Identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión
1 de diciembre de 2023
El protocolo aquí presentado permite la identificación y el análisis de alta dimensión de células madre y progenitoras musculares mediante citometría de masas unicelulares y su purificación por FACS para estudios en profundidad de su función. Este enfoque se puede aplicar para estudiar la dinámica de regeneración en modelos de enfermedad y probar la eficacia de las intervenciones farmacológicas.
Nuestra investigación investiga los mecanismos moleculares que subyacen a la disfunción de las células madre en el envejecimiento y la enfermedad. Nuestro objetivo es comprender cómo las células madre y progenitoras musculares interactúan con otras células en el microambiente muscular para lograr una regeneración efectiva. También estamos estudiando si una comunicación celular estéril afecta la función de las células madre musculares en el envejecimiento y la enfermedad.
Una barrera importante para la investigación de la comunicación entre células dentro del nicho de las células madre ha sido la falta de tecnologías que proporcionen resolución de una sola célula. La citometría de masa de una sola célula permite el análisis cuantitativo simultáneo de alto rendimiento en múltiples tipos de células y fenotipos moleculares en tejidos complejos. Nuestro protocolo permite la purificación y el perfil profundo de las células madre raras y la progenie durante la regeneración muscular utilizando anticuerpos contra los marcadores de la superficie celular y los factores de transcripción miogénicos.
El estudio de estas células nos ayuda a comprender cómo se controla el destino de las células madre musculares y a descubrir las redes que impulsan las transiciones de estado celular para una regeneración efectiva. La medición simultánea de hasta 50 proteínas celulares y proteínas intracelulares a nivel de una sola célula es un enfoque valioso para investigar la función celular en el tejido muscular. Esta técnica puede identificar firmas moleculares únicas y revelar nuevos mecanismos de disfunción de las células madre musculares en el envejecimiento y la enfermedad.
Este protocolo permite investigar cómo la transición del estado celular impacta en la regeneración de tejidos en la salud y la enfermedad. La firma de las células madre activadas que presentamos aquí permite estudiar la quiescencia de las células madre. Antes no eran posibles.
Ahora podemos purificar células madre activadas, CD98 High, CD44 High, basándonos únicamente en el marcador de superficie celular, y estudiar por primera vez, cómo vuelven a la quiescencia.
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Descripción general
Esta investigación examina los mecanismos moleculares de la disfunción de las células madre y progenitoras musculares en el envejecimiento y la enfermedad. Mediante la aplicación de citometría de masas de una sola célula y FACS, el estudio se centra en cómo estas células interactúan dentro del microentorno muscular y en sus funciones en la dinámica de regeneración, aportando información sobre posibles intervenciones terapéuticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Biología muscular
- Función de células madre
- Dinámica de regeneración
Antecedentes
- La disfunción de las células madre afecta la regeneración de tejidos en el envejecimiento y las enfermedades.
- La comunicación eficaz entre células es crucial dentro del nicho de células madre.
- Las tecnologías anteriores carecían de resolución a nivel de célula individual para estudios detallados.
Métodos Utilizados
- Citometría de masas de célula individual para análisis de alta dimensión.
- FACS (ordenación de células activada por fluorescencia) para la purificación de células.
- Modelos de ratón in vivo para estudios de regeneración.
Resultados principales
- Identificación de firmas moleculares únicas en células madre musculares.
- Conocimientos sobre la quiescencia y reactivación de células madre.
- Caracterización de las transiciones de estado celular esenciales para una regeneración eficaz.
Conclusiones
- Este estudio demuestra la utilidad de técnicas avanzadas de citometría para comprender la biología de las células madre musculares.
- Los hallazgos son relevantes para el desarrollo de estrategias terapéuticas contra la degeneración muscular relacionada con la edad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La citometría de masas de alta dimensión a nivel de célula individual permite la identificación precisa y el perfilado de progenitores y células madre miogénicas durante una lesión aguda del músculo esquelético, abordando una laguna crítica en la comprensión de la dinámica regenerativa. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en carteras de enfermedades musculares y medicina regenerativa. El enfoque apoya las decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar información celular cuantitativa y reproducible, relevante para la investigación básica y traslacional temprana.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la resolución de la dinámica celular y molecular durante la regeneración muscular.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la identificación de estados activados de células madre y progenitoras utilizando marcadores multiplexados.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al revelar transiciones de estados celulares y firmas de disfunción en modelos de enfermedad.
- Mejora la confianza predictiva para la selección de carteras al cuantificar poblaciones celulares raras y su estado de activación.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas biológicos validados para análisis posteriores mediante el aislamiento de poblaciones definidas de células madre y progenitoras mediante citometría de flujo (FACS).
- Permite la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante mediciones cuantitativas de proteínas en alta dimensión a resolución individual de células.
- Facilita la preparación para análisis escalables al permitir el análisis simultáneo de hasta 50 marcadores por célula.
- Proporciona resultados cuantitativos confiables para la evaluación de compuestos en sistemas relevantes para enfermedades.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad al permitir el análisis in vivo de la dinámica de células madre y progenitoras tras una lesión o intervención farmacológica.
- Apoya el descubrimiento traslacional de biomarcadores al vincular firmas moleculares con resultados regenerativos.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir estudios funcionales de poblaciones celulares aisladas.
- Reduce los riesgos en la fase preclínica al proporcionar información mecanicista sobre la disfunción de las células madre en el envejecimiento y la enfermedad.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
Este método integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos prometedores y la investigación preclínica, apoyando la comprobación de hipótesis, la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos en estudios de regeneración muscular.
- Biología del Descubrimiento: El perfilado cuantitativo de células madre y progenitoras aclara las vías regenerativas y las decisiones del destino celular.
- Selección: El análisis de marcadores de alta dimensión garantiza la preparación y reproducibilidad del ensayo para aplicaciones posteriores.
- Análisis: Las mediciones multiplexadas de proteínas y los algoritmos de agrupamiento permiten comparaciones robustas de estados y condiciones celulares.
- Investigación Traducional: La aplicación in vivo en modelos de enfermedades apoya la alineación de biomarcadores y la continuidad traslacional.
- Reutilización Empresarial: La plataforma es adaptable para diversos estudios de modelos regenerativos y de enfermedades, favoreciendo una amplia reutilización en I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona análisis estandarizados, reproducibles y escalables a nivel de célula individual para poblaciones celulares raras.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del desarrollo y una gestión eficiente del portafolio al cuantificar la dinámica de células regenerativas.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas regenerativos y modificadores de la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en citometría de una sola célula, citometría de flujo (FACS) y análisis de datos de alta dimensión.
- Exige acceso a instrumentación de citometría de masas e infraestructura computacional avanzada.
- Necesita la estandarización entre equipos de paneles de anticuerpos y estrategias de selección de poblaciones celulares para garantizar la reproducibilidad.
- La adaptación a diferentes modelos de lesión o enfermedad muscular puede requerir la optimización del panel de marcadores.
- El rendimiento y la sensibilidad están limitados por la capacidad del instrumento y la abundancia de células raras.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Introduction
1:59
Induction of Acute Injury by Notexin Injection in the Mouse Skeletal Muscle
3:36
Dissection of the Mouse Skeletal Muscle After Notexin Injury and Cell Dissociation Procedure for Single‐Cell Analysis
5:17
Live/Dead Staining of Skeletal Muscle Cells,Isolated from Notexin‐Injured Mice,with Cisplatin and Paraformaldehyde Fixation
7:38
Skeletal Muscle Cells Preparation for Loading into Mass Cytometer and CyTOF Data Analysis
