Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía de Time-lapse
8 de noviembre de 2006
Vale, lo que me gustaría hacer hoy es mostrarle cómo construir una cámara de flujo, una cámara de fusión para imágenes en un microscopio invertido. A continuación, creo dos espacios utilizando película. Entonces, tomo la película de parafina y la corto en tiras pequeñas.
A continuación, voy a hacer esto, lo cual básicamente formará los canales para las paredes, y los seco con una corriente de aire inclinada. Pongo el cubreobjetos encima del para, y aquí está el producto terminado. Luego lo caliento en un bloque calefactor para fundir el para y, básicamente, crear un sello.
Lo que tenemos aquí es el vidrio de cubreobjetos, y encima de este vidrio de cubreobjetos hay dos capas de phim, como se observa justo aquí. Y encima de esto, nuevamente, hay un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros. Este de aquí, que presioné contra el param para lograr el sellado.
Vale, el líquido entra en una dirección aquí y puedo extraerlo con un papel filtro en esta dirección. Y en un momento les mostraré cómo hacerlo. Lo que me gusta hacer es colocarlo en una cámara humidificada, que es muy sencilla.
Tome dos tipos de tiras elevadas y coloque un filtro de papel debajo. Y para mantenerlo estable, como yo hago, coloque la cubierta, la lámina de cubreobjetos, sobre la cámara de flujo. Ahora, la forma en que se introduce una solución en la cámara es colocando simplemente la punta de la pipeta en la entrada de la cámara y luego agregar la solución gota a gota.
Ahora lo que hago es incubar la cámara con la tapa cerrada durante 10 minutos. Lo que suelo hacer para extraer el líquido del otro lado es utilizarlo: tomo un papel filtro y lo corto en tiras delgadas como esta. Y tomo una de estas tiras delgadas y aplico simultáneamente la solución en la entrada, mientras coloco el papel filtro en la salida para absorber el intercambio, la solución.
Así que verá el líquido fluyendo a través de la solución. Luego espero cinco minutos para el cierre medio. Ahora lo que estoy listo para hacer es colocar efectivamente la actina, y la actina, que en realidad tengo que polimerizar, la polimerizo dentro de la cámara de flujo y es exactamente el mismo procedimiento que antes.
Entonces, debido a esto, y ahora que la acción está polimerizada, lavo todo el exceso de acción no polimerizada utilizando un gran volumen de tampón. Aquí tengo aproximadamente cien microlitros, lo que equivale a varios volúmenes de la cámara de reacción de tampón. Simplemente, ya saben, cuando el papel filtro se satura, tengo que cambiar la dirección. ¿De acuerdo?
Y así estoy listo para realizar la imagenología con esto. Entonces, la cámara de perfusión con actina unida a ella. Ahora tomo el portaobjetos, lo coloco debajo del microscopio, y dado que estoy realizando la imagenología con un objetivo de inmersión en aceite, voy a colocar un poco de aceite de inmersión sobre la superficie superior del cubreobjetos, en contacto directo, de manera que la solución tampón, la proteína o cualquier cosa sobre la actina dentro quede adecuadamente cubierta.
Lo que hago es que puedo cambiar efectivamente el lado de la solución mientras realizo la adquisición de imágenes con lapso de tiempo. Así.
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Descripción general
Este artículo demuestra la construcción de una cámara de flujo y una cámara de fusión para imágenes en un microscopio invertido. El proceso implica crear canales utilizando parafina y sellarlos con calor.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
Antecedentes
- Las cámaras de flujo son esenciales para diversas técnicas de imagen.
- La construcción de una cámara de fusión permite capacidades de imagen mejoradas.
- El parafilm se utiliza comúnmente en entornos de laboratorio para crear sellos.
- Comprender el proceso de construcción es fundamental para los investigadores en el campo.
Objetivo del estudio
- Proporcionar una guía paso a paso para la construcción de una cámara de flujo.
- Ilustrar el uso del parafilm en la creación de cámaras de imagen.
- Mejorar la accesibilidad de las técnicas de imagen para los investigadores.
Métodos Utilizados
- Cortar el parafilm en tiras para formar canales.
- Secar las tiras con aire inclinado.
- Colocar una laminilla encima del parafilm.
- Calentar el conjunto en un bloque térmico para crear un sello.
Resultados Principales
- Se construyó con éxito una cámara de flujo funcional.
- El proceso de sellado fue eficaz para crear un entorno estable para la obtención de imágenes.
- El método demostrado es reproducible para uso en laboratorio.
- Los investigadores pueden utilizar esta técnica para diversas aplicaciones de obtención de imágenes.
Conclusiones
- La construcción de cámaras de flujo y fusión es sencilla.
- Este método puede facilitar estudios avanzados de imagen.
- El acceso a tales técnicas puede mejorar los resultados de la investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la preparación reproducible de microentornos controlados para la obtención de imágenes de células vivas, apoyando estudios mecanicistas de la dinámica del citoesqueleto. Al estandarizar el ensamblaje de la cámara de flujo, se reduce la variabilidad en los ensayos basados en perfusión, mejorando la consistencia de los datos entre diferentes equipos de investigación. El método facilita el análisis cuantitativo de la cinética de desensamblaje de actina, un proceso clave en la motilidad celular y la transducción de señales, relevante para la validación de dianas en oncología e inmunología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la observación directa de la dinámica de despolimerización de actina para investigar reguladores del remodelado del citoesqueleto.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma estandarizada para evaluar los efectos de compuestos sobre el recambio de actina en células vivas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Apoya el desarrollo de lecturas basadas en fluorescencia para las tasas de desensamblaje de actina como punto final de un ensayo funcional.
- Valor operativo: Permite el intercambio de solución durante la adquisición de imágenes de lapso de tiempo para evaluar relaciones dosis-respuesta bajo perfusión.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la dinámica de la actina con fenotipos celulares relevantes para la metástasis, la invasión y la formación de la sinapsis inmune.
- Valor operativo: Permite la evaluación preclínica de inhibidores de la vía mediante biomarcadores de imagen cuantificables.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la selección de interacción con el blanco hasta la validación funcional en sistemas celulares relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre reguladores del citoesqueleto mediante la visualización en tiempo real del flujo de actina.
- Tamizaje: Proporciona mediciones cuantitativas y reproducibles del desensamblaje de actina bajo condiciones controladas de perfusión.
- Análisis: Genera datos de intensidad de fluorescencia resueltos en el tiempo, que permiten el modelado cinético de la renovación de actina.
- Investigación Traducional: Conecta el mecanismo molecular con fenotipos celulares en modelos preclínicos de migración celular.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de perfusión reutilizable y adaptable a múltiples dianas del citoesqueleto y tipos celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reducción mecanicista de riesgos de dianas implicadas en la regulación de la actina mediante lecturas funcionales directas.
- Valor operativo: La preparación estandarizada de cámaras mejora la reproducibilidad del ensayo entre diferentes centros y operadores.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones tempranas de avance o interrupción al vincular la modulación de la diana con resultados funcionales en el citoesqueleto.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en sus efectos sobre fenotipos de motilidad e invasión celular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes de células vivas y control de flujo microfluídico.
- Depende del acceso a microscopios verticales con control ambiental y capacidades de perfusión.
- Necesita la estandarización del espesor del parafilm y de los parámetros de sellado para lograr consistencia entre cámaras.
- La adaptación a diferentes tipos celulares puede requerir la optimización del recubrimiento de superficies y de las condiciones de polimerización de actina.
- Las limitaciones prácticas incluyen los posibles efectos del estrés por cizallamiento sobre las células durante perfusiones prolongadas, como se indica en el protocolo.
