Name: Análisis cualitativo y cuantitativo de la producción de sideróforos a partir de Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Aprende a cuantificar sideróforos, pioverdina y pioquelina en Pseudomonas aeruginosa mediante análisis espectrofotométrico. Este protocolo simplificado facilita el estudio de factores de virulencia bacterianos.

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Los autores agradecen la financiación de DBT - Programa de Enseñanza de Biotecnología, DBT - Programa BUILDER y FIST. MR agradece la beca recibida de SHODH. HP agradece la beca recibida del CSIR.

Todos los aislados bacterianos de P. aeruginosa se obtuvieron de laboratorios de microbiología médica de Vadodara y Jaipur, India. Todos los aislados clínicos seleccionados se manipularon en el Gabinete de Bioseguridad (BSL2) y se tuvo sumo cuidado al manipular los aislados bacterianos durante los experimentos. Los detalles comerciales de todos los reactivos/soluciones se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Preparación del colorante de sulfonato de cromo azurol (CAS) y medios de agar
<ol><li>Prepare el colorante CAS (100 ml) con la siguiente composición:<ol><li>Disolver 60 mg de CAS en 50 ml de agua destilada (Solución 1).</li>
		<li>Disolver 2,7 mg de FeCl3·6H2O en 10 mL de HCl 10 mM (Solución 2).</li>
		<li>Disolver 73 mg de bromuro de cetrimonio (HDTMA) en 40 ml de agua destilada (Solución 3).</li>
		<li>Mezcle cuidadosamente la Solución 1, la Solución 2 y la Solución 3. Guárdalo en una botella de vidrio.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare el agar CAS siguiendo los pasos a continuación:<ol><li>Agregue 100 ml de solución salina MM9 a 750 ml de agua destilada.</li>
		<li>Disolver 32,24 g de ácido libre de piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES).</li>
		<li>Añadir 15 g de agar agar. Esterilizarlo en autoclave y dejar que se enfríe.</li>
		<li>Añadir a la mezcla 30 ml de solución estéril de ácido Casamino y 10 ml de solución estéril de glucosa al 20%.</li>
		<li>Agregue 100 ml de tinte CAS, mezcle y viértalo en condiciones asépticas. NOTA: La preparación de los medios MM9, la solución de ácido Casamino y la 8-hidroxiquinolina se proporcionan en el Archivo Suplementario 1. El tampón PIPES es sensible al pH. No se disolverá hasta que se alcance un pH de 5,6. Asegúrese de que el pH se controle constantemente porque cuando PIPES comience a disolverse en agua, disminuirá aún más el pH. Extracto de ácido Casamino con el mismo volumen de 8-hidroxiquinolina al 3% disuelto en cloroformo. Deje la solución inmiscible a 4 °C durante unos 20 minutos y recoja con cuidado la fase superior de la solución sin alterar la fase inferior.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Análisis cualitativo de la producción de sideróforos
<ol><li>Ajuste el diámetro exteriorde 600 nm a 0,2 durante 24 h de cultivo de P. aeruginosa.</li>
	<li>Usando un asa de alambre estéril, raye el cultivo bacteriano en una placa de agar CAS.</li>
	<li>Incubar a 30 °C durante 24 h. NOTA: Se puede utilizar agua de peptona o solución salina normal al 0,8% para diluir el cultivo bacteriano. Si no se observa crecimiento bacteriano a las 24 h, incubar las placas CAS durante 48 a 72 h.</li>
</ol>3. Estimación cuantitativa de sideróforos totales
<ol><li>Vuelva a inocular cultivos de P. aeruginosa cultivados durante 24 h en medios acuosos de peptona después de ajustar el OD600 nm a 0,25, e incube a 30 °C durante 48 h.</li>
	<li>Después de 48 h, centrifugar el cultivo bacteriano a 4650 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de la centrifugación, agregue 100 μL de sobrenadante libre de células a una placa de microtitulación de 96 pocillos y agréguele 100 μL de colorante CAS.</li>
	<li>Cubra la placa con papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante 20 min.</li>
	<li>Después de la incubación, tome lecturas espectrofotométricas a 630 nm.</li>
	<li>Calcular los resultados obtenidos para la cuantificación de los sideróforos totales como Unidad Porcentual de Sideróforos (PSU). NOTA: La fuente de alimentación se puede calcular como: [(Ar - As)/Ar] x 100 donde, Ar = absorbancia de la referencia a 630 nm, As = absorbancia del sobrenadante libre de células de la muestra. Como referencia, se debe agregar colorante CAS a los medios de agua de peptona no inoculados. Llene toda la cristalería, como tubos de ensayo, frascos, etc., con HCl 6 M durante 2 h y enjuáguela dos veces con agua destilada para eliminar cualquier rastro de hierro en ella.</li>
</ol>4. Estimación cuantitativa de la pioverdina
<ol><li>Vuelva a inocular cultivos de P. aeruginosa cultivados durante 24 h en medios acuosos de peptona después de ajustar la DO600 nm a 0,25 e incube a 30 °C durante 48 h.</li>
	<li>Después de 48 h, mida el diámetro exterior de600 nm del crecimiento bacteriano antes de continuar.</li>
	<li>Centrifugar el cultivo bacteriano a 4650 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de la centrifugación, agregue 100 μL de sobrenadante libre de células a una placa de microtitulación de 96 pocillos y agregue 100 μL de 50 mM de Tris-HCl (pH 8.0).</li>
	<li>Tome lecturas espectrofotométricas a405 nm de diámetro exterior.</li>
</ol>5. Extracción de piochelin y espectrofotometría
<ol><li>Vuelva a inocular cultivos de P. aeruginosa cultivados durante 24 h en medio King's B (Archivo suplementario 1) después de ajustar el DO600 nm a 0,25 e incube a 30 °C durante 24 h.</li>
	<li>Después de 24 h, tomar 100 mL de cultivo y centrifugar a 4650 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de la centrifugación, agregue 5 ml de ácido cítrico 1 M al sobrenadante. Extraer dos veces con 50 mL de acetato de etilo.</li>
	<li>Filtrar la fase orgánica con sulfato de magnesio a través de un filtro de jeringa. Almacenar la fase orgánica filtrada a -20 °C.</li>
	<li>Tome lecturas espectrofotométricas a 320 nm. NOTA: Como la pioquelina es un compuesto altamente inestable a temperatura ambiente, realice el proceso de extracción en hielo. Utilice una jeringa estéril de 50 ml para separar el filtro. Coloque algodón en la punta de la jeringa y agregue 1 g de sulfato de magnesio sobre él. Fije un filtro de jeringa estéril en la punta de la jeringa y recoja el filtrado en un tubo estéril.</li>
</ol>

Evaluación de la producción de sideróforos a partir de aislados de Pseudomonas aeruginosa

<ol><li>Wang, J., Pontopolous, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+cellulatar+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron cellulatar metabolism.</a> Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).</li>
<li>Schalk, I., Perraud, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+its+multiple+strategies+to+access+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron.</a> Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).</li>
<li>Ghssein, G., Ezzeddine, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+metallophores%3A+Pyoverdine%2C+pyochelin+and+pseudopaline%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline.</a> Biology. 11 (12), 1711(2022).</li>
<li>Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+iron+homeostasis+in+pseudomonas+aeruginosa+and+emerging+therapeutics+directed+to+disrupt+this+vital+process%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process.</a> Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).</li>
<li>Dingemans, P., Cornelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+adapts+its+iron+uptake+strategies+in+function+of+the+type+of+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).</li>
<li>Lin, J., Cheng, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudomonas+quinolone+signal+%28pqs%29%3A+Not+just+for+quorum+sensing+anymore%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).</li>
<li>Sass, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermicrobial+interaction%3A+Aspergillus+fumigatus+siderophores+protect+against+competition+by+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).</li>
<li>Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+production+by+pseudomonas+aeruginosa+exposed+to+metals+or+an+oxidative+stress+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Applications%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent.</a> Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+From+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+the+nonribosomal+peptide+synthetase+pvdd+from+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).</li>
<li>Geum-Jae-Jeong,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+virulence+attenuation+by+inhibiting+siderophore+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).</li>
<li>Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+between+apparently+redundant+iron-uptake+mechanisms+benefits+bacteria+in+changeable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments.</a> Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).</li>
<li>Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isochorismate+synthase+%28pcha%29%2C+the+first+and+rate-limiting+enzyme+in+salicylate+biosynthesis+of+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).</li>
<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+blue+agar+cas+assay+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of blue agar cas assay for siderophore detection.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).</li>
<li>Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+microplate+method+%28biolog+mt2%29+for+detection+of+fusarium+fungicides+resistance%2Fsensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).</li>
<li>Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+pyoverdines%2C+pseudomonas+primary+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).</li>
<li>Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+metal+specificity+of+the+pseudomonas+aeruginosa+pyoverdine-iron+uptake+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway.</a> Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).</li>
<li>Brandel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+siderophore+of+pseudomonas+aeruginosa%3A+Physicochemical+characterization+of+the+iron%28iii%29%2C+copper+%28ii%29+and+zinc+%28ii%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes.</a> Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).</li>
<li>Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).</li>
<li>Cunrath, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogen+pseudomonas+aeruginosa+optimizes+the+production+of+the+siderophore+pyochelin+upon+environmental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges.</a> Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).</li>
<li>Ji, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+sensitive+LC%2FMS%2FMS+method+for+quantification+of+pyochelin+in+human+sputum+samples+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients.</a> Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).</li>
<li>Visaggio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+luminescent+biosensor+for+the+microvolumetric+detection+of+the+pseudomonas+aeruginosa+siderophore+pyochelin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).</li>
<li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-bases+iron+acquisition+and+pathogen+control%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).</li>
<li>Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+and+syntheses+of+siderophores%2C+microbial+iron+chelators%2C+and+analogs+as+potential+drug+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents.</a> Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo permite a los investigadores cuantificar los sideróforos totales y dos sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina y pioquelina, a partir del sobrenadante libre de células bacterianas. En el ensayo de placas de agar CAS, el colorante CAS y los iones Fe3+ forman un complejo. Cuando las bacterias producen sideróforos, apagan los iones Fe3+ del complejo CAS-Fe3+, lo que provoca un cambio de color alrededor del crecimiento bacteriano. Este cambio da como resultado un halo naranja claro alrededor del crecimiento bacteriano14,15. Si bien las bacterias se pueden rayar directamente en las placas de agar CAS, los resultados generales pueden verse afectados. Rayar un gran número de células bacterianas podría crear un amplio halo naranja alrededor del crecimiento bacteriano, mientras que el uso de menos células bacterianas podría dar como resultado una zona estrecha y despejada. Para solucionar esto, rayamos un número uniforme de células bacterianas ajustando el OD600. Las bacterias fastidiosas pueden mostrar resultados en 24 horas, mientras que las bacterias de crecimiento lento pueden tardar más de 72 horas en demostrar la producción de sideróforos.
Para la determinación cuantitativa de los sideróforos totales, se empleó inicialmente la espectroscopia clásica, que requiere un volumen significativo de sobrenadante para la detección de sideróforos, lo que la hace poco práctica. La cuantificación de los sideróforos totales se lleva a cabo ahora utilizando una placa de 96 pocillos con un ensayo CAS modificado. Este enfoque ha dado lugar a una reducción en el uso de reactivos, sobrenadante bacteriano, tiempo y una mayor precisión en comparación con los métodos espectroscópicos tradicionales16. Otros estudios también han reportado el uso de placas de microtitulación como un método más eficiente y que ahorra tiempo17. La cuantificación de los sideróforos totales mediante una placa de microtitulación ha demostrado ser un enfoque eficaz. En este estudio, se seleccionaron cultivos bacterianos de 48 horas de antigüedad cultivados en medios libres de hierro para su examen. También se realizó un estudio comparativo para evaluar la producción de sideróforos en diferentes medios de crecimiento, como el caldo Luria, el caldo Luria (extraído con 8-hidroxiquinoleína al 3%), el medio King's B (extraído con 8-hidroxiquinoleína al 3%) y el medio acuoso de peptona (extraído con 8-hidroxiquinoleína al 3%). Se observó que el medio acuoso de peptona exhibió la mayor cantidad de producción de sideróforos, por lo que se seleccionó para experimentos posteriores. En la Figura Suplementaria 1 se incluye un gráfico que muestra la producción de sideróforos en diferentes medios de crecimiento.
La pioverdina puede detectarse y cuantificarse mediante lecturas espectrofluorimétricas, pero solo se sabe que la pioverdina presenta fluorescencia. La pioverdina en complejo con iones Fe3+ no presenta fluorescencia18,19. Para la detección y cuantificación de la pioverdina, se seleccionaron cultivos bacterianos de 48 horas de antigüedad para su estudio. Se sabe que P. aeruginosa produce pioquelina en condiciones iniciales de falta de hierro y cambia a la producción de pioverdina después de la exposición a condiciones severas de estrés ferropérico. Se ha demostrado que la pioverdina puede quelar otros cationes metálicos, como el aluminio, el galio, el manganeso y el cromo, pero solo el hierro se transporta con éxito a la membranacelular.
Al igual que los sideróforos totales y la pioverdina, la pioquelina no se puede cuantificar directamente a partir del sobrenadante libre de células y debe extraerse utilizando diclorometano20. El diclorometano es inmiscible con el sobrenadante libre de células y forma una capa separada en la parte inferior. En este estudio, se probaron varios medios nutritivos, incluido el caldo Luria, el agua de peptona y los medios de ácido Casamino, pero se obtuvo una cantidad significativa de piochelin del medio King's B. Si bien Hoegy et al. habían utilizado medios CAA en su protocolo, los modificamos con medios B de King, ya que los medios CAA no admitían el crecimiento bacteriano21. El método se modificó aún más mediante la extracción de medios nutritivos con 8-hidroxiquinoleína para eliminar cualquier residuo de hierro del medio, creando un medio deficiente en hierro. Además, se descubrió que el tiempo de incubación afectaba significativamente a la producción de pioquelina. Dumas et al. demostraron que P. aeruginosa pasa de la producción de piochelin a la de pioverdina en condiciones severas de limitación de hierro12. En este estudio, la extracción y detección de pioquelina se realizó a partir de cultivos bacterianos de 24 h de edad, ya que no se detectó piochelin en cultivos de 48 h. El volumen del sobrenadante también afecta a la detección de pioquelina, por lo que se utilizaron 100 mL de sobrenadante libre de células para la extracción. Además, la producción de pioquelina fue significativamente mayor en los aislados MR1, TL7 y J3, posiblemente debido a cepas bacterianas que son incapaces de producir pioverdina a pesar de tener potentes quelantes de hierro22.
Ji et al. introdujeron un enfoque novedoso y sensible para la cuantificación de piochelina, validándolo mediante LC/MS/MS. Sin embargo, este método solo se aplicó a aislados de P. aeruginosa del esputo de pacientes con fibrosis quística. LC/MS/MS, al ser una configuración costosa, puede no ser asequible para la mayoría de los laboratorios23. Visaggio et al. desarrollaron un biosensor bioluminiscente basado en células enteras, que permite una cuantificación rápida, sensible y de un solo paso de piochelin. Sin embargo, este método no puede proporcionar una cuantificación para los sideróforos totales y la pioverdina24.
Los sistemas de absorción de hierro sideróforo podrían tener una aplicación antimicrobiana en la administración de fármacos para bacterias multirresistentes, ya que desempeñan un papel crucial en la supervivencia y virulencia bacterianas. Este enfoque puede ofrecer una nueva forma de combatir las bacterias multirresistentes25. Los fármacos que no pueden penetrar en la membrana celular bacteriana pueden unirse a un sideróforo, y el complejo Fe-sideróforo resultante puede transportarse dentro de la membrana bacteriana26.

Los organismos requieren hierro para realizar diversas funciones vitales, como el transporte de electronesy la replicación del ADN. Se sabe que Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista gramnegativo, posee una variedad de factores de virulencia para establecer la infección en el huésped, entre los cuales uno de los mecanismos es la formación de sideróforos2. Durante las condiciones de agotamiento del hierro, P. aeruginosa libera moléculas especializadas llamadas sideróforos, que apagan el hierro del entorno circundante. Los sideróforos quelan el hierro extracelularmente, y el complejo férrico-sideróforo resultante se transporta activamente de vuelta a la célula3.
Se sabe que P. aeruginosa produce dos sideróforos, pioverdina y piochelina. Se sabe que la pioverdina tiene una mayor afinidad quelante del hierro (1:1), mientras que se sabe que la pioquelina tiene una menor afinidad quelante del hierro (2:1)4. La pioquelina también se denomina sideróforo secundario porque tiene una menor afinidad quelantede hierro 5. La producción y regulación de sideróforos se controlan activamente mediante sistemas de detección de quórum (QS) en P. aeruginosa6.
Además del enfriamiento del hierro, los sideróforos también están involucrados en la regulación de los factores de virulencia y juegan un papel activo en la formación de biopelículas7. Los sideróforos desempeñan funciones cruciales adicionales, incluida la participación en la señalización celular, la defensa contra el estrés oxidativo y la facilitación de las interacciones entre las comunidades microbianas8. Los sideróforos generalmente se clasifican en función de los grupos funcionales específicos a través de los cuales quelan el hierro. Los tres ligandos bidentados primarios en esta clasificación son catecolato, hidroxamato y α-hidroxicarboxilato3. Las pioverdinas son características distintivas de especies fluorescentes de Pseudomonas como P. aeruginosa y P. fluorescens5. Consisten en un cromóforo fluorescente verde mixto acoplado a un oligopéptido que contiene 6-12 aminoácidos. Varias péptidos sintetasas no ribosómicas (NRPs) están implicadas en su síntesis9. Cuatro genes implicados en la producción y regulación de la pioverdina son pvdL, pvdI, pvdJ y pvdD10. La pioverdina también es responsable de la infección y la virulencia en los mamíferos11. Se observa que P. aeruginosa produce pioquelina en condiciones moderadas de limitación de hierro, mientras que la pioverdina se produce durante ambientes severos de limitación de hierro12. Dos operones implicados en la producción de pioquelina son pchDCBA y pchEFGHI13. Se observa que en presencia de piocianina, la pioquelina (catecolato) induce daño oxidativo e inflamación y genera radicales hidroxilo, que son dañinos para los tejidos del huésped11.
El ensayo de sulfonato de cromo azurol (CAS) es ampliamente adoptado debido a su amplitud, alta sensibilidad y mayor conveniencia en comparación con los ensayos microbiológicos, que, aunque sensibles, pueden ser demasiado específicos14. El ensayo CAS se puede realizar en superficies de agar o en una solución. Se basa en el cambio de color que se produce cuando el ion férrico pasa de su complejo azul intenso a naranja. El ensayo colorimétrico CAS cuantifica el agotamiento del hierro de un complejo ternario Fe-CAS-surfactante. Este complejo en particular, que consiste en metal, colorante orgánico y tensioactivo, tiene un color azul y exhibe un pico de absorción a 630 nm.
Este informe presenta un método para la detección cualitativa de la producción de sideróforos, donde se puede detectar la producción de sideróforos en una placa de agar. También se proporciona un método para la estimación cuantitativa de la producción total de sideróforos en una placa de microtitulación y la detección y análisis cuantitativo de dos sideróforos, pioverdina y piochelina, de P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Agar Agar, Tipo I</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>8-hidroxiquinolina</td><td>Loba Chemie</td><td>4151</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Casamino</td><td>SRL Productos químicos</td><td>68806</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de cetiltrimetilo amonio (CTAB)</td><td>HIMEDIA</td><td>RM4867-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Merck</td><td>1070242521</td><td></td></tr><tr><td>Sulonato de azurol de cromo</td><td>HIMEDIA</td><td>RM336-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Merck</td><td>100241</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa monohidrato</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Merck</td><td>107020</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro férrico hexahidratado</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM6353</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de vidrio</td><td>Borosil</td><td>5100021</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo de vidrio</td><td>Borosil</td><td>9820U05</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>SDFCL</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>King's medio B base</td><td>HIMEDIA</td><td>M1544-500G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Sales medias mínimas</td><td>HIMEDIA</td><td>G013-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio&nbsp;</td><td>Qualigens</td><td>10034</td><td></td></tr><tr><td>MultiskanGO Espectrofotómetro UV</td><td>Thermo Scientific</td><td>51119200</td><td></td></tr><tr><td>Peptona Tipo I, Bacteriológico</td><td>HIMEDIA</td><td>RM667-500G</td><td></td></tr><tr><td>PIPES ácido libre</td><td>MP Biomedicals</td><td>190257</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de potasio</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptona</td><td>HIMEDIA</td><td>RM005-500G</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis</td> de <td>Shimadzu Shimadzu</td><td>2072310058</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Laborzentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3-18K</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Qualigens</td><td>15915</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis cualitativo y cuantitativo de la producción de sideróforos a partir de pseudomonas aeruginosa

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es conocida por su producción de una amplia gama de factores de virulencia para establecer infecciones en el huésped. Uno de estos mecanismos es la eliminación de hierro a través de la producción de sideróforos. P. aeruginosa produce dos sideróforos diferentes: pioquelina, que tiene menor afinidad quelante del hierro, y pioverdina, que tiene una mayor afinidad quelante del hierro. Este informe demuestra que la pioverdina se puede cuantificar directamente a partir de sobrenadantes bacterianos, mientras que la pioquelina debe extraerse de los sobrenadantes antes de la cuantificación.
El método principal para analizar cualitativamente la producción de sideróforos es el ensayo en placa de agar sulfonato de cromo azurol (CAS). En este ensayo, la liberación del colorante CAS del complejo Fe3+-Colorante conduce a un cambio de color de azul a naranja, lo que indica la producción de sideróforos. Para la cuantificación de los sideróforos totales, los sobrenadantes bacterianos se mezclaron en proporciones iguales con colorante CAS en una placa de microtitulación, seguido de un análisis espectrofotométrico a 630 nm. La pioverdina se cuantificó directamente a partir del sobrenadante bacteriano mezclándolo en proporciones iguales con 50 mM de Tris-HCl, seguido de un análisis espectrofotométrico. Un pico a 380 nm confirmó la presencia de pioverdina. En cuanto a la pioquelina, no fue posible la cuantificación directa del sobrenadante bacteriano, por lo que primero hubo que extraerla. El análisis espectrofotométrico posterior reveló la presencia de pioquelina, con un pico a 313 nm.

Antes de la cuantificación de los sideróforos a partir de aislados clínicos, se llevó a cabo un cribado cualitativo de la producción de sideróforos para garantizar la producción de sideróforos. La detección cualitativa de sideróforos a partir de aislados clínicos se observó mediante el rayado de bacterias en placas de agar CAS. Se seleccionaron tres aislamientos clínicos, a saber, MR1, TL7, J3, junto con PAO1 (la cepa de referencia), para el estudio. Los tres aislados clínicos y PAO1 mostraron resultados positivos para la producción de sideróforos, donde un halo naranja claro alrededor del crecimiento bacteriano en la superficie del agar azul indicó una producción positiva de sideróforos (Figura 1). La formación de halo en el agar CAS (Figura 1) dio una estimación aproximada de la producción de sideróforos por aislados clínicos. Por lo tanto, se realizó una estimación cuantitativa de la producción de sideróforos utilizando el reactivo CAS y medios líquidos.
La cuantificación del sideróforo total se realizó directamente a partir del sobrenadante libre de células. Después de la incubación, se observó un cambio de color donde el color amarillo indicaba la eliminación del colorante CAS del complejo Fe. En este caso, se utilizó como control el colorante CAS con medios de crecimiento no inoculados, el cual se tomó para el cálculo de sideróforos. No hubo diferencias significativas en la producción total de sideróforos en los aislados MR1 y TL7, mientras que hubo una producción total significativa de sideróforos en J3 en comparación con PAO1 (Figura 2).
A continuación, se realizó la cuantificación de la pioverdina directamente a partir de sobrenadantes libres de células. Las pioverdinas se liberan en los ambientes celulares, por lo que el sobrenadante libre de células se utilizó para la cuantificación de la pioverdina. También se realizó un barrido de rango UV con el espectrofotómetro, donde el pico a 380 nm confirmó la presencia de pioverdina (Figura 3A). Las lecturas espectrofotométricas se tomaron a 405 nm y los resultados se interpretaron como OD405/OD600 nm. Todos los aislados mostraron producción de pioverdina, mientras que los aislados MR1 y J3 mostraron significativamente menor pioverdina en comparación con PAO1, mientras que no se observaron diferencias significativas para TL7 (Figura 3B).
La pioquelina no se puede cuantificar directamente a partir del sobrenadante libre de células. No fue posible extraer pioquelina de 1 mL de sobrenadante libre de células, por lo que se extrajo de 100 mL de sobrenadante libre de células. Se acidificó con ácido cítrico 1 M. Como la pioquelina es un compuesto altamente inestable, el proceso de extracción se realizó en hielo. La detección de pioquelina se realizó mediante la ejecución de un barrido de rango UV de un rango de 300 a 600 nm, donde el pico aDO 320 nm confirmó la presencia de pioquelina (Figura 4A). La cuantificación de la pioquelina se realizó mediante la toma de lecturas espectrofotométricas aDO 320 nm. Los cálculos se realizaron dividiendo OD320/OD600. Los aislados MR1, TL7 y J3 mostraron una producción significativamente mayor de pioquelina en comparación con el aislado de referencia PAO1 (Figura 4B).
Se realizó una comparación de la producción de sideróforos en varios medios de crecimiento bacteriano para comprobar la cantidad de sideróforos totales producidos en varios medios de crecimiento. Se seleccionaron cuatro medios diferentes, donde se extrajeron el caldo Luria, el medio King's B y el agua de peptona con 8-hidroxiquinolina al 3%, y se seleccionó el caldo Luria no extraído para el estudio. No hubo diferencias significativas entre la producción de sideróforos en el caldo de Luria extraído, el medio B de King y el medio de agua de peptona, mientras que se observó una diferencia significativa para la producción de sideróforos en el caldo de Luria no extraído.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2.jpg"> Figura 1: Producción de sideróforos en agar CAS. El crecimiento de P. aeruginosa en placas de agar CAS de cultivos cultivados durante 24 h se detectó en placas de agar CAS y se incubó a 30 °C durante 24 h. La presencia de sideróforos se indica mediante un halo naranja alrededor de la colonia bacteriana (PAO1, MR1, TL7 y J3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2.jpg"> Figura 2: Producción total de sideróforos. Se evaluó la producción total de sideróforos para PAO1 y tres aislamientos clínicos (MR1, TL7 y J3). Se añadieron 100 μL de sobrenadante libre de células (de PAO1, MR1, TL7 y J3 cultivados durante 24 h en caldo de agua de peptona) a una placa de microtitulación de 96 pocillos, posteriormente se le añadieron 100 μL de colorante CAS. Se realizó una prueba de ANOVA de un factor para determinar la significación estadística. Las barras de error representan ± desviación estándar (DE) entre tres réplicas biológicas. *corresponde a p &lt; 0,05; ns corresponde a p &gt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2.jpg"> Figura 3: Producción de pyoverdina. Se evaluó la producción de pioverdina de la cepa PAO1 de P. aeruginosa y los aislados clínicos (MR1, TL7 y J3) después de 24 h de crecimiento en medio acuoso de peptona. Los cultivos bacterianos se centrifugaron y se añadieron 100 μL de sobrenadante libre de células a una placa de microtitulación de 96 pocillos. Posteriormente, se le añadieron 100 μL de Tris-HCl de 50 mM (pH 8,0). La detección de pioverdina se realizó mediante espectrofotometría UV con un rango de 350 nm a 600 nm. Análisis espectrométrico a 380 nm de la producción de pioverdina (A). Cuantificación de la producción de pioverdina (B). Las barras de error indican el error estándar sobre la media de los experimentos por triplicado. Las barras de error representan ± SD entre tres réplicas biológicas. corresponde a p &lt; 0,0001, ** corresponde a p &lt; 0,01 y ns corresponde a p &gt; 0,05 según la prueba de ANOVA de una vía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2.jpg"> Figura 4: Producción de Piochelin. Producción de pioquelina de PAO1 (utilizada como referencia) y aislados clínicos (MR1, TL7 y J3) mediante extracción con acetato de etilo y sulfato de magnesio. Análisis espectrofotométrico con un rango de 230 nm a 400 nm (A). Cuantificación de piochelin (B). Se realizaron tres experimentos independientes para cada aislado. Las barras de error representan ± SD entre tres réplicas biológicas. corresponde a p &lt; 0,001 basado en la prueba de ANOVA de una vía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Producción comparativa de sideróforos en varios medios de crecimiento bacteriano. Producción total de sideróforos en cuatro medios de cultivo diferentes donde se extrajeron los medios King's B, agua de peptona y caldo de Luria con 8-hidroxiquinoleína al 3% para eliminar cualquier rastro de hierro, y se seleccionó caldo de Luria (sin extraer). La extracción con 8-hidroxiquinolina al 3% se realizó añadiendo un volumen igual de 8-hidroxiquinolina al 3% al medio. Las barras de error representan ± SD entre tres réplicas biológicas. ** corresponde a p &lt; 0,001 y ns corresponde a p &gt; 0,5 según la prueba de ANOVA de un factor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Ficha complementaria 1: Recetas de medios utilizadas para el presente estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Haga clic aquí para ver el archivo.</a>

Este protocolo proporciona análisis cualitativos y cuantitativos de sideróforos totales, pioverdina y pioquelina de Pseudomonas aeruginosa.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la producción de sideróforos a partir de Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

Los sideróforos forman complejos con el hierro y lo transportan a la célula durante las condiciones limitantes del hierro. Los sideróforos son potentes factores de virulencia que ayudan a establecer una infección grave en el huésped, y se sabe que desempeñan un papel en la regulación de la detección de quórum en Pseudomonas aeruginosa. Nuestra investigación tiene como objetivo estimar cuantitativamente la producción de sideróforos en Pseudomonas.Los sideróforos son moléculas extracelulares, por lo que los sideróforos totales, junto con la pioverdina y la pioquelina se cuantifican utilizando sobrenadante libre de células. Como la pioquelina no se detecta en pequeños volúmenes, la extracción se realiza a partir de un gran volumen de sobrenadante libre de células. Recientemente, se han desarrollado LCMS y biosensores para la cuantificación de piochelina.El LCMS es una configuración costosa para laboratorios pequeños, mientras que los biosensores solo son capaces de cuantificar pioquelina. Este protocolo simple e ilustrado utiliza un mínimo de reactivos e instrumentación de laboratorio, y permite la estimación del sideróforo a partir del sobrenadante libre de células en menos tiempo.

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Biología

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