Name: Identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprende citometría de masa unicelular para analizar progenitores miogénicos en modelos murinos de lesión muscular aguda. Este método permite identificar firmas moleculares únicas y comprender las transiciones de estados celulares durante la regeneración.

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<meta charset="utf8"></head><body>Análisis CyTOF unicelular de progenitores miogénicos en la regeneración muscular

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>aguja de 20 G</td><td>KDM</td><td>KD-FINE 900123</td><td></td></tr><tr><td>28 G, jeringa de insulina de 0,5 mL&nbsp;</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>29 G, jeringa de insulina de 0,3 mL</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de 3 mL</td><td>Terumo medical MDSS03SE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; Filtros de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>11587522</td><td></td></tr><tr><td>tubos de polipropileno de 5 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>tubos de ensayo de poliestireno de 5 mL con 35 &micro; filtro de células</td><td>m Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de 5 mL</td><td>Terumo medical</td><td>SS05LE1</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2-desoxiuridina (IdU)</td><td>Merck</td><td>I7125-5g</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD104 FITC (clon: 346-11A)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>123605 Stock = 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD11b APC-Cy7 (Clon: M1/70)</td><td>Stock de 101226 Biolegend</td><td></td><td>= 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD31 APC-Cy7 (clon: 390)</td><td>Stock Biolegend</td><td>102440</td><td>= 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD45 APC-Cy7 (clon: 30-F11)</td>Stock de <td>103116 Biolegend</td><td></td><td>= 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-CD9 APC (clon: KMC8)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0091-82</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clon: D7)</td><td>Biolegend</td><td>108126</td><td>Stock = 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-y alfa; 7 integrina PE (clon: R2F2))</td><td>UBC AbLab</td><td>67-0010-05</td><td>Stock = 1 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III (4 láser) instrumento</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>405, 488, 561 y 633 nm láser</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/mL</td><td>Ceva</td><td>Vnr 054594</td><td></td></tr><tr><td>CD104 (Clon: 346-11A)</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td>DY162; </td></tr><tr><td>CD106/VCAM-1 conjugado internamente (Clon: 429 MVCAM. a)</td><td>Biolegend</td><td>105701</td><td>Er170; </td></tr><tr><td>CD11b conjugado internamente (Clon: M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td>Nd148; </td></tr><tr><td>CD29/Integrina y beta conjugadas internamente; 1 (Clon: 9EG7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553715</td><td>Tm169; </td></tr><tr><td>CD31 conjugado internamente (Clon: MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td>Sm154; </td></tr><tr><td>CD34 conjugado internamente (Clon: RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>551387</td><td>Lu175; </td></tr><tr><td>CD44 conjugado internamente (Clon: IM7)</td><td>BD Biosciences</td><td>550538</td><td>Yb171; </td></tr><tr><td>CD45 conjugado internamente (Clon: MEC 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td>Sm147; </td></tr><tr><td>CD9 conjugado internamente (clon: KMC8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0091-85</td><td>Yb174; </td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2 conjugado internamente (Clon: 30-H12)</td><td>BD Biosciences</td><td>553009</td><td>Nd144; </td></tr><tr><td>CD98 conjugado internamente (Clon: H202-141)</td><td>BD Biosciences</td><td>557479</td><td>Pr141; Solución de adquisición de células conjugadas internas</td></tr><tr><td>/tampón Maxpar CAS</td><td>Estándar Biotools</td><td>201240</td><td></td></tr><tr><td>Intercalador de ID de celda-Iridium</td><td>estándar Biotools</td><td>201192B</td><td>Intercalador de ácido nucleico catiónico</td></tr><tr><td>Cisplatino</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td>Pt195</td></tr><tr><td>Cisplatino (dicloruro de cis-diamminaplatino(II)</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>Transparente 1,5 mL tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Colgenasa, Tipo II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento</td><td>Merck</td><td>BR718620-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4/SDF1 (Clon: 2B11/CXCR4 )</td><td>BD Biosciences</td><td>551852</td><td>Gd158; DAPI conjugado internamente</td></tr><tr><td>(1 mg/mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Tubo oscuro de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>15386548</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glucosa baja, con piruvato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético)</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>Na2EDTA-2H20</td></tr><tr><td>EQ Cuentas de calibración de cuatro elementos (EQ beads)</td><td>Biotools estándar</td><td>201078</td><td>Cuentas de calibración</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal, calificado, origen Brasil</td><td>Pinzas</td> de <td>10270106</td><td></td>Thermo Fisher</tr><tr><td>Scientific Dumont #5SF</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont #7</td><td>Hounisen.com</td><td>1606.3350</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Helios Sistema CyTOF</td><td>Standard Biotools</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo, inactivado por calor, de origen neozelandés</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-050-088</td><td></td></tr><tr><td>IdU</td><td>Merck</td><td>I7125</td><td>I127</td></tr><tr><td>Iridium-Intercalator</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td>Ir191/193</td></tr><tr><td>Isoflurano/Attane</td><td>Vet ScanVet</td><td>Vnr 055226</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/3900/17</td><td></td></tr><tr><td>Myf5 (clon: C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-302</td><td>Yb173; </td></tr><tr><td>MyoD conjugado internamente (Clon: 5.8A)</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td>Dy164; </td></tr><tr><td>MyoG (clon: F5D) conjugado internamente</td> <td>BD Biosciences</td><td>556358</td><td>Gd160; </td></tr><tr><td>Tapa de botella desechable estéril estéril Nalgene Rapid-Flow conjugada internamente 0.20 &mu; M Filtros PES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>595-4520</td><td></td></tr><tr><td>Notexin</td><td>Latoxan</td><td>L8104</td><td>Resuspender a 50 &micro; g/ml en PBS estéril. Mantener existencias (por ejemplo, 50 y micro; l) a -20 y grados; C</td></tr><tr><td>Mezcla de nutrientes F-10 (Ham's)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31550031</td><td></td></tr><tr><td>pAkt (Clon: D9E)</td><td>Standard Biotools</td><td>3152005A</td><td>Sm152</td></tr><tr><td>Pax7 (Clon: PAX7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-81648</td><td>Eu153; </td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina conjugada internamente (10.000 U/mL) (Pen/Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro PES 0,20 &mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa PES</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16% EM grado</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, monobásico,&nbsp; anhidro (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>pRb (Clon: J112-906)</td><td>Standard Biotools</td><td>3166011A</td><td>Er166</td></tr><tr><td>pS6 quinasa (Clon: N7-548)</td><td>Standard Biotools</td><td>3172008A</td><td>Yb172</td></tr><tr><td>Sca-1 (Clon: E13-161.7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553333</td><td>Nd142; </td></tr><tr><td>Azida de sodio</td> conjugada internamente <td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10553515</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio, dibásico, heptahidratado (Na2HPO4-6H2O)</td><td>Merck</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina estéril 0,9</td><td>%Fresenius</td><td>B306414/02</td><td></td></tr><tr><td>y alfa; 7 integrina (Clon: 3C12)</td><td>MBL internacional</td><td>K0046-3</td><td>Ho165; Conjugado internamente</td></tr></tbody></table>

identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión

Identification and Analysis of Myogenic Progenitors In Vivo During Acute Skeletal Muscle Injury by High-Dimensional Single-Cell Mass Cytometry

Aquí presentamos una descripción general de la configuración experimental para usar este enfoque combinado que incluye (i) análisis CyTOF de alta dimensión del curso del tiempo de una lesión aguda mediante inyección de notexina para estudiar la dinámica celular y molecular de las células madre y progenitoras en el músculo esquelético (Figura 1, esquema superior); y (ii) FACS de células madre y progenitoras utilizando dos marcadores de superficie celular, CD9 y CD104, para aislar estas poblac...

Identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...

identification-analysis-myogenic-progenitors-vivo-during-acute

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Método para la disociación enzimática, el etiquetado de superficie y la purificación por citometría de flujo de fibro / adipogénico y progenitores miogénica del músculo esquelético murino.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Este manuscrito describe un protocolo detallado para inducir la regeneración del músculo esquelético aguda en ratones adultos y posteriores manipulaciones de los músculos, tales como disección, congelación, corte, tinción de rutina, y miofibras análisis del área de la sección transversal.

La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

La autofagia activa se asocia con la regeneración muscular productiva, que es esencial para la activación de las células madre musculares (MuSC). Aquí, proporcionamos un protocolo para la detección in situ de LC3, un marcador de autofagia en MyoD-positivos MuSCs de secciones de tejido muscular de control y los ratones lesionados.

Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares

Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .

Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

Diferenciación del músculo esquelético es un proceso altamente dinámico, que particularmente se basa en posición nuclear. Aquí, describimos un método para seguir los movimientos de los núcleos de proyección de imagen de vivo de la célula durante la diferenciación y myotube formación de mioblastos y se realiza una caracterización cuantitativa de la dinámica de los núcleos de extracción de información de seguimiento automático.

Explotando en la proyección de imagen a los núcleos de la pista durante la fusión y diferenciación de mioblastos

Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética.  los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.

Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

Describimos un método in vivo para investigar la pérdida funcional de un gen específico en células satélite mediante el uso de una combinación de lesión mediada por cardiotoxina del músculo esquelético y la inyección de un siRNA autosuficiente.

Análisis de la función de células satelitales durante la regeneración muscular esquelética por lesión de cardiotoxina e inyección de siRNA autoentregado In Vivo

Este protocolo describe un método para aislar progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) del músculo esquelético de rata. La utilización de la rata en modelos de lesión muscular proporciona una mayor disponibilidad de tejido del músculo atrófico para el análisis y un repertorio más amplio de métodos validados para evaluar la fuerza muscular y la marcha en animales que se mueven libremente.

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata

En este protocolo se describe un método de cultivo y análisis funcional in vitro para células madre musculares, que conserva la mayoría de sus interacciones con su nicho endógeno.

Ensayo único de cultivo de Myofiber para la evaluación de la funcionalidad de las células madre musculares adultas ex vivo

La identificación precisa de las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) y las células madre musculares (MuSC) es fundamental para estudiar su función biológica en condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo proporciona pautas para el aislamiento, purificación y cultivo de FAP y MuSC de músculos de ratones adultos.

FACS-aislamiento y cultivo de progenitores fibroadipogénicos y células madre musculares a partir de músculo esquelético de ratón imperturbable y lesionado

Aprende citometría de masa unicelular para analizar progenitores miogénicos en modelos murinos de lesión muscular aguda. Este método permite identificar firmas moleculares únicas y comprender las transiciones de estados celulares durante la regeneración.

Identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión (Video) | JoVE Journal

Identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión

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