Name: in vivo Imágenes de calcio de la respuesta de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal a estímulos somáticos y viscerales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo en neuronas del ganglio de la raíz dorsal lumbar-6 de ratones para estudiar respuestas a estímulos somáticos y viscerales. Este método permite analizar los mecanismos del dolor visceral y los efectos analgésicos de la acupuntura.

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Este estudio fue financiado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2022YFC3500702), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82230123, 82174281).

Este protocolo animal fue aprobado por los Comités de Ética de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Acupuntura y Moxibustión de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas, y cumplió con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación para garantizar un uso y malestar mínimos de los animales. Los ratones Pirt-cre fueron amablemente donados por el Dr. Xinzhong Dong de la Universidad Johns Hopkins (Baltimore, MD). Los ratones Rosa26-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). El siguiente procedimiento está optimizado para cualquiera de los sexos de ratones que pesan entre 20 y 35 g. La edad recomendada para los ratones sometidos a la operación fue de entre 8 y 14 semanas. Se adoptaron indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como los ratones Pirt-GCaMP6s, o ratones C57 normales inyectados intratecalmente con GECI virales, para mostrar las principales poblaciones de neuronas DRG. Los ratones modificados genéticamente inyectados intratecalmente con GECI virales o cruzados con ratones Rosa26-GCaMP mostrarían la población específica de neuronas DRG. Se usaron batas de laboratorio, guantes y mascarillas durante todo el protocolo. Después del experimento, los ratones fueron sacrificados con inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical.
1. Configuración preoperatoria
<ol>
	<li>Verifique que el dispositivo de ventilación de anestesia (consulte la Tabla de materiales) se haya instalado correctamente.</li>
	<li>Asegúrese de que el sistema de imágenes (ver Tabla de Materiales) haya sido preabierto y esté funcionando correctamente. 
	NOTA: La operación y los procedimientos de imagen se llevaron a cabo secuencialmente, mientras que el proceso de análisis se puede completar fuera de línea más tarde.</li>
</ol>
2. Anestesia
<ol>
	<li>Inyectar intraperitonealmente al ratón una solución de tribromoetanol (1,25%, 250 mg/kg, ver Tabla de Materiales)13,14,15. Evalúe la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en los dedos de los pies antes de continuar.</li>
	<li>Afeitar el vello de la zona lumbar y la parte cervical ventral.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición supina sobre la almohadilla térmica (consulte la tabla de materiales).</li>
	<li>Aplique ungüento en los ojos del animal para evitar que se sequen. 
	NOTA: La profundidad de la anestesia se mantuvo mientras el ratón no mostró respuesta a un pellizco de la pata trasera durante todos los procedimientos quirúrgicos y de registro. Si el animal presentaba algún signo de dolor, se administraba 0,2 mL adicional de solución de tribromoetanol por vía intraperitoneal, o se administraba isoflurano al 0,5% por vía intratraqueal después de la aplicación del ventilador para evitar espasmos musculares y asegurar la profundidad de la anestesia.</li>
</ol>
3. Traqueotomía
<ol>
	<li>Realizar una incisión en la línea media de aproximadamente 2 cm en la piel de la garganta, utilizando una cuchilla quirúrgica, desde el esternón hasta el mentón.</li>
	<li>Extienda la incisión y empuje suavemente a un lado las glándulas submaxilares, asegurando la exposición completa de los músculos digástricos ubicados debajo de las glándulas, corriendo longitudinalmente a lo largo del centro de la tráquea.</li>
	<li>Una vez que se ve la costura de la musculatura paratraqueal en el medio de los músculos, exponga la tráquea separando suavemente la musculatura y retrayéndola para abrirla.</li>
	<li>Cree una incisión transversal en la tráquea, lo suficientemente grande como para acomodar la cánula de la tráquea (diámetro exterior 1,3 mm, longitud 13 mm, con un adaptador en Y, ver Tabla de Materiales) dirigida hacia el pulmón (Figura 1A).</li>
	<li>Cubra la tráquea con los músculos paratraqueales y las glándulas submaxilares, luego sutura los tejidos circundantes a la piel capa por capa usando suturas quirúrgicas 5-0.</li>
</ol>
4. Exposición de las vértebras lumbares
<ol>
	<li>Coloque al animal en posición prona sobre la almohadilla térmica.</li>
	<li>Realice una incisión en la línea media de aproximadamente 7 cm en la parte baja de la espalda, que se extienda desde la vértebra lumbar-5 hasta la vértebra sacra-1.</li>
	<li>Exponga cuidadosamente las apófisis espinosas de las tres vértebras apartando los músculos longissimus lumbarum.</li>
	<li>Exponga las tres apófisis articulares y mamilares sucesivas, con el segmento de registro en el centro de las vértebras, apartando las partes internas del longissimus lumbarum bilateral, los músculos de la columna cervical dorsal y los músculos semiespinales cervicales dorsales (Figura 1B). 
	NOTA: Las apófisis articulares y mamilares de las tres vértebras se expusieron para permitir que la pinza espinal asegurara al animal sin desplazamiento durante el registro.</li>
</ol>
5. Exposición del ganglio de la raíz dorsal
<ol>
	<li>Inmovilizar firmemente al animal con una pinza dentada (ver Tabla de Materiales) sobre las apófisis articulares bilaterales de las vértebras vecinas. A continuación, utilice pinzas de rongeur para extirpar las apófisis articulares y mamiles izquierdas o derechas de las vértebras lumbares-6.</li>
	<li>Exponga cuidadosamente el DRG lumbar-6 izquierdo o derecho después de limpiar los tejidos conectivos por encima de él, manteniendo el epineuro intacto en el lado izquierdo o derecho de las vértebras lumbares-6.</li>
	<li>Asegure las condiciones activas del DRG expuesto cubriendo las áreas expuestas con pequeñas bolas de algodón empapadas en solución salina. 
	NOTA: Cambie las bolas de algodón hasta que no haya una fuga sutil de sangre cerca de la DRG expuesta y el tejido circundante, ya que esto podría afectar la imagen clara de las neuronas DRG. Reemplace las pequeñas bolas de algodón mojadas con solución salina hasta que no haya fugas rojas o amarillas de líquidos tisulares.</li>
</ol>
6. Inmovilización y ventilación
<ol>
	<li>Coloque al animal con el DRG lumbar-6 expuesto sobre una almohadilla térmica en la plataforma de una pinza espinal personalizada16,17 (Figura 1C).</li>
	<li>Asegure al animal usando dos pinzas en las columnas vertebrales de las vértebras vecinas para minimizar el movimiento durante la prueba (Figura 1D).</li>
	<li>Continúe cambiando las bolas de algodón mojadas con solución salina hasta que el área quirúrgica esté lo suficientemente limpia (Figura 1E).</li>
	<li>Monitoree la ventilación y la oximetría de pulso durante todo el experimento. 
	NOTA: Inmovilice la columna vertebral con la pinza espinal personalizada y luego ajuste el ángulo de la almohadilla para que el objetivo del microscopio sea perpendicular al DRG. Realice los ajustes necesarios para alinear el objetivo y el DRG utilizando ajustadores de ángulo.</li>
</ol>
7. Configuración de hardware y software para la creación de imágenes
<ol>
	<li>Inserte la pinza espinal personalizada en la platina del microscopio diseñada a medida (Figura 1F,G).</li>
	<li>Coloque una lente de objetivo aéreo de larga distancia de trabajo de 10x/0.32 de un microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales) sobre el DRG expuesto para obtener imágenes (Figura 1G).</li>
	<li>Capture pilas z de lapso de tiempo del DRG L-6 intacto con una resolución de 25 μm/paso y 512 x 512 o 1024 x 1024 píxeles. La duración de un escaneo de pila de todo el DRG varía de 5 a 15 segundos en función de factores como la perpendicularidad de la posición del DRG a la lente del objetivo, la profundidad y la velocidad de cada paso de escaneo y la resolución de la imagen.</li>
	<li>Realice la exploración XYZT del DRG con 4-8 pilas, que incluyen 1-3 estados basales, 2-3 estímulos de acupuntura o distensión colorrectal visceral (CRD) y 1-2 estados posteriores a los estímulos.</li>
</ol>
8. Acupuntura/estímulos viscerales e imágenes
<ol>
	<li>Aplique estímulos de cepillado o pellizco en las áreas de la espalda baja, la extremidad posterior o la pata trasera del animal para evaluar el campo receptivo más sensible de las neuronas DRG fotografiadas (Figura 1H).</li>
	<li>Administre estímulos de acupuntura manualmente o con un estimulador de puntos de acupuntura y nervios disponible en el mercado (Figura 1F) (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Inducir estímulos viscerales mediante el uso de la distensión colorrectal (CRD) con un manómetro de aire de fabricación propia (Figura 1H). 
	NOTA: Pruebe el campo receptivo más sensible de las neuronas DRG de las que se obtienen imágenes cepillando o pellizcando las áreas receptivas de la DRG lumbar-6. Si estos estímulos causan cambios de fluorescencia durante el registro de la pila XYZT, seleccione puntos de acupuntura en estas áreas, como el punto de acupuntura lumbar BL25 (Dachangshu)18. Elija puntos de acupuntura (como se muestra en Figura 2) que tengan la piel y el músculo dentro del campo receptivo de inervación lumbar-6.</li>
</ol>
9. Análisis y procesamiento de datos
<ol>
	<li>Evaluar las respuestas evocadas al calcio utilizando un microscopio confocal midiendo el aumento de la fluorescencia verde del GCaMP neuronal al unirse al calcio intracelular después de estímulos somáticos o viscerales.</li>
	<li>Trace manualmente las células visibles y determine el tamaño de la célula y la intensidad relativa de fluorescencia utilizando el software de imágenes (Fiji, consulte la tabla de materiales). Defina las neuronas pequeñas, medianas y grandes con diámetros de soma de <20 μm, 20 a 30 μm y >30 μm, respectivamente, basándose en estudios previos17,19.</li>
	<li>Exprese la intensidad de fluorescencia como una relación entre el aumento de la fluorescencia evocada máxima y el nivel basal (ΔF/F0) o una relación entre la fluorescencia evocada máxima y el nivel basal (Ft/F0), donde F0 representa la intensidad de fluorescencia máxima medida durante el período de referencia.</li>
	<li>Mida el porcentaje de neuronas activadas y la intensidad de los transitorios de calcio evocados para evaluar los cambios en la capacidad de respuesta neuronal después de estímulos somáticos o CRD.</li>
	<li>Defina la activación de una célula como un aumento en la intensidad de fluorescencia (ΔF) ≥30% de la línea de base (F0). 
	NOTA: Antes de trazar las celdas visibles, ajuste el brillo de las imágenes al nivel máximo para ayudar a identificar los bordes de las celdas. No rastree las células si hay alguna incertidumbre. Revise la película grabada hacia adelante y hacia atrás para asegurarse de que no se pase por alto ninguna celda.</li>
</ol>

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

<ol><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+tactile+acuity+in+chronic+low+back+pain+is+linked+with+structural+neuroplasticity+in+primary+somatosensory+cortex+and+is+modulated+by+acupuncture+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Reduced tactile acuity in chronic low back pain is linked with structural neuroplasticity in primary somatosensory cortex and is modulated by acupuncture therapy.</a> Neuroimage. 217, 116899(2020).</li>
<li>Wei, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+activates+inhibitory+neural+circuits+in+the+somatosensory+cortex+to+relieve+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture activates inhibitory neural circuits in the somatosensory cortex to relieve neuropathic pain.</a> iScience. 24 (2), 102066(2021).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Referred+somatic+hyperalgesia+mediates+cardiac+regulation+by+the+activation+of+sympathetic+nerves+in+a+rat+model+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Referred somatic hyperalgesia mediates cardiac regulation by the activation of sympathetic nerves in a rat model of myocardial ischemia.</a> Neuroscience Bulletin. 38 (4), 386-402 (2022).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+hypersensitivity+as+an+indicator+of+visceral+inflammation+via+c-nociceptor+axon+bifurcation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cutaneous hypersensitivity as an indicator of visceral inflammation via c-nociceptor axon bifurcation.</a> Neuroscience Bulletin. 37 (1), 45-54 (2021).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+in+population+of+dorsal+root+ganglion+neurons+unravels+novel+mechanisms+of+visceral+pain+sensitization+and+referred+somatic+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging in population of dorsal root ganglion neurons unravels novel mechanisms of visceral pain sensitization and referred somatic hypersensitivity.</a> Pain. 162 (4), 106801081(2021).</li>
<li>Huang, T. Y., Belzer V Fau - Hanani, M., Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+dorsal+root+ganglia%3A+possible+contribution+to+visceral+pain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in dorsal root ganglia: possible contribution to visceral pain.</a> European Journal of Pain. 14 (1), 49.e1-49.e11 (2010).</li>
<li>Wang, Y. L., Su, Y. S., He, W., Jing, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+relieved+visceral+and+referred+hindpaw+hypersensitivity+in+colitis+rats+by+inhibiting+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+sixth+lumbar+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture relieved visceral and referred hindpaw hypersensitivity in colitis rats by inhibiting tyrosine hydroxylase expression in the sixth lumbar dorsal root ganglia.</a> Neuropeptides. 77, 101957(2019).</li>
<li>Weng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+diminishes+P2X2+and+P2X3+purinergic+receptor+expression+in+dorsal+root+ganglia+of+rats+with+visceral+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture diminishes P2X2 and P2X3 purinergic receptor expression in dorsal root ganglia of rats with visceral hypersensitivity.</a> Neural Regeneration Research. 8 (9), 802-808 (2013).</li>
<li>Spencer, N. J., Hibberd, T. J., Lagerström, M., Otsuka, Y., Kelley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+pain+-+Novel+approaches+for+optogenetic+control+of+spinal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visceral pain - Novel approaches for optogenetic control of spinal afferents.</a> Brain Research. 1693 (Pt B), 159-164 (2018).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+single-fiber+recording+and+intact+dorsal+root+ganglion+with+attached+sciatic+nerve+to+examine+the+mechanism+of+conduction+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo single-fiber recording and intact dorsal root ganglion with attached sciatic nerve to examine the mechanism of conduction failure.</a> Journal of Visualized Experiments. 150, e59234(2019).</li>
<li>Ma, C., Nie, H., Gu, Q., Sikand, P., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+responses+of+cutaneous+C-mechanosensitive+neurons+in+mouse+to+punctate+chemical+stimuli+that+elicit+itch+and+nociceptive+sensations+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo responses of cutaneous C-mechanosensitive neurons in mouse to punctate chemical stimuli that elicit itch and nociceptive sensations in humans.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (1), 357-363 (2012).</li>
<li>Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+pain+mechanisms+by+calcium+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches.</a> Neuroscience Bulletin. 34 (1), 194-199 (2018).</li>
<li>Yao, L., Ye, Q., Liu, Y., Yao, S., Yuan, S., Xu, Q., Deng, B., Tang, X., Shi, J., Luo, J., Wu, J., Wu, Z., Liu, J., Tang, C., Wang, L., Xu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+improves+swallowing+function+in+a+post-stroke+dysphagia+mouse+model+by+activating+the+motor+cortex+inputs+to+the+nucleus+tractus+solitarii+through+the+parabrachial+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture improves swallowing function in a post-stroke dysphagia mouse model by activating the motor cortex inputs to the nucleus tractus solitarii through the parabrachial nuclei.</a> Nat Commun. 14 (1), 810 PMID: 36781899; PMCID: PMC9925820 (2023).</li>
<li>Tian, D., Liu, B., Huang, S., Shi, W., Tian, Y., Yang, Y., Zhang, D., Zhang, Z., Bu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+Ileus+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postoperative Ileus Murine Model.</a> J Vis Exp. (209), PMID: 39072642 (2024).</li>
<li>Zhu, X., Li, C., Afridi, S. K., Zu, S., Xu, J. W., Quanquin, N., Yang, H., Cheng, G., Xu, Z. E90 subunit vaccine protects mice from Zika virus infection and microcephaly. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+X+%22Acta+Neuropathol+Commun%22">Acta Neuropathol Commun</a>. 6 (1), 77 PMID: 30097059; PMCID: PMC6086021 (2018).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+cluster+firing%2C+a+distinct+form+of+sensory+neuron+activation%2C+drives+spontaneous+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain.</a> Neuron. 110 (2), 209-220 (2022).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12+receptor+as+a+new+target+for+electroacupuncture+relieving+comorbidity+of+visceral+pain+and+depression+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">P2Y12 receptor as a new target for electroacupuncture relieving comorbidity of visceral pain and depression of inflammatory bowel disease.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 139(2021).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron-specific+GPCR+Mrgprs+are+itch+receptors+mediating+chloroquine-induced+pruritus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron-specific GPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-induced pruritus.</a> Cell. 139 (7), 1353-1365 (2009).</li>
<li>Chen, G. S., Su, X. L., Liu, Q., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+moxibustion+in+treatment+of+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Acupuncture-Moxibustion%22%5BJournal%5D)">Research progress of moxibustion in treatment of irritable bowel syndrome.</a> World Journal of Acupuncture-Moxibustion. 31 (02), 136-140 (2021).</li>
<li>Scanziani, M., MHäusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+descending+facilitation+of+spinal+sensory+excitatory+transmission+from+the+anterior+cingulate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Top-down descending facilitation of spinal sensory excitatory transmission from the anterior cingulate cortex.</a> Nature Communications. 9 (1), 1886(2018).</li>
<li>Cartarozzi, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+motoneurons+and+adjacent+glia+in+the+ventral+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of motoneurons and adjacent glia in the ventral spinal cord.</a> Journal of Neuroscience Methods. 299, 8-15 (2018).</li>
<li>Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+neuronal+ensembles+in+networks+of+primary+sensory+neurons+in+intact+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia.</a> Journal of Visualized Experiments. 192, e64826(2023).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, e2760(2012).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+dorsal+root+ganglia+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice.</a> Nature Communications. 10 (1), 3087(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Se cree que la analgesia de acupuntura está modulada por procesos integradores en el GRD, que implican una interacción entre los impulsos aferentes de las regiones de dolor y los impulsos de los puntos de acupuntura. Aquí, describimos un procedimiento elaborado para imágenes L6 DRG. Las ventajas de las imágenes son múltiples, incluida una resolución espacial notable, la posibilidad de obtener imágenes de alta eficiencia de grandes áreas de neuronas simultáneamente y la capacidad de monitorear subtipos celulares específic...

<a href="https://app.jove.com/t/6596">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/65975">10.3791/65975</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/65975">In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons&#39; Response to Somatic and Visceral Stimuli</a>. The Authors section was updated.

Erratum: In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

La acupuntura, una parte integral de la medicina tradicional china, ha ganado reconocimiento mundial principalmente por su eficacia en el manejo del dolor, incluido el alivio del dolor visceral crónico1. Durante las últimas décadas, nuestro conocimiento de los mecanismos nerviosos centrales que subyacen a la analgesia acupuntura ha experimentado un crecimiento considerable1,2. Sin embargo, se ha prestado poca atención a la exploración de los roles funcionales de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) en la inducción del efecto analgésico de la acupuntura en la nocicepción visceral. Los estudios de nocicepción visceral y analgésicos de acupuntura se llevan a cabo potencialmente en neuronas sensoriales primarias utilizando técnicas electrofisiológicas u otros métodos de registro neuronal3,4. Dicha investigación ayuda a comprender la relación entre la entrada somática y visceral de tejidos u órganos diana específicos, ofreciendo información valiosa sobre las afecciones relacionadas con la acupuntura, el dolor visceral, la regulación del sistema nervioso autónomo y las afecciones médicas relacionadas.
Siendo las neuronas de primer orden en el sistema somatosensorial, las neuronas en DRG se denominan neuronas sensoriales primarias que tienen un papel importante en la transducción de información sobre el entorno externo, así como el estado interno, en señales eléctricas y en la transmisión de señales al sistema nervioso central (SNC). Numerosos estudios han sugerido que la nocicepción visceral fue transmitida predominantemente por neuronas sensoriales cuyos cuerpos celulares están en el DRG5,6. Aunque numerosas investigaciones han dilucidado el mecanismo celular y molecular de las neuronas DRG en el efecto analgésico inducido por la acupuntura sobre el dolor visceral7,8, existe muy poca literatura sobre sus características funcionales debido a dificultades técnicas9. Se pueden utilizar varios métodos para registrar la actividad neuronal en el DRG, como el registro de fibras periféricas, el registro de electrofisiología de una sola célula y las imágenes de calcio in vivo, para registrar los patrones y propiedades de los potenciales de acción transmitidos a lo largo de los axones10. El registro de electrodos de vidrio ligeramente parcheados del DRG ha sido una de las técnicas más utilizadas para investigar la correlación entre las actividades neuronales y diferentes estímulos in vivo11. Sin embargo, los métodos tradicionales, como el registro electrofisiológico, no pueden examinar de manera eficiente un número suficiente de células y distintos subtipos celulares específicos para identificar neuronas que responden visceralmente in vivo.
Además de codificar la sensación periférica, las neuronas DRG desempeñan un papel importante en la transmisión de señales de acupuntura al sistema nervioso central. El registro electrofisiológico tradicional ya se ha aplicado ampliamente para explorar la regulación de la acupuntura en las actividades anormales de las neuronas DRG inducidas por el dolor patológico11. Es necesario observar los segmentos apropiados de DRG en relación con la inervación sensorial. En general, se observó que la DRG lumbar (L) 6 investigaba la modulación del colon4.
Los avances recientes en el desarrollo de métodos ópticos y genéticos permiten investigar simultáneamente la actividad de grandes poblaciones de neuronas marcadas genéticamente12. Sin embargo, todavía hay una falta de métodos detallados de imágenes de calcio para monitorear la actividad neuronal en DRG bajo estimulación visceral y somática. Por lo tanto, este protocolo explica los procedimientos para la observación in vivo de la capacidad de respuesta de las neuronas L6 DRG a la estimulación intracolónica y de acupuntura. El método descrito aquí también se puede utilizar para detectar características de las neuronas sensoriales somáticas y viscerales.
La amplia aplicación y promoción de las imágenes de calcio proporcionan una herramienta muy eficaz y práctica para la investigación de la acupuntura. Teniendo en cuenta las ventajas de las imágenes de calcio mencionadas anteriormente, este método debería haberse extendido y aplicado en la investigación de la acupuntura. Sin embargo, la utilización de imágenes de calcio en la investigación de la acupuntura sigue siendo relativamente poco común. La razón principal de esta limitación puede ser la dificultad de los procedimientos operativos y de registro. El objetivo principal de este artículo es dar una visión general de algunos puntos críticos en la realización de registros de imágenes de calcio de las neuronas L6 DRG en ratones. Lo más importante es que esperamos promover el avance y el desarrollo de la investigación en acupuntura mediante el uso de esta herramienta de vanguardia in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sistema de anestesia&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Confocal</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 8</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura de CC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura de CC Almohadilla térmica</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>Instituto Nacional de Salud N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramientas</td> <td>de ciencia fina14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gelatina</td><td>Coltene</td><td>274-007</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Han' s Estimulador nervioso de punto de acupuntura</td><td>Jason Scientific</td><td>HANS-200A</td><td></td></tr><tr><td>Cánula de intubación</td><td>Aparato Harward</td><td>73-2737</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD</td><td>R510</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>N/A Ratones</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-cre</td> Universidad <td>Johns Hopkins</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-GCaMP6s&nbsp; ratones (AI96)</td><td>Jax Laboratory</td><td>28866</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de columna</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte hechas</td> a medida <td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15019-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imágenes de calcio de la respuesta de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal a estímulos somáticos y viscerales

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

Se describe una técnica para exponer quirúrgicamente el ganglio de la raíz dorsal (GRD) del lumbar-6 en un ratón de laboratorio vivo y anestesiado, junto con el protocolo para la obtención de imágenes de calcio in vivo de la GRD expuesta en respuesta a diversos estímulos viscerales y somáticos. Se utilizaron ratones Pirt-GCaMP6s o ratones C57BL6 inyectados intratecalmente con virus AAV empaquetados con GCaMP6 para capturar transitorios de Ca2+. La amplitud de estos transitorios indica sensibilidad a modalidades sensoriales específicas. Las fibras aferentes se originan en los órganos internos, con cuerpos celulares neuronales primarios en los ganglios espinales o vagales. Los estudios sobre la nocicepción visceral y la analgesia acupuntura pueden realizarse potencialmente en neuronas sensoriales primarias utilizando tecnologías de imagen avanzadas como las imágenes de calcio in vivo, lo que permite el registro de los conjuntos de actividad neuronal en el animal intacto durante la estimulación o la intervención. Se registraron las respuestas de los conjuntos de neuronas DRG a los estímulos somáticos y viscerales aplicados a sus correspondientes campos receptivos. Esta técnica ilustra cómo las poblaciones neuronales reaccionan a varios tipos de estímulos somáticos y viscerales. Es posible comparar exhaustivamente las respuestas del conjunto neuronal a diferentes estímulos, lo cual es un enfoque particularmente valioso en la investigación sobre el dolor visceral y los mecanismos segmentarios de la estimulación somática, como la acupuntura.

Siguiendo el protocolo anterior, se expuso el ganglio de la raíz dorsal lumbar-6 de un ratón transgénico Pirt-GCaMP6s, y se aplicaron estímulos viscerales de DRCC o estímulos somáticos de acupuntura al colon-recto o al campo receptivo. Este experimento tuvo como objetivo observar el número y los tipos de neuronas activadas por diferentes estímulos viscerales de DRCC y estímulos somáticos.
Como se muestra en Figura 2A, la mayoría de las neuronas en el ganglio dorsa...

El presente protocolo describe imágenes de calcio in vivo para medir las respuestas de conjuntos de neuronas lumbar-6 DRG a estímulos somáticos y viscerales. Se pueden hacer comparaciones exhaustivas entre las neuronas que responden a diferentes estímulos. Este protocolo es valioso para investigar los mecanismos del dolor visceral y la estimulación somática, como la acupuntura.

in vivo Imágenes de calcio de la respuesta de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal a estímulos somáticos y viscerales

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

in-vivo-calcium-imaging-dorsal-root-ganglia-neurons-response-to

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Shannonhouse, J., et al. Imágenes de calcio in vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios de raíz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). El video muestra una técnica de imagen de calcio in vivo para monitorear la actividad neuronal en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de un ratón transgénico. Las neuronas DRG expresan un indicador de calcio que aumenta la intensidad de la fluorescencia al unirse al calcio. Los estímulos...

Imágenes de calcio in vivo de conjuntos neuronales en los ganglios de la raíz dorsal intacta de un ratón

Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y...

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten un análisis robusto a nivel poblacional de la señalización de las neuronas sensoriales. Aquí, hemos desarrollado un enfoque novedoso que permite la visualización in vivo de GECI de la actividad de las neuronas de los ganglios trigéminos de rata.

En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

Este estudio presenta una manipulación quirúrgica para exponer el T-DRG en ratones anestesiados para la obtención de imágenes de calcio in vivo , junto con registros sincrónicos de ECG. Este método representa una herramienta de vanguardia para estudiar la estimulación de los nervios eléctricos periféricos y las entradas de los órganos viscerales torácicos, así como sus interacciones a nivel sensorial primario.

Imágenes de calcio y registro de ECG de los ganglios de la raíz dorsal torácica (DRG) in vivo para el estudio de la estimulación de los nervios periféricos

Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos

Se presenta un método de inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal. El enfoque puede ser utilizado para identificar sitios específicos de factor de transcripción vinculante y la modificación epigenética de las histonas y el ADN importantes para la regeneración de los axones dañados, tanto en el sistema nervioso periférico y central.

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

Ganglios de la raíz dorsal (DRG) son estructuras que contienen las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. Cuando disociado, pueden ser co-cultivadas con células madre-SC como derivadas de tejido adiposo (ASC), que proporciona un valioso modelo para estudiar la regeneración in vitro en los nervios y la mielinización, imitando el entorno en vivo en el sitio de la lesión.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Este protocolo describe el aislamiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) aisladas de ratas y el cultivo de neuronas DRG en un sistema de cultivo celular estático preestirado para mejorar la alineación de los axones, con el posterior cocultivo de células de Schwann (SC) para promover la mielinización.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo en neuronas del ganglio de la raíz dorsal lumbar-6 de ratones para estudiar respuestas a estímulos somáticos y viscerales. Este método permite analizar los mecanismos del dolor visceral y los efectos analgésicos de la acupuntura.

in vivo Imágenes de calcio de la respuesta de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal a estímulos somáticos y viscerales

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