligir daño al hígado subyacente.</li>
	<li>Reposicione delicadamente el lóbulo hepático izquierdo lateralmente con pinzas de punta roma, revelando el estómago que se encuentra debajo.</li>
</ol>
5. Inserción del catéter
<ol>
	<li>Eleve el estómago y sáquelo con cuidado a través de la incisión. NOTA: Ejerza el máximo cuidado para preservar la integridad de los órganos adyacentes, especialmente el hígado, y absténgase de ejercer una fuerza indebida sobre el estómago.</li>
	<li>Utiliza unas tijeras para crear una perforación diminuta (de aproximadamente 1,5 mm de diámetro) en el antro pilórico.</li>
	<li>Introduzca el extremo del catéter en la perforación, asegurándose de que la perla esté en contacto directo con el antro pilórico. NOTA: El catéter se desinfecta con una solución de gluconato de clorhexidina al 0,1 a 0,5% antes de la inserción.</li>
	<li>Adhiera la perla del catéter al estómago empleando pegamento de cianoacrilato de grado médico. NOTA: Asegúrese de que el estómago permanezca libre de los órganos circundantes.</li>
	<li>Verifique la fijación firme del catéter al estómago, luego vuelva a colocar delicadamente el estómago en su ubicación innata debajo del lóbulo hepático izquierdo.</li>
	<li>Suturar la pared abdominal, permitiendo que el catéter se extienda externamente, utilizando una sutura de polidioxanona (PDS). Después de eso, cierre la incisión cutánea de manera análoga al cierre abdominal.</li>
	<li>Vuelva a colocar suavemente el ratón en una jaula desinfectada. NOTA: Los ratones postoperatorios deben estar alojados individualmente. Aplique un analgésico local por vía tópica sobre el cierre de la herida y siga los planes analgésicos recomendados por las directrices institucionales locales.</li>
	<li>Permita un período mínimo de recuperación de 48 h en un entorno estándar. NOTA: Un extremo del catéter insertado en el estómago del ratón se cierra con una aguja de 23G con una punta sellada para evitar la entrada de sustancias extrañas y evitar mordeduras. Dado que el catéter que sobresale del abdomen es corto, evita que el ratón lo arrastre a través de la ropa de cama, lo que podría hacer que se abra o se enrede.</li>
</ol>
6. Preparación para la obtención de imágenes transcraneales in vivo de Ca2+
<ol>
	<li>Administrar anestesia al ratón con isoflurano (inducción al 2%; mantenimiento entre 0,8% y 1,0%).</li>
	<li>Asegure el mouse a una plataforma estereotáxica usando barras auxiliares para los oídos para mitigar los efectos de la pulsación y la respiración. A continuación, coloque el ratón bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia.</li>
	<li>Emplee un conjunto de filtros de fluorescencia azul de banda ancha (con excitación a 460-490 nm y emisión a 520 nm) junto con una fuente de luz de mercurio.</li>
	<li>Capture las imágenes con una cámara y procéselas con el software de imágenes designado.</li>
	<li>Retire con cuidado el vello del cuero cabelludo con una afeitadora eléctrica o una crema depilatoria. NOTA: Si usa una maquinilla de afeitar, asegúrese de que esté completamente desinfectada y tenga cuidado de no cortar la piel.</li>
	<li>Desinfecte la superficie del cuero cabelludo con un bastoncillo de algodón o una herramienta similar con una solución de gluconato de clorhexidina diluida al 0,1-0,5%. A continuación, desinfecte con alcohol y repita esto alternando rondas 3 veces.</li>
	<li>Aplique un gel anestésico local y espere de 5 a 10 minutos.</li>
	<li>Prepárese para aplicar el cemento acrílico dental.<ol>
		<li>Use una hoja de bisturí estéril para cortar el cuero cabelludo. Retira completamente el cuero cabelludo o haz un corte recto desde la parte posterior de la cabeza hasta la frente.</li>
		<li>Use clips para exponer el cráneo extendiendo el exceso de piel.</li>
		<li>Use un hisopo de algodón para extraer el tejido conectivo del periostio.</li>
		<li>Aplique inmediatamente el cemento acrílico después de eliminar el periostio. Actúe rápidamente para evitar que la superficie del cráneo se vuelva opaca debido a la evaporación del hueso expuesto.</li>
		<li>Espere unos 5 minutos para que el cemento se seque.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Imagen transcraneal de Ca2+ con administración de glucosa intraduodenal
<ol>
	<li>Equilibrar tanto la solución experimental como la solución salina a temperatura ambiente. Someta a los ratones a una restricción dietética durante un período específico (por ejemplo, 2 h).</li>
	<li>Purgue cualquier contenido residual dentro del catéter del lado del ratón usando ~ 0.03 mL de solución salina antes de iniciar la inyección.</li>
	<li>Aspire la solución experimental (por ejemplo, una solución de glucosa al 10% preparada en 300 μL de agua, complementada con 300 μL adicionales de agua) en la jeringa, luego conéctela al catéter. Determinar la dosis óptima de la solución adaptada al objetivo experimental específico. NOTA: Durante esta fase, tenga cuidado para evitar una tensión excesiva en el catéter, lo que podría poner en peligro la anatomía interna del ratón. Esfuérzate por manipular el tubo del lado del ratón con la máxima delicadeza. Además, asegúrese de que la jeringa permanezca desprovista de aspiración de aire después de la solución, ya que el aire atrapado y las burbujas podrían inducir distensión gastrointestinal.</li>
	<li>Evalúe el estado fisiológico del ratón y active la función de grabación del software de imagen haciendo clic en el botón de proceso de grabación de la aplicación de software.</li>
	<li>Captura imágenes con una resolución de 512 x 512 píxeles, una profundidad de 16 bits y una velocidad de fotogramas de 10 Hz. NOTA: Los parámetros de registro se pueden ajustar para alinearlos con los requisitos experimentales específicos.</li>
	<li>Adquisición de datos espontáneos (por ejemplo, que abarquen 50 s), seguidos de la infusión gradual de la solución experimental a una velocidad adaptada al experimento (en este caso, 0,035 mL/s). NOTA: Al final del experimento, el ratón será sacrificado de inmediato por dislocación cervical bajo anestesia con isoflurano.</li>
</ol>
8. Procesamiento y análisis de datos de imágenes
<ol>
	<li>Agrupe los datos de la imagen en 64 x 64 píxeles.</li>
	<li>Determine las regiones de interés (ROI) dibujadas a mano con ImageJ. Consulte el atlas del cerebro del ratón para designar las ROI como el área frontal (M2), el área somatosensorial que incluye el barril (Somato), el área occipital (visual) y la región retroesplenial (RSC).</li>
	<li>Utilice la función ReadImageJROI de MATLAB para extraer las coordenadas correspondientes a los ROI. Acceda a la función de MATLAB a través del enlace proporcionado: https://jp.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/32479-readimagejroi</li>
	<li>Calcule la tasa media de cambio en la intensidad de la fluorescencia dentro del ROI mediante MATLAB.<ol>
		<li>Defina la tasa de cambio de intensidad de fluorescencia (ΔF/F) con la ecuación (1): 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65902/65902eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) Donde Ft representa el valor de intensidad de fluorescencia en un momento específico y el valor medio de la intensidad desde el inicio del registro hasta 50 s después de la inyección se denota como F0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tenga en cuenta la demora en que la solución inyectable llegue al órgano. Utilice el valor de intensidad promedio que abarca los tres segundos posteriores a la inyección como referencia. Formas de onda objetivo que superan el valor de intensidad de referencia + 1 SD para el análisis si se producen 3 s o más después de la inyección.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Estudio de la interacción intestino-cerebro a través de imágenes transcraneales de calcio en ratones

<ol><li>Buchanan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preference+for+sugar+over+sweetener+depends+on+a+gut+sensor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell.</a> Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).</li>
<li>Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+nutrient+detection+by+incretin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dairy+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying nutrient detection by incretin-secreting cells.</a> International Dairy Journal. 20 (4), 236-242 (2010).</li>
<li>Kreuch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+mechanisms+linking+intestinal+sweet+sensing+to+glycemic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gut mechanisms linking intestinal sweet sensing to glycemic control.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 741(2018).</li>
<li>Gorboulev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29-D-glucose+cotransporter+SGLT1+is+pivotal+for+intestinal+glucose+absorption+and+glucose-dependent+incretin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Na(+)-D-glucose cotransporter SGLT1 is pivotal for intestinal glucose absorption and glucose-dependent incretin secretion.</a> Diabetes. 61 (1), 187-196 (2012).</li>
<li>Harada, N., Inagaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+sodium-glucose+transporters+in+glucose+uptake+of+the+intestine+and+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Investigation%22%5BJournal%5D)">Role of sodium-glucose transporters in glucose uptake of the intestine and kidney.</a> Journal of Diabetes Investigation. 3 (4), 352-353 (2012).</li>
<li>Kaelberer, M. M., Rupprecht, L. E., Liu, W. W., Weng, P., Bohórquez, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropod+cells%3A+The+emerging+biology+of+gut-brain+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuropod cells: The emerging biology of gut-brain sensory transduction.</a> Annual Review of Neuroscience. 43, 337-353 (2020).</li>
<li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li>
<li>Larsen, P. J., Tang-Christensen, M., Jessop, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+administration+of+glucagon-like+peptide-1+activates+hypothalamic+neuroendocrine+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Central administration of glucagon-like peptide-1 activates hypothalamic neuroendocrine neurons in the rat.</a> Endocrinology. 138 (10), 4445-4455 (1997).</li>
<li>Alhadeff, A. L., Rupprecht, L. E., Hayes, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+neurons+in+the+nucleus+of+the+solitary+tract+project+directly+to+the+ventral+tegmental+area+and+nucleus+accumbens+to+control+for+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">GLP-1 neurons in the nucleus of the solitary tract project directly to the ventral tegmental area and nucleus accumbens to control for food intake.</a> Endocrinology. 153 (2), 647-658 (2012).</li>
<li>Raybould, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+chemosensing%3A+interactions+between+gut+endocrine+cells+and+visceral+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+%26+Clinical%22%5BJournal%5D)">Gut chemosensing: interactions between gut endocrine cells and visceral afferents.</a> Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 41-46 (2010).</li>
<li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+neurons%3A+are+they+physiologically+relevant%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant.</a> Physiology & Behavior. 76 (3), 403-413 (2002).</li>
<li>Secher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arcuate+nucleus+mediates+GLP-1+receptor+agonist+liraglutide-dependent+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The arcuate nucleus mediates GLP-1 receptor agonist liraglutide-dependent weight loss.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4473-4488 (2014).</li>
<li>Williams, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neurons+that+detect+stretch+and+nutrients+in+the+digestive+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system.</a> Cell. 166 (1), 209-221 (2016).</li>
<li>Borgmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-brain+communication+by+distinct+sensory+neurons+differently+controls+feeding+and+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Gut-brain communication by distinct sensory neurons differently controls feeding and glucose metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (7), 1466-1482.e7 (2021).</li>
<li>Krashes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+reversible+activation+of+AgRP+neurons+drives+feeding+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).</li>
<li>Aponte, Y., Atasoy, D., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGRP+neurons+are+sufficient+to+orchestrate+feeding+behavior+rapidly+and+without+training%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AGRP neurons are sufficient to orchestrate feeding behavior rapidly and without training.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 351-355 (2011).</li>
<li>Zhang, L., Han, W., Lin, C., Li, F., de Araujo, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+metabolism+regulates+flavor+preferences+and+portal+glucose+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Integrative+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sugar metabolism regulates flavor preferences and portal glucose sensing.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 12, 57(2018).</li>
<li>Goldstein,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+detection+of+macronutrients+via+multiple+gut-brain+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic detection of macronutrients via multiple gut-brain pathways.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 676-687.e5 (2021).</li>
<li>Fernandes, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postingestive+modulation+of+food+seeking+depends+on+vagus-mediated+dopamine+neuron+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postingestive modulation of food seeking depends on vagus-mediated dopamine neuron activity.</a> Neuron. 106 (5), 778-788.e6 (2020).</li>
<li>Kaelberer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaelberer%2C+MM+%22A+gut-brain+neural+circuit+for+nutrient+sensory+transduction%22">A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction</a>. 361 (6408), Science. New York, N.Y. eaat5236(2018).</li>
<li>Bohórquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+circuit+formed+by+innervation+of+sensory+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 782-786 (2015).</li>
<li>Tan, H. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+mapping+of+the+direct+inputs+and+axonal+projections+of+POMC+and+AgRP+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whole-brain mapping of the direct inputs and axonal projections of POMC and AgRP neurons.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 9, 40(2015).</li>
<li>Yamada, S., Wang, Y., Monai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+cortex-wide+Ca2%2B+imaging+for+the+functional+mapping+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcranial cortex-wide Ca2+ imaging for the functional mapping of cortical dynamics.</a> Frontiers in Neuroscience. 17, 1119793(2023).</li>
<li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7 (1), 11100(2016).</li>
<li>Ferron, J. -F., Kroeger, D., Chever, O., Amzica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Inhibition+during+Burst+Suppression+Induced+with+Isoflurane+Anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical Inhibition during Burst Suppression Induced with Isoflurane Anesthesia.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (31), 9850-9860 (2009).</li>
<li>Ming, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane-induced+burst+suppression+is+a+thalamus-modulated%2C+focal-Onset+rhythm+with+persistent+local+asynchrony+and+variable+propagation+patterns+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isoflurane-induced burst suppression is a thalamus-modulated, focal-Onset rhythm with persistent local asynchrony and variable propagation patterns in rats.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 14, 599781(2021).</li>
<li>Schwalm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+states+shape+the+spatiotemporal+representation+of+local+and+cortex-wide+neural+activity+in+mouse+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional states shape the spatiotemporal representation of local and cortex-wide neural activity in mouse sensory cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 128 (4), 763-777 (2022).</li>
<li>Ueno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intragastric+infusion+%28iG%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse intragastric infusion (iG) model.</a> Nature Protocols. 7 (4), 771-781 (2012).</li>
<li>Zukerman, S., Ackroff, K., Sclafani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-oral+glucose+stimulation+of+intake+and+conditioned+flavor+preference+in+C57BL%2F6J+mice%3A+A+concentration-response+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Post-oral glucose stimulation of intake and conditioned flavor preference in C57BL/6J mice: A concentration-response study.</a> Physiology & Behavior. 109, 33-41 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,5 mL jeringa TERUMO TERUMO</td><td></td><td>ss-02Sz</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de inyección de 23 G</td><td>TERUMO</td><td>4987350390691</td><td></td></tr><tr><td>Anestésico (solución de inhalación de isoflurano)</td><td>viatris</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>bastoncillo</td><td></td><td></td> de algodón empresa <td>local</td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato (AronArufa A)</td><td>TOAGOSEI</td><td>7990700Q1022</td><td></td></tr><tr><td>dental cemento acrílico C& B&nbsp;</td><td>Sun Medical&nbsp;</td><td>221AABZX00115000</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Kracie</td><td></td><td>empresa local</td></tr><tr><td>Cámara digital CMOS&nbsp;</td><td>Hamamatsu Fotónica&nbsp;</td><td>ORCA-Spark</td><td></td></tr><tr><td>Barra de orejas</td><td>NARISHIGE</td><td>EB-5N</td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros (U-MWB2)</td><td>Evidente</td><td>U-MWB2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Fine Dcience Tools</td><td>14040-10</td><td></td></tr><tr><td>G7NG817 ratones</td><td>RIKEN BRC</td><td>RBRC09650</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen</td><td>Hamamatsu Photonics&nbsp;</td><td>HC Software de</td><td></td>imagen</tr><tr><td>Vapolizer de isoflurano</td><td>shinanoseisakusyo</td><td>SN-487-0T Fuente</td><td></td>de</tr><tr><td>luz (U-HGLGPS)</td>Microscopía <td>U-HGLGPS</td> <td>evidente</td> (MVX10)Perlas de plástico evidentes <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(diámetro interior 3 mm, diámetro exterior 5 mm)</td><td></td><td></td><td>empresa local</td></tr><tr><td>Alicates</td><td></td><td></td> empresa <td>local</td></tr><tr><td>Sutura de polidioxanona, monodiox</td><td>Alfresa Pharma</td><td>HR1305MV45-KF2R</td><td>Esta sutura de PDS monofilamento absorbible se emplea para cerrar la incisión quirúrgica</td></tr><tr><td>Pinzas de punta redonda</td><td>F.S.T.&nbsp;</td><td>11617-12</td><td></td></tr><tr><td>solución salina</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory</td><td>35061311</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona (diámetro interior 0,5 mm, diámetro exterior 1,0 mm)</td><td>AS ONE&nbsp; CORPORATIO</td><td>33151413</td><td>pequeña aguja</td></tr><tr><td>de cirugía de la</td> empresa local <td>Natsume Seisakusho Co., Ltd.</td><td></td><td></td>AC03DNT</tr><tr><td>Etapa estereotáxica</td><td>NARISHIGE</td><td>MA-6N</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine Jelly 2%</td><td>Sandoz K.K.</td><td>614429303</td><td>Esta jalea se utiliza como analgésico local para aliviar el dolor quirúrgico</td></tr></tbody></table>

análisis en tiempo real de la comunicación neuronal intestino-cerebro: dinámica del calcio en toda la corteza en respuesta a la estimulación intestinal de la glucosa

Real-time Analysis of Gut-brain Neural Communication: Cortex wide Calcium Dynamics in Response to Intestinal Glucose Stimulation

Obtención de imágenes de Ca2+ ancho de la corteza transcraneal con un ratón G7NG817 anestesiado con isoflurano Creamos el catéter siguiendo el procedimiento que se ilustra en la Figura 1. Después de identificar cuidadosamente la posición del estómago, conectamos el catéter a esa ubicación (Figura 1). Después de permitir un tiempo de recuperación suficiente después de la inserción del catéter (aproximadamente 48 h), medimos la actividad neuronal espontánea bajo anestesia leve con isoflurano (0,8-1,0%) para establecer los cambios basales en la intensidad de la fluorescencia para las observaciones posteriores de estimulación intestinal. Como resultado, confirmamos los patrones aleatorios de oscilación de Ca2+ que abarcaban toda la corteza (Figura 2A). En la figura 2 se presentan ejemplos representativos de actividad cerebral espontánea, con los catéteres insertados previamente. Definimos el tiempo del primer pico transitorio observable de Ca2+ en la región M2 después de la inyección como 0,0 s. La representación de pseudo color mostraba el pico de este transitorio Ca2+ como el valor máximo, con el valor medio más una desviación estándar (1 SD) como valor mínimo. Estaba claro que los hemisferios izquierdo y derecho mostraban actividad sincrónica en todas las regiones.
A continuación, establecimos ROIs para caracterizar las ondas dentro de cada área funcional. Como se muestra en la Figura 2B, presentamos los cambios temporales en la tasa de intensidad de fluorescencia para cada ROI (Figura 2B). Estas oscilaciones superficiales observadas de Ca2+ en la superficie siguieron un patrón de supresión de ráfagas, alternando entre períodos de baja actividad y cambios de fluorescencia de alta amplitud. Este patrón de actividad se alinea con hallazgos previos que midieron simultáneamente el EEG de superficie cortical y la dinámica de Ca2+ 26.
A pesar de las fluctuaciones globales o regionales de Ca2+ en la superficie entre los estados de supresión y estallido, la región cortical específica que inicia el aumento de calcio puede diferir. Como se informó anteriormente, cuando una señal estimula una región cortical local, se espera que el área se active, lo que posteriormente impulsará un cambio global en el estado cortical27,28.
Cambios en la dinámica de la corteza Ca2+ después de la inyección intragástrica de glucosa A continuación, para dilucidar cómo la administración de glucosa o agua influye en la actividad cortical, monitorizamos la dinámica del Ca2+ en toda la corteza durante y después de la inyección. Como resultado, encontramos alteraciones en la dinámica cortical de Ca2+ tras la inyección intragástrica de glucosa. En contraste con la actividad espontánea ilustrada en diversas regiones de activación cortical, observamos una activación inmediata en el área prefrontal o en la corteza motora secundaria (M2) tras la inyección directa de glucosa en el intestino a través del catéter, efecto no inducido por la inyección de agua intragástrica (Figura 3A-C). Además, observamos que estos eventos transitorios y prominentes de Ca2+ tendían a ocurrir de forma continua durante aproximadamente 10 s después de la inyección de glucosa intragástrica. Tales fenómenos persistentes no eran evidentes cuando se administraba agua (Figura 3D-F).
Los eventos de Ca2+ en cada ROI se caracterizaron calculando la relación de cambio de intensidad de fluorescencia, utilizando la corteza auditiva (Referencia) como referencia, en el primer pico que ocurre dentro de los 4-8 s posteriores a la finalización de la administración de glucosa. Como resultado, se observó un cambio significativo cuando se inyectó glucosa después de comparar la respuesta en la región M2 utilizando la corteza auditiva como referencia antes y después de la inyección.
En contraste, no se observó tal cambio cuando se inyectó agua (Figura 3G, agua N = 7: antes vs. inyección, 2.38 ± 2.53 vs. 2.05 ± 1.84, p &gt; 0.05; glucosa N = 7: antes vs. inyección, 2.48 ± 0.97 vs. 3.76 ± 2.76, p &lt; 0.01, prueba de Wilcoxon con señas). A continuación, definiendo los niveles de activación en cada región cortical por la relación entre el valor de después de la inyección y antes de la inyección, se observó una diferencia significativa solo en la región M2 (Figura 3H, M2: 0,92 ± 0,89 vs. 1,30 ± 0,32, p = 0,006; Somato: 0,95 ± 0,076 vs. 1,04 ± 0,13, p = 0,27; Visuales: 0,92 ± 0,3 vs. 1,00 ± 0,06, p = 0,89; RSC: 0,97 ± 0,27 vs. 1,10 ± 0,27, p = 0,60 , t-test).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig01.jpg"> 
Figura 1: Descripción general del método. (A) Creación del catéter: (a) Corte el tubo de silicona. (b) Fije una cuenta de plástico al tubo de silicona con pegamento médico de cianoacrilato. (c) Corta la aguja de 23 G a 1,5 cm de la punta. (d) Fije el extremo cortado de la aguja al tubo de silicona. (B) Conjunto del inyector: (a) Recorte una aguja de inyección de 23 G 1 cm. (b) Conecte la aguja de inyección recortada a una jeringa de 2,5 mL. (c) Envainar la sección cortada de la aguja de inyección con un tubo de silicona. (d) Corta la aguja de 23 G a 1,5 cm de la punta. (e) Fije el extremo cortado de la aguja al tubo de silicona. (C) Procedimiento quirúrgico: (a) Depilar el área quirúrgica. (b) Incidir la piel y la pared abdominal hasta una longitud aproximada de 1,5 cm. (c) Hacer una pequeña perforación (alrededor de 1,5 mm de diámetro) en el antro pilórico con unas tijeras e insertar el catéter (tubo de silicona). Asegure el catéter al antro pilórico con pegamento médico de cianoacrilato. (d) Coser la pared abdominal y la piel con material de sutura de seda 5/0 y aguja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig02.jpg"> 
Figura 2: Oscilaciones espontáneas de Ca2+ en G7NG817 ratones con un catéter conectado. (A) Un ejemplo representativo de oscilaciones de Ca2+ en la corteza ancha mostradas a intervalos de 0,2 s. Los cambios en la intensidad de la fluorescencia se representan con una pseudo superposición de color. La ventana de tiempo rodeada por la línea discontinua en B muestra el primer transitorio Ca2+ que aparece, con su pico establecido como tiempo 0. La representación de pseudo color utiliza el pico de ese transitorio Ca2+ como valor máximo y la media +1 SD como valor mínimo. (B) Cambios de series temporales en la intensidad de la fluorescencia para cada ROI en el ejemplo. Los colores de las líneas corresponden a diferentes áreas corticales: el rojo representa M2; el magenta representa el área somatosensorial (Somato); el azul representa el área visual (Visual); y el verde representa la región retro esplenial. La tira de color salmón muestra el tiempo de inyección. (C) Un solo pico dentro del contorno discontinuo se aísla y se muestra en una vista ampliada. Abreviaturas: DE = desviación estándar; ROI = región de interés; RSC = región retro esplenial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig03.jpg"> 
Figura 3: Respuesta de la corteza ancha Ca2+ durante/después de la inyección de glucosa o agua. (A) Un ejemplo representativo de administración de glucosa mostrado a intervalos de 0,2 s. Los cambios en la intensidad de la fluorescencia se representan con una pseudo superposición de color. La ventana de tiempo rodeada por la línea discontinua en B muestra el primer transitorio Ca2+ que aparece después de la inyección, con su pico establecido como tiempo 0. La representación del pseudo color se basa en el pico del primer transitorio de Ca2+ después de la inyección como valor máximo y la media +1 SD como valor mínimo. (B) Cambios en series temporales de la intensidad de la fluorescencia para cada ROI en el ejemplo. Los colores de las líneas corresponden a diferentes áreas corticales: el rojo representa M2, el magenta representa el área somatosensorial (Somato), el azul representa el área visual (Visual) y el verde representa la región retroesplenial. (C) Un solo pico dentro del contorno discontinuo se aísla y se muestra en una vista ampliada. La onda de calcio objetivo es la onda más temprana que apareció dentro de los 4-8 segundos posteriores a la inyección. (D) Un ejemplo representativo de inyección de agua como datos de control de glucosa. (E) Cambios de series temporales en la intensidad de fluorescencia para cada ROI en el ejemplo. Los colores de las líneas son como en B. (F) Un solo pico dentro del contorno discontinuo se aísla y se muestra en una vista ampliada. La onda de calcio objetivo es la onda más temprana que apareció dentro de los 4-8 segundos posteriores a la inyección. (G) Comparación de la actividad espontánea de M2 (antes) y la respuesta después de la inyección (inyectado). La intensidad media de la fluorescencia cambia a lo largo de 50 s antes de la inyección, y se calculó la respuesta máxima en la región M2 entre 4 s y 8 s después de la inyección, utilizando como referencia la corteza auditiva. (H) Comparación de los niveles de activación en cada región cortical cuando se administró agua o glucosa. Para cada región se calculó la relación entre el valor de después de la inyección y antes de la inyección, determinado en G. N.S. representa no significativo (p &gt; 0,05). ** &lt;0,01. Las barras de error se definen como el error estándar de la media. Abreviaturas: DE = desviación estándar; ROI = región de interés; RSC = región retro esplenial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Análisis en tiempo real de la comunicación neuronal intestino-cerebro: dinámica del calcio en toda la corteza en respuesta a la estimulación intestinal de la glucosa

Communication between the gastrointestinal tract and the brain after nutrient absorption plays an essential role in food preference, metabolism, and ...

real-time-analysis-gut-brain-neural-communication-cortex-wide-calcium

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La preparación de cortes de cerebro de agudos de hipocampo aislado, así como los registros simultáneos electrofisiológicas de los astrocitos y las neuronas...

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Fuente: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imágenes del sistema nervioso entérico. J. Vis. Exp.  (2015)Este video muestra el calcio imágenes para visualizar y analizar la actividad de las neuronas entéricas y la glía en preparaciones de plexo mientérico colónico de ratón.

Imágenes de calcio de las actividades de las neuronas entéricas y la glía en un plexo mientérico colónico de ratón

El sistema nervioso entérico (SNE) es una red de neuronas y glía localizada en la pared intestinal que controla los reflejos intestinales. Este protocolo describe los métodos para registrar la actividad de las neuronas entéricas y la glía en preparaciones vivas de ENS utilizando imágenes de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico

Aquí presentamos una novela Ca 2+ -Imagenología enfoque utilizando un reportero bioluminiscente. Este método utiliza una construcción GFP-aequorina fundida que se une a Ca 2+ y emite luz, eliminando la necesidad de excitación luz. Significativamente este método permite la proyección de imagen continua de largo, el acceso a las estructuras cerebrales profundas y alta resolución temporal.

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Este protocolo describe el aislamiento y cultivo de células del intestino delgado murino mixtos. Estos cultivos primarios intestinales permiten la investigación de vías de señalización subyacentes secreción de péptido intestinal usando un número de técnicas.

Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas

Ca2 + indicadores genético codificados (GECIs) han cambiado radicalmente cómo in situ Ca2 + proyección de imagen se realiza. Para maximizar la recuperación de datos de esas grabaciones, análisis apropiado de señales de Ca2 + se requiere. Los protocolos en este trabajo facilitan la cuantificación de Ca2 + señales grabadas in situ utilizando Cartografía espacio-temporal y el análisis de partículas.

Aplicaciones de la cartografía espacio-temporal y técnicas de análisis de partículas para cuantificar Ca intracelular2 + señalización In Situ

Aquí, presentamos un protocolo para la toma de imágenes y la cuantificación de la dinámica de calcio en poblaciones de células heterogéneas, como las células de los islotes pancreáticos. Los reporteros fluorescentes se entregan en la capa periférica de las células dentro del islotes, que luego se inmoviliza e imagen, y se realiza un análisis por célula de la dinámica de la intensidad de la fluorescencia.

Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón

Presentamos la preparación de lonchas de tejido pancreático agudo y su uso en microscopía de barrido láser confocal para estudiar la dinámica del calcio simultáneamente en un gran número de células vivas, durante largos períodos de tiempo, y con alta resolución espaciotemporal.

Microscopía de barrido con láser confocal de la dinámica del calcio en rodajas agudas de tejido pancreático de ratón

neuroHuMiX es un modelo avanzado de intestino en un chip para estudiar las interacciones de células bacterianas, epiteliales y neuronales en condiciones de cocultivo proximales y representativas. Este modelo permite desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la comunicación entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso.

Un modelo de intestino en un chip para estudiar el eje microbioma intestinal-sistema nervioso

Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

El presente protocolo describe imágenes de calcio in vivo para medir las respuestas de conjuntos de neuronas lumbar-6 DRG a estímulos somáticos y viscerales. Se pueden hacer comparaciones exhaustivas entre las neuronas que responden a diferentes estímulos. Este protocolo es valioso para investigar los mecanismos del dolor visceral y la estimulación somática, como la acupuntura.

in vivo Imágenes de calcio de la respuesta de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal a estímulos somáticos y viscerales

Aprende a analizar la comunicación intestino-cerebro mediante inyección intragástrica de glucosa en ratones. Este método revela cambios en la dinámica del calcio cortical y mejora la comprensión de las señales neuronales derivadas del intestino.

Análisis en tiempo real de la comunicación neuronal intestino-cerebro: dinámica del calcio en toda la corteza en respuesta a la estimulación intestinal de la glucosa (Video) | JoVE Journal

Análisis en tiempo real de la comunicación neuronal intestino-cerebro: dinámica del calcio en toda la corteza en respuesta a la estimulación intestinal de la glucosa

Explorar más videos