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Artículo de método
Describimos un protocolo para establecer un modelo de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI) utilizando células epiteliales de la vía aérea traqueal neonatal (nTAEC) y realizar una exposición a la hiperoxia fisiológicamente relevante para estudiar el efecto del estrés oxidativo inducido por la atmósfera en las células derivadas del epitelio de la superficie de la vía aérea neonatal en desarrollo.
El epitelio de las vías respiratorias neonatales prematuros está constantemente expuesto a factores estresantes ambientales. Uno de estos factores estresantes en los neonatos con enfermedad pulmonar es la tensión de oxígeno (O2) superior a la atmósfera ambiente, denominada hiperoxia (>21%O2). El efecto de la hiperoxia en las vías respiratorias depende de varios factores, incluida la etapa de desarrollo de las vías respiratorias, el grado de hiperoxia y la duración de la exposición, con exposiciones variables que pueden conducir a fenotipos únicos. Si bien se han realizado numerosas investigaciones sobre el efecto de la hiperoxia en la alveolarización pulmonar neonatal y la hiperreactividad de las vías respiratorias, se sabe poco sobre el efecto subyacente a corto y largo plazo de la hiperoxia en las células epiteliales de las vías respiratorias neonatales humanas. Una de las principales razones de esto es la escasez de un modelo in vitro eficaz para estudiar el desarrollo y la función epitelial de las vías respiratorias neonatales humanas. Aquí, describimos un método para aislar y expandir las células epiteliales de las vías respiratorias traqueales neonatales humanas (nTAEC) utilizando aspirados traqueales neonatales humanos y cultivando estas células en cultivo de interfaz aire-líquido (ALI). Demostramos que los nTAEC forman una monocapa de células polarizadas maduras en el cultivo de ALI y experimentan diferenciación mucociliar. También presentamos un método para la exposición moderada a hiperoxia de la monocapa celular en cultivo de ALI utilizando una incubadora especializada. Además, describimos un ensayo para medir el estrés oxidativo celular después de la exposición a hiperoxia en cultivo de ALI utilizando cuantificación fluorescente, que confirma que la exposición moderada a la hiperoxia induce estrés oxidativo celular pero no causa daño significativo a la membrana celular o apoptosis. Este modelo puede utilizarse potencialmente para simular la exposición a la hiperoxia clínicamente relevante encontrada por las vías respiratorias neonatales en la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales (UCIN) y utilizarse para estudiar los efectos a corto y largo plazo delO2 en la programación epitelial de las vías respiratorias neonatales. Los estudios que utilizan este modelo podrían utilizarse para explorar formas de mitigar la lesión oxidativa temprana en las vías respiratorias en desarrollo, que está implicada en el desarrollo de enfermedades de las vías respiratorias a largo plazo en ex bebés prematuros.
El oxígeno terapéutico (O2) es una de las terapias más utilizadas en la unidad de cuidados intensivos neonatales (UCIN)1. En consecuencia, la exposición a la hiperoxia (>21%O2) es un factor de estrés atmosférico común que encuentran los neonatos con y sin enfermedad pulmonar significativa. Las respuestas pulmonares a la hiperoxia pueden variar dependiendo de la intensidad y/o duración de la exposición y de la localización anatómica, el tipo de célula y la etapa del desarrollo pulmonar 2,3,4,5,6.
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Las muestras de aspirado traqueal neonatal se recolectaron solo después del consentimiento informado de los padres, y el protocolo utilizado para la recolección, el transporte y el almacenamiento ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma (IRB 14377).
1. Preparación para el aislamiento, el paso y la cultura ALI de nTAEC
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Para aislar los nTAEC, recolectamos aspirados traqueales de neonatos intubados en la UCIN y transportamos los aspirados en hielo al laboratorio para su posterior procesamiento (Figura 1A). Después de sembrar las muestras de aspirado traqueal en un medio de crecimiento epitelial de las vías respiratorias (BLEAM-I que contiene inhibidores de Rho/Smad, GSK3 y mTOR), aparecieron células cuboidales en un plazo de 7 a 10 días. A los 14 días, las células tenían una.......
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El protocolo aquí descrito detalla un método para la recolección y procesamiento de muestras de aspirado traqueal neonatal de neonatos intubados en la UCIN, con el posterior aislamiento y expansión de nTAEC vivos a partir de estas muestras utilizando métodos previamente establecidos39. Además, hemos descrito un método para cultivar nTAECs en ALI y caracterizar su diferenciación en un epitelio de la vía aérea mucociliar polarizado en función del tiempo mediante la .......
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Los autores no tienen nada que revelar ni conflictos de intereses que informar.
Este trabajo cuenta con el apoyo financiero de la Fundación Presbiteriana de Salud (PHF) y Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 con un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) de NIGMS) a AG. Nos gustaría agradecer al Dr. Paul LeRou y al Dr. Xingbin Ai del Hospital General de Massachusetts, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, Massachusetts, por proporcionar células de donantes neonatales utilizadas en algunos de los experimentos. Las figuras fueron creadas con Biorender. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Formalina tamponada al 10% | Fisher Scientific | 23-426796 | |
| 1X PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| A 83-01 | Tocris | 29-391-0 | |
| ALI Insertos Transwell, 6.5mm | Corning | 3470 | |
| monoclonal de ratón | Sigma | T7451 | |
| Anticuerpo anti-alfa tubulina | Abcam | ab7291 | |
| Anticuerpo anti-citoqueratina 5 | Abcam | ab53121 | |
| BronchiaLife Medio de la vía aérea epitelial (BLEAM) | LifeLine Cell Technology | LL-0023 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 44-231-0 | |
| Anticuerpo caspasa-3 escindido | Señalización celular | 9664T | |
| SCGB1A1 o Club Cell Protein (CC16) Humano, Anticuerpo policlonal de conejo | BioVendor R& D | RD181022220-01 | |
| CM-H2DCFDA (Indicador general de estrés oxidativo) | Thermo Scientific | C6827 | |
| Matraces T25 | Corning | 430639 | |
| Corning Cultivo celular en forma de U T75 Matraces Corning | 430641U | ||
| CyQUANT LDH Ensayo de citotoxicidad | Thermo Scientific | C20300 | |
| DAPI Solución (1 mg/mL) | Fisher Scientific | EN62248 | |
| Dimetilsulfóxido [DMSO] Hybri-Max | Sigma | D2650 | |
| Agua destilada | Gibco | 15230162 | |
| EVOM Manual para la medición de TEER | Instrumento de precisión mundial | EVM-MT-03-01 | |
| FBS (Suero fetal bovino) | Gibco | 10082147 | |
| Isotiocianato de fluoresceína Dextrano (promedio mol wt 10,000) | Fisher Scientific | F0918100MG | |
| Isotiocianato de fluoresceína– dextrano (peso medio mol 20,00) | Sigma | FD20-100MG | |
| Cabra Anti-Ratón IgG (H + L), Humano ads-HRP | Southern Biotech | 1031-05 | |
| Cabra anti-Ratón IgG2b Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21141 | |
| Cabra anti-Conejo IgG (H + L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| Cabra Anti-Conejo IgG (H + L), ratón / humano ADS-HRP | Southern Biotech | 4050-05 | |
| HBTEC Interfaz aire-líquido (ALI) Medio de diferenciación | LifeLine Tecnología celular | LM-0050 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| Heracell VIOS 160i Incubadora de CO2 trigás, 165 L | Thermo Scientific | 51030411 | |
| Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad | Thermo Scientific | 4368814 | |
| Suplemento HLL | LifeLine Cell Technology | LS-1001 | |
| ImageJ | NIH | N/A | |
| Invivogen Normocin - Reactivo antimicrobiano | Fisher Scientific | ||
| L-Glutamina | LifeLine Cell Technology | LS-1013 | |
| Suero de cabra normal | Gibco | ||
| Normocin | Invivogen | anticuerpo ant-nr-05 | |
| p63 | Santa Cruz Biotechnology | sc-25268 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183025 | |
| RAPAMICINA | Thermo Scientific | AAJ62473MC | |
| Mezcla maestra avanzada rápida de Taqman | Thermo Scientific 4444964 | ||
| Ensayos de exressión génica de Taqman: ARNr 18S | Thermo Scientific | ||
| Taqman: CAT | Thermo Scientific | Hs00156308_m1 | |
| Ensayos de exressión génica de Taqman: FOXJ1 | Thermo Scientific | ||
| Taqman: GAPDH | Ensayos | ||
| Taqman de Thermo Scientific: Ensayos de exressión | Hs00829989_gH | ||
| de genes de Taqman GPX1 Thermo Scientific: Ensayos | Thermo Scientific | Hs01591589_m1 | |
| Taqman: Ensayos de exressión de genes GPX3 | Thermo Scientific | Hs01078668_m1 | |
| Taqman: KRT5 | Thermo Scientific | ||
| Ensayos de exressión génica de Taqman: MUC5AC | Thermo Scientific | Hs01365616_m1 | |
| Ensayos de exressión génica de Taqman: SCGB1A1 | Ensayos | de Hs00171092_m1 | |
| Taqman Thermo Scientific: Ensayos de exressión de genes SOD1 | Thermo Scientific | Hs00533490_m1 | |
| Taqman: SOD2 | Thermo Scientific | Hs00167309_m1 | |
| Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápido Thermo Scientific Nalgene con membrana PES (0,22 μ m poros, 500 ml) | Thermo Scientific | 5660020 | |
| TM-1 Suplemento combinado | LifeLine Cell Technology | LS-1055 | |
| Anticuerpo total caspasa-3 | Señalización celular | 14220S | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), Rojo fenol | Gibco | 25300062 | |
| Y-27632 2 HCl | Tocris | 12-541-0 |
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