Name: Ensamblaje de tendones de ingeniería para sondear la diafonía celular en la enfermedad y la reparación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a ensamblar modelos de tendón híbridos para estudiar interacciones celulares en reparación tisular usando explantes de cola de ratón e hidrogeles de colágeno. Este método permite investigar mecanismos de curación in vivo.

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Este trabajo fue financiado por la Beca ETH 1-005733

Fabricación de ensamblajes de tendones de ratón para estudiar las interacciones celulares en la enfermedad

Los autores no tienen nada que revelar.

En general, el sistema de modelos ensamblados que se presenta aquí tiene varios pasos críticos que destacar. En primer lugar, el sistema de modelos es tan bueno como la calidad de sus componentes. Es vital comprobar el explante central y las poblaciones celulares que se van a sembrar bajo el microscopio antes de iniciar el proceso de ensamblaje. Es igualmente importante verificar el fenotipo de las poblaciones celulares aisladas al menos una vez con citometría de flujo. Especialmente cuando se utiliza un nuevo lote de colágeno-1 por primera vez, es ventajoso comprobar la velocidad de reticulación en una prueba antes de incrustar células en él. El ensamblaje requiere una gran manipulación manual, lo que aumenta el riesgo de infecciones. Para minimizar el riesgo de infecciones, trabaje en una campana de bioseguridad estéril con flujo de aire laminar, cambie los guantes con frecuencia y descontamine los guantes y el espacio de trabajo con etanol al 80%. Por razones similares, no utilice los soportes de abrazadera impresos en 3D más de una vez. Antes del proceso de inclusión en sí, es importante mantener todos los componentes del hidrogel (solución de reticulación, solución de colágeno-1) en hielo para evitar la reticulación prematura. En consecuencia, se debe trabajar rápidamente una vez que las células se agregan a la solución de reticulación para limitar la muerte celular debido al alto pH y la baja temperatura de la solución de reticulación. Para evitar la muerte celular relacionada con la desecación en el explante del núcleo, aspire el medio que cubre los explantes del núcleo sujetado inmediatamente antes de mezclar la solución de reticulación con la solución de colágeno-1. Para garantizar la colocación central del explante del núcleo dentro del hidrogel, lo ideal es fundir el hidrogel alrededor de un explante de núcleo sujetado que esté ligeramente tensado. Para ello, utilice el pasador de la clavija y el tornillo de perno M3 x 16 mm para fijar los soportes de la abrazadera a un juego de placas (impresas en 3D) con agujeros de las longitudes adecuadas. Después del tiempo de polimerización de 50 minutos, el explante del núcleo incrustado se puede destensar nuevamente dependiendo de las condiciones de cultivo deseadas. La cantidad de tensión que experimenta el ensamble durante el cultivo tiene un profundo impacto en los resultados experimentales y debe mantenerse uniforme en todas las muestras y condiciones21.
Sin embargo, el gran impacto de la (des)carga mecánica en los resultados experimentales es una de las principales ventajas del modelo ensamblado sobre la mayoría de las alternativas de ingeniería tisular, especialmente porque la composición matricial mantenida del explante central también debería recrear los complejos patrones de carga in vivo a nivel celular90. Si bien en la práctica, hasta ahora solo se ha demostrado la medición del módulo elástico lineal, la deformación máxima por tracción y la tensión máxima por tracción de los conjuntos, se han descrito protocolos para las mediciones de resistencia a la fatiga y relajación de la tensión para los explantes del núcleo del tendón en otros lugares y deberían ser aplicables a los conjuntos 91,92. Además de los patrones de carga similares a los de in vivo, la modularidad multinivel del ensamblaje es probablemente su mayor ventaja. Gracias a las cámaras de cultivo individuales, se puede establecer un conjunto controlable de condiciones de nicho para cada muestra por separado (es decir, temperatura, tensión de oxígeno, concentración de glucosa, suplementación, estimuladores, inhibidores y estiramiento estático con una placa). A continuación, la rigidez de la matriz y la composición de la matriz del compartimento extrínseco son personalizables a través de la composición del hidrogel y permitirían, por ejemplo, estudiar el impacto de un microambiente tisular cada vez más enfermo mediante la incorporación de más colágeno-3 y fibronectina celular 93,94,95. Las poblaciones celulares evaluadas en el compartimento extrínseco son fácilmente adaptables mediante la selección de qué células sembrar, pero también pueden modificarse en el explante del núcleo del tendón aprovechando las líneas celulares modificadas genéticamente establecidas y las líneas de ratón (es decir, el agotamiento de las células ScxLin)96. La diferente composición de la matriz y la célula de los dos compartimentos proporciona además una estructura 3D compartimentada única que es otro sello distintivo del tendón central 1,30,46.
Al utilizar este sistema, es importante tener en cuenta las consecuencias de la modularidad del sistema para la granularidad de los parámetros de resultado. Si bien la proliferación y el reclutamiento celular se pueden evaluar para cada compartimento por separado, las propiedades mecánicas, los componentes del secretoma y los productos de degradación actualmente solo se pueden medir para el conjunto completo. En cuanto al rendimiento, una persona debidamente capacitada puede preparar hasta 50 ensamblajes en un día de trabajo normal, siendo el principal cuello de botella el procedimiento de sujeción. Si bien algunos de los métodos de lectura son mutuamente excluyentes, es posible evaluar las propiedades mecánicas y los componentes del secretoma de forma repetitiva en la misma muestra, así como la composición de la población celular (citometría de flujo), el transcriptoma celular (RT-qPCR, secuenciación de ARN) o la distribución de la matriz y la célula (inmunocitoquímica/microscopía de fluorescencia) en los puntos finales. En publicaciones anteriores, estos métodos se han utilizado para caracterizar ampliamente las interacciones intercelulares y compartimentales en ensambles de núcleos // fibroblastos y núcleos // macrófagos expuestos a un nicho similar a una lesión84,85. En este trabajo, se ha explorado la capacidad del sistema modelo ensamblado para sondear la interacción intercompartimental entre las células endoteliales centrales y extrínsecas bajo diferentes estímulos microambientales.
La modularidad del sistema de modelos permite el refinamiento futuro del método, que es necesario para superar las siguientes limitaciones de la iteración de diseño actual. El análisis de citometría de flujo presentado en este trabajo y los datos de secuenciación de ARN unicelular publicados recientemente revelaron que los tenocitos residentes en el núcleo del tendón y las poblaciones derivadas del tendón de Aquiles son más heterogéneas de lo que se suponía anteriormente 24,34,59,84,97. Además, el comportamiento migratorio de las poblaciones celulares inicialmente residentes en el núcleo o en hidrogel difumina la compartimentación de los ensamblajes durante el cultivo. Ambos factores juntos hacen que sea difícil atribuir diferencias transcriptómicas a tipos celulares específicos y separar los procesos basados en la proliferación de los basados en la migración. Esta limitación podría superarse refinando la población de entrada con la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) basada en la composición celular de tendones sanos o enfermos caracterizados en estudios in vivo recientes, mejorando la lectura mediante la implementación de la secuenciación de ARN de una sola célula e integrando marcadores de proliferación como una tinción de EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) durante la microscopía.
Los ensamblajes aquí presentados también comparten una debilidad con la mayoría de los sistemas in vitro disponibles actualmente que simulan órganos enfermos desconectados del resto del cuerpo98,99. Sin embargo, la plataforma basada en cámaras de cultivo utilizada aquí posiciona bien el sistema modelo para su integración en una plataforma multiorgánica en la que se conectan ensamblajes que imitan diferentes órganos y se pueden estudiar las interacciones interorgánicas.
En esencia, el sistema modelo se basa en tendones posicionales de roedores, lo que da como resultado su propio conjunto único de inconvenientes. En primer lugar, la traducibilidad de los resultados se ve obstaculizada por el hecho de que los ratones de tipo salvaje no desarrollan ni sufren enfermedades tendinosas 8,100,101. La integración de tejidos y células de humanos o de cepas de ratón recientemente desarrolladas que exhiben aspectos de la enfermedad de los tendones podría aliviar este problema102. El cambio hacia un ensamblaje basado en humanos es particularmente interesante, ya que permitiría estudios con tejidos derivados de pacientes de tendones con diferentes enfermedades (es decir, tendinitis, tendinosis o peritendinitis) e incluso donantes resistentes al tratamiento que podrían desbloquear programas de tratamiento más personalizados. En segundo lugar, los explantes murinos del tendón de la cola no manejan particularmente bien el microdaño inducido por sobrecarga, lo que limita la aplicabilidad del sistema modelo para el estudio del daño agudo del tendón.
Por todas estas razones, los ensamblajes de explantes // hidrogeles se encuentran en una posición privilegiada para estudiar la biología del núcleo tendinoso, las interacciones estructura-función de la matriz y las interacciones intercompartimentales entre poblaciones celulares específicas en respuesta al microdaño inducido por nichos. Los conocimientos recopilados a partir de estos estudios de alto rendimiento podrían orientar la investigación in vivo y el desarrollo de tratamientos.

En su función de transferir fuerzas musculares a los huesos para permitir el movimiento, los tendones se enfrentan a algunas de las tensiones mecánicas más extremas que ocurren en el cuerpo humano 1,2,3. Debido al envejecimiento de las sociedades, el aumento de la prevalencia de la obesidad y la creciente popularidad de las actividades deportivas mecánicamente exigentes, se prevé que la prevalencia de enfermedades y lesiones tendinosas aumente en los países desarrollados 4,5,6. El desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento basados en la evidencia y modificadores de la enfermedad para combatir este aumento se ha visto obstaculizado por las limitaciones de los sistemas modelo actualmente disponibles 1,7,8.
Idealmente, los modelos de reparación de enfermedades y lesiones permitirían estudiar cómo el órgano diana procesa un conjunto definido de parámetros de entrada (imitando los desencadenantes de la enfermedad, Tabla 1) en parámetros de salida medibles (que representan las características distintivas de la enfermedad, Tabla 2) mientras se controlan los factores de confusión. Los estudios que utilicen estos sistemas modelo podrían entonces identificar los procesos fisiológicos (patológicos) que subyacen a la reparación de enfermedades y lesiones y obtener conocimientos que podrían aprovecharse para prevenir o reducir las características distintivas de las enfermedades y lesiones en las clínicas. Aplicando este principio a los tendones, un sistema modelo útil debería recapitular las partes centrales de la respuesta tendinosa in vivo a la enfermedad y la lesión, que abarcan las siguientes características distintivas: microdaño, inflamación, neovascularización, hipercelularidad, recambio acelerado de la matriz y descompartimentación 9,10,11,12,13,14,15 . Utilizando estas características como base, se pueden inferir los siguientes requisitos para un sistema modelo exitoso de reparación de enfermedades y lesiones tendinosas.
Se plantea la hipótesis de que la sobrecarga mecánica es un factor central en la lesión tendinosa y la patogénesis de la enfermedad y, por lo tanto, es un enfoque experimental comúnmente utilizado para crear microdaño16. La capacidad de carga mecánica controlable es, por lo tanto, un requisito previo primordial para los modelos de reparación de enfermedades y lesiones tendinosas. Idealmente, el sistema de modelos permite tres modos principales: carga de estiramiento simple para dañar, carga de fatiga y descarga 8,17,18. Tras la deformación mecánica, las células residentes en los tejidos experimentan una combinación compleja de fuerzas de tensión, fuerzas de cizallamiento (debido al deslizamiento de las fibras de colágeno que rodean las células) y fuerzas de compresión que ocurren durante la descarga o cerca de la entesis19,20. Los sistemas modelo deben recrear estos patrones de carga complejos con la mayor precisión posible.
Una forma alternativa de introducir microdaño en la matriz es aprovechar los estresores bioquímicos que imitan las predisposiciones sistémicas a la enfermedad y lesión de los tendones, como las citocinas (pro)inflamatorias, el estrés oxidativo o las altas concentraciones de glucosa 21,22,23. En consecuencia, un microambiente de nicho controlable es ventajoso para un sistema modelo de reparación de enfermedades y lesiones tendinosas.
Un requisito previo común para que los sistemas modelo puedan recapitular la inflamación, la neovascularización y la hipercelularidad es la presencia selectiva de poblaciones celulares que impulsan estos procesos24. Para los procesos inflamatorios, estas poblaciones incluyen neutrófilos, linfocitos T y macrófagos, mientras que las células endoteliales y los pericitos serían necesarios para estudiar la neovascularización 25,26,27,28,29. Los fibroblastos tendinosos no solo son vitales para la reparación de los tendones, sino que, como células proliferativas y migratorias, también son parcialmente responsables de la hipercelularidad local observada en la enfermedad tendinosa 30,31,32,33,34,35,36.
Además de los cambios en las poblaciones celulares residentes, la composición de la matriz tendinosa también está alterada en la enfermedad y lesión del tendón 7,37,38,39,40. Para presentar las señales microambientales correctas relevantes para la enfermedad, los sistemas modelo deben ser capaces de integrar una composición de matriz extracelular que coincida con la enfermedad o la etapa de lesión objetivo, por ejemplo, permitiendo combinaciones proporcionales relevantes de colágeno-1, colágeno-3 y fibronectina celular41.
La compartimentación de los tendones sanos en el núcleo del tendón y los compartimentos extrínsecos (es decir, endotenón, epitenón y paratenón) es fundamental para su función y, a menudo, se altera en tendones enfermos o lesionados 1,42,43,44,45,46,47 . Por lo tanto, la incorporación de la compartimentación de tendones en 3D en los sistemas modelo de tendones no solo es necesaria para simular más de cerca los procesos subyacentes a la descompartimentación y recompartimentación, sino que también ayuda a establecer los gradientes espacio-temporales correctos de citocinas y nutrientes48,49.
Finalmente, la modularidad es otro activo central de los sistemas modelo, ya que permite a los investigadores combinar la contribución relativa correcta y la interacción entre los estresores previamente descritos durante los procesos investigados 8,17.
Además de seleccionar las modalidades de entrada óptimas, un paso importante es poder medir, observar y realizar un seguimiento de los cambios en la salida resultante. Las propiedades mecánicas del sistema modelo (es decir, la longitud de la región del dedo, el módulo elástico lineal, la tensión máxima por tracción, la tensión máxima por tracción, la resistencia a la fatiga y la relajación de la tensión) son fundamentales aquí, ya que caracterizan la función principal del tendón 50,51,52. Para vincular estos cambios funcionales con los cambios a nivel tisular, es importante habilitar métodos que detecten el daño estructural de la matriz (colágeno) y rastreen la proliferación y el reclutamiento de poblaciones celulares relevantes para la enfermedad y la reparación 30,53,54,55,56,57,58,59,60.
Para estudiar la diafonía emergente célula-célula y célula-matriz, se debe ser capaz de aislar o marcar proteínas en cantidades adecuadas para su cuantificación (es decir, ELISA, proteómica, inmunohistoquímica, citometría de flujo)14,21,61,62. También debería ser posible el análisis de la expresión génica específica de la población o al menos del compartimento (es decir, la clasificación celular activada por fluorescencia [FACS], la secuenciación de ARN de una sola célula/a granel y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR))21,24,27,63. El sistema modelo debe permitir medir la mayor cantidad posible de los parámetros de salida antes mencionados en la misma muestra y en varias muestras de una manera lo suficientemente rápida como para desbloquear estudios de alto rendimiento.
Entre los sistemas modelo disponibles actualmente para estudiar la reparación de enfermedades y lesiones de los tendones humanos, el propio cuerpo humano es, por supuesto, el más representativo. También es el menos compatible con la intervención experimental. Mientras que los pacientes con lesiones agudas de los tendones están abundantemente disponibles para estudios clínicos, los pacientes con tendinopatía temprana (la enfermedad tendinosa más común) están en gran medida libres de síntomas y, a menudo, no se detectan clínicamente hasta que se manifiestan cambios más graves 14,64,65. Esto hace que sea difícil precisar el momento crítico en el que la homeostasis del tendón se descarrila y los mecanismos detrás de este descarrilamiento 16,66,67,68,69. Además, la extracción de biopsias de tendones sanos es un desafío ético, ya que puede provocar daños persistentes. Los restos del tendón isquiotibial de la cirugía de reconstrucción del ligamento cruzado anterior se utilizan a menudo como controles sanos, pero podría decirse que difieren en función, propiedades mecánicas, poblaciones celulares y composición de la matriz en comparación con el manguito rotador, el tendón de Aquiles y los tendones rotulianos comúnmente afectados por enfermedades y lesiones tendinosas 70,71,72,73.
Los modelos animales in vivo son más accesibles y manejables, pero su uso impone una carga ética significativa a los animales y un costo económico a los investigadores. Además, la mayoría de los animales modelo populares no desarrollan lesiones tendinopáticas espontáneamente (es decir, ratas, ratones, conejos) o carecen de los cebadores y cepas modificadas genéticamente necesarias para rastrear las vías de comunicación multicelular involucradas en ella (es decir, caballos, conejos).
Los sistemas simples de modelos in vitro en 2D se encuentran en el otro lado del espectro de complejidad/trazabilidad y permiten un estudio controlado y eficiente en el tiempo de vías de comunicación intercelulares específicas en respuesta a un conjunto más controlable de desencadenantes 8,74. Sin embargo, estos sistemas simplificados comúnmente no recapitulan la carga mecánica multidimensional (es decir, tensión, compresión y cizallamiento) que es fundamental para la funcionalidad del tendón. Además, las (demasiado) altas rigideces del plástico de cultivo de tejidos tienden a anular cualquier señal de matriz proporcionada por los recubrimientos destinados a imitar el estado de interés de la enfermedad75,76.
Para superar este inconveniente, se han desarrollado sistemas de modelos 3D de ingeniería tisular cada vez más sofisticados para proporcionar una matriz cargable cuya composición puede coincidir al menos parcialmente con el estado deseado de la enfermedad 77,78,79. Sin embargo, estos sistemas no solo luchan por replicar con precisión las complejas composiciones de la matriz extracelular in vivo y los patrones de carga celular, sino que generalmente carecen de capacidad de carga a largo plazo y de las interfaces compartimentales necesarias para estudiar las vías de comunicación intercompartimental que coordinan la reparación de enfermedades y lesiones tendinosas 48,49,80.
Los sistemas modelo de explante de tendones ex vivo tienen la clara ventaja de una composición matricial similar a la de in vivo incorporada que comprende nichos pericelulares, barreras intercompartimentales, así como gradientes espaciotemporales de citocinas/nutrientes y recapitula patrones de carga complejos cuando se estira8. Como resultado de los límites de difusión de nutrientes dependientes del tamaño, los explantes de modelos animales más grandes (es decir, caballos) son difíciles de mantener vivos para el estudio a largo plazo de la reparación de enfermedades y lesiones tendinosas 81,82,83. Mientras tanto, los explantes más pequeños de especies murinas (es decir, el tendón de Aquiles, el tendón rotuliano) son difíciles de sujetar de manera reproducible y cargar mecánicamente. Su tamaño también restringe la cantidad de material que se puede recolectar para las lecturas a nivel de células, proteínas y genes sin agrupar muestras y disminuir el rendimiento. En este sentido, los fascículos del tendón de la cola murina ofrecen el potencial de desbloquear el estudio de alto rendimiento de la reparación de enfermedades y lesiones de los tendones, ya que están fácilmente disponibles en grandes cantidades de un solo ratón, preservan la compleja composición de la matriz pericelular in vivo y recapitulan los patrones de carga celular. Sin embargo, durante el proceso de extracción, pierden la mayor parte de su compartimento extrínseco y las poblaciones vasculares, inmunitarias y fibroblásticas que contienen, que ahora se considera que impulsan la enfermedad tendinosa y la reparación 8,18.
Para cerrar esta brecha, se ha desarrollado un sistema modelo que combina las ventajas de los explantes de núcleo derivados del tendón de la cola murina con las ventajas de los sistemas modelo basados en hidrogel 3D. Este sistema modelo consiste en un hidrogel cargado de células (colágeno-1) moldeado alrededor de los explantes del tendón de la cola84,85. En este artículo, se proporcionan en detalle los pasos de fabricación necesarios junto con lecturas útiles que se pueden obtener mediante el cocultivo de explantes centrales (compartimento intrínseco) dentro de un hidrogel de colágeno tipo 1 cargado de células endoteliales (compartimento extrínseco).

<table><tbody><tr><td>Aguja de inyección de 0,4 mm x 25 mm (G27)</td>Filamento de impresión <td>3D Sterican</td><td>9186174</td><td></td></tr><tr><td>: Ácido poliláctico transparente Prusa</td><td></td>, <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>4% formaldehído Roti-Histofix</td><td></td><td>P087.4</td><td></td></tr><tr><td>Solución de desprendimiento de células Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina</td><td>VWR</td><td>L0009-100</td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital acoplable con montura C: Moticam 2</td><td>Motic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tornillo de perno M3 x 16 mm, acero inoxidable</td><td>RS Pro</td><td>1871235</td><td></td></tr><tr><td>Tornillo de perno M3 x 6 mm, acero inoxidable</td><td>RS Pro</td><td>1871207</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD146: PE anti-ratón</td><td>BioLegend</td><td>134703</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo CD206: Alexa Fluor 488 anti-ratón</td><td>BioLegend</td><td>141709</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo CD31: Alexa Fluor 488 anti-ratón</td><td>BioLegend</td><td>102413</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo CD86: PE anti-ratón</td><td>BioLegend</td><td>105007</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino dializado (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7000183</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>7002211</td><td></td></tr><tr><td>Clavija, 3 mm x 16 mm, acero inoxidable</td><td>Accu</td><td>HDP-3-16-A1</td><td></td></tr><tr><td>Piel de Dragón 10 Slow/1 silicona</td><td>KauPO</td><td>09301-004-000001</td><td></td></tr><tr><td>Endopan 3 Kit</td><td>Pan-Biotech</td><td>P04-0010K</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de crecimiento de células endoteliales&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico con cierre seguro Eppendorf (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Homodímero de etidio, EthD-1, 2 mM stock en DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46043-1MG-F</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 anticuerpo: Apc/fire 750 anti-ratón</td><td>BioLegend</td><td>123151</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubo de plástico (15 mL)</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon de plástico tubo (50 mL)</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo: LSR II Fortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>23-11617-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Invitrogen</td><td>D12054</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III concentrado de limpieza alcalina</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de hidroxiprolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes: Motic Images Plus 3.0 ML</td><td>Motic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico Fosfato Sal de magnesio n-hidrato</td><td>Wako Chemicals</td><td>013-19641</td><td></td></tr><tr><td>LSE Agitador orbital de baja velocidad</td><td>Corning</td><td>6780-FP</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales</td><td>Sigma</td><td>7002231</td><td></td></tr><tr><td>Factor estimulante de macrófagos de ratón ( m-CSF)</td><td>PeproTech</td><td>315-02-50ug</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo MSD</td><td>Mesoscale Discovery</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de filtro de malla de nylon, 100 y micro; m</td><td>Corning</td><td>734-2761</td><td></td></tr><tr><td>Impresora 3D original Prusa i3 MK3S</td><td>Prusa</td><td>i3 MK3S</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), ph 7,4, estéril, 10 L</td><td>Gibco</td><td>10010001</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Tampón de lisis Gibco</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>RBC</td><td>VWR</td><td>786-650</td><td></td></tr><tr><td>m-CSF recombinante&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de ARN: Rneasy plus Micro</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Software de corte: PrusaSlicer</td><td>Prusa</td><td>NA</td><td>Versión 2.6.0 o superior</td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 100 &micro; m</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí quirúrgico n.º 21</td><td>Swann-Morton</td><td>307</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5 %)</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

ensamblaje de tendones de ingeniería para sondear la diafonía celular en la enfermedad y la reparación

Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair

Los tendones permiten la locomoción transfiriendo fuerzas musculares a los huesos. Se basan en un núcleo tendinoso resistente que comprende fibras de colágeno y poblaciones de células estromalas. Este núcleo de carga está abarcado, nutrido y reparado por una capa de tejido similar a la sinovial que comprende el compartimento del tendón extrínseco. A pesar de este sofisticado diseño, las lesiones tendinosas son comunes y el tratamiento clínico sigue basándose en la fisioterapia y la cirugía. Las limitaciones de los sistemas modelo experimentales disponibles han ralentizado el desarrollo de nuevos tratamientos modificadores de la enfermedad y regímenes clínicos de prevención de recaídas. 
Los estudios in vivo en humanos se limitan a comparar tendones sanos con tejidos enfermos o rotos en etapa terminal muestreados durante la cirugía de reparación y no permiten el estudio longitudinal de la enfermedad tendinosa subyacente. Los modelos animales in vivo también presentan límites importantes en cuanto a la complejidad fisiológica opaca, la carga ética sobre los animales y los grandes costes económicos asociados a su uso. Además, los modelos animales in vivo no son adecuados para el sondeo sistemático de fármacos y vías de interacción multicelulares y multitisulares. Los sistemas de modelos in vitro más simples también se han quedado cortos. Una de las principales razones es la incapacidad de replicar adecuadamente la carga mecánica tridimensional necesaria para estudiar de manera significativa las células tendinosas y su función. 
El nuevo sistema de modelos 3D presentado aquí alivia algunos de estos problemas mediante la explotación de explantes del núcleo del tendón de la cola murina. Es importante destacar que estos explantes son fácilmente accesibles en grandes cantidades desde un solo ratón, conservan patrones de carga in situ en 3D a nivel celular y cuentan con una matriz extracelular similar a la in vivo. En este protocolo, se dan instrucciones paso a paso sobre cómo aumentar los explantes del núcleo del tendón con hidrogeles de colágeno cargados de células endoteliales derivadas del músculo, fibroblastos derivados del tendón y macrófagos derivados de la médula ósea para sustituir las poblaciones celulares activadas por enfermedades y lesiones dentro del compartimento del tendón extrínseco. Se demuestra cómo los ensamblajes tendinosos resultantes pueden ser desafiados mecánicamente o a través de estímulos microambientales definidos para investigar la diafonía multicelular emergente durante enfermedades y lesiones.

Aquí, presentamos un sistema modelo ensamblado para imitar la diafonía celular del tendón entre el tejido central del tendón que soporta la carga y un compartimento extrínseco que contiene poblaciones celulares activadas por enfermedades y lesiones. Como caso de uso importante, demostramos cómo se puede implementar el sistema para investigar la activación relevante de la enfermedad de las células endoteliales extrínsecas.

Ensamblaje de tendones de ingeniería para sondear la diafonía celular en la enfermedad y la reparación

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell ...

Los tendones facilitan el movimiento transmitiendo fuerzas del músculo al hueso. Aunque las lesiones de los tendones son comunes, son bastante difíciles de tratar y el resultado para los pacientes suele ser deficiente. En la actualidad, todos los tratamientos de las lesiones tendinosas implican algún tipo de fisioterapia, y esto refleja el hecho de que las fuerzas mecánicas desempeñan un papel tan central en la biología de los tendones.Realmente no existen buenos modelos experimentales para estudiar el daño y la reparación de los tendones, por lo que mi laboratorio está desarrollando activamente nuevos modelos que puedan capturar mejor las características importantes de la fisiología y la fisiopatología de los tendones. En estudios previos, pudimos demostrar que el núcleo del tendón, que representa la parte que soporta la carga del tendón, tiene por sí mismo una capacidad de reparación muy limitada. En combinación con otras investigaciones en el campo, planteamos la hipótesis de que un núcleo lesionado reclutaría células del compartimento del tendón extrínseco para ayudarlo a sanar.El sistema de modelo de tendones de ingeniería tisular puede proporcionar un entorno 3D cargable, pero no coincide con las complejidades de una matriz exocelular in vivo. Los sistemas modelo de explante lo hacen, pero a menudo son difíciles de mantener vivos y se cargan mecánicamente durante períodos de tiempo más largos o carecen del compartimento extrínseco que es central para los procesos de reparación. Nuestro exclusivo sistema de modelos combina las ventajas de los explantes de núcleo derivados del tendón de la cola marina con las de los sistemas de base de hidrogel 3D.Proporciona una matriz central cargable, similar a la de in vivo, junto con un compartimento extrínseco artificial. Su composición se puede ajustar a la hipótesis de investigación y a la barrera biomimética intercompartimentada entre ambas. Nuestros ensamblajes de explantes de hidrogel híbrido se encuentran en una posición privilegiada para estudiar la biología del núcleo del tendón, las interacciones de la función de la estructura de la matriz y las interacciones intercompartimentales entre poblaciones celulares específicas en un microentorno sintonizable con precisión.Los descubrimientos de los estudios realizados con este sistema guiarán la investigación in vivo y el desarrollo de tratamientos.

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Los tendones flexores de la mano se lesionan con frecuencia, dando lugar a alteración de la función de la mano. Sin embargo, la respuesta de curación de la cicatriz de tejido no está bien caracterizado. Un modelo murino de la curación del tendón flexor se demuestra aquí. Este modelo se puede mejorar la comprensión global del proceso de curación y evaluar enfoques terapéuticos para mejorar la curación.

Flexor murino Lesión del tendón y Cirugía de reparación

Este artículo describe un procedimiento para producir iTenocitos mediante la generación de células estromales mesenquimales derivadas de iPSC con sobreexpresión combinada de Scleraxis utilizando un vector lentiviral y estiramiento uniaxial a través de un biorreactor 2D.

Generación de iTenocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a través de la sobreexpresión combinada de escleraxis y la tensión uniaxial 2D

Un biorreactor presión cíclica capaz de someter a los tejidos del corazón de la válvula de presión a las condiciones fisiológicas y patológicas ha sido diseñado. Un programa LabVIEW permite a los usuarios para controlar la presión magnitud, amplitud y frecuencia. Este dispositivo puede ser utilizado para estudiar el tejido mecanobiología de las válvulas del corazón o células aisladas.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

Este artículo describe un método versátil para crear células derivadas de los anillos de tejido celular por auto-ensamblaje. Las células musculares lisas sembradas en forma de anillo total de agarosa pozos y el contrato de forma sólida en tres dimensiones (3D) de los tejidos dentro de 7 días. A escala milimétrica los anillos de tejido son propicias para los ensayos mecánicos y servir de base para el montaje del tejido.

Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

Se demuestra un ensayo basado en microfluídica para medir la escala de tiempo de tránsito para las células a través de una secuencia de constricciones a escala micrométrica.

Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

El objetivo de este protocolo es construir un equivalente de piel tridimensional de espesor completo, que se asemeje a la piel natural. Con un dispositivo de herida automatizado específicamente construido, se pueden generar heridas precisas y reproducibles bajo el mantenimiento de la esterilidad.

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

Proporcionamos un protocolo generalizado basado en una estrategia de bioprinting de microfluidos para la ingeniería de un lecho vascular de microfibra, donde un tipo de célula secundaria podría ser más sembrado en el espacio intersticial de esta estructura de microfibra para generar organoides y tejidos vascularizados.

Vascularizado de Bioprinting de microfluidos para la ingeniería de tejidos y organitas

Este protocolo describe un método novedoso para crear un modelo de elementos finitos espacial detallada de la arquitectura intracelular de cardiomiocitos de imágenes de microscopía confocal y microscopia electrónica. La potencia de este modelo espacial detallada se demuestra mediante estudios de caso en la señalización de calcio y bioenergética.

Creando un modelo geométrico realista estructural de elementos finitos de cardiomiocitos para estudiar el papel de la arquitectura celular de cardiomiocitos biología de sistemas

En este trabajo, presentamos un protocolo in vitro e in situ para reparar un hueco tendinoso de hasta 1,5 cm llenándolo con injerto de colágeno modificado. Esto se realizó mediante el desarrollo de una técnica de sutura modificada para tomar la carga mecánica hasta que el injerto madure en el tejido huésped.

Una nueva técnica de sutura de tenorrafia con injerto de colágeno de ingeniería tisular para reparar defectos grandes del tendón

Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Aprende a ensamblar modelos de tendón híbridos para estudiar interacciones celulares en reparación tisular usando explantes de cola de ratón e hidrogeles de colágeno. Este método permite investigar mecanismos de curación in vivo.

Ensamblaje de tendones de ingeniería para sondear la diafonía celular en la enfermedad y la reparación

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