Name: Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía de Time-lapse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprende a construir cámaras de flujo y fusión para microscopía usando parafilm y calor. Este método permite crear sellos estables para estudios de imagen avanzados en neurociencia y biología celular.

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<ol><li> Construir una cámara de flujo como se muestra en el video. Asegúrese de que el sello de parafina es escaso y el uso de cubreobjetos se lavan. </li><li> Incubar actina agente fijador en la cámara para &#39;10.5. </li><li> Bloquear no específicas sitios de unión sobre el cubreobjetos con una proteína de bloqueo. </li><li> Actina polimeriza dentro de la cámara de flujo en G-actina en la polimerización de amortiguamiento. </li><li> Lavado de actina polimerizada por el flujo en exceso de tampón. </li></ol>

monitoreo de actina desmontaje con la microscopía de time-lapse

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía de Time-lapse

Vale, lo que me gustaría hacer hoy es mostrarle cómo construir una cámara de flujo, una cámara de fusión para imágenes en un microscopio invertido. A continuación, creo dos espacios utilizando película. Entonces, tomo la película de parafina y la corto en tiras pequeñas.A continuación, voy a hacer esto, lo cual básicamente formará los canales para las paredes, y los seco con una corriente de aire inclinada. Pongo el cubreobjetos encima del para, y aquí está el producto terminado. Luego lo caliento en un bloque calefactor para fundir el para y, básicamente, crear un sello.Lo que tenemos aquí es el vidrio de cubreobjetos, y encima de este vidrio de cubreobjetos hay dos capas de phim, como se observa justo aquí. Y encima de esto, nuevamente, hay un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros. Este de aquí, que presioné contra el param para lograr el sellado.Vale, el líquido entra en una dirección aquí y puedo extraerlo con un papel filtro en esta dirección. Y en un momento les mostraré cómo hacerlo. Lo que me gusta hacer es colocarlo en una cámara humidificada, que es muy sencilla.Tome dos tipos de tiras elevadas y coloque un filtro de papel debajo. Y para mantenerlo estable, como yo hago, coloque la cubierta, la lámina de cubreobjetos, sobre la cámara de flujo. Ahora, la forma en que se introduce una solución en la cámara es colocando simplemente la punta de la pipeta en la entrada de la cámara y luego agregar la solución gota a gota.Ahora lo que hago es incubar la cámara con la tapa cerrada durante 10 minutos. Lo que suelo hacer para extraer el líquido del otro lado es utilizarlo: tomo un papel filtro y lo corto en tiras delgadas como esta. Y tomo una de estas tiras delgadas y aplico simultáneamente la solución en la entrada, mientras coloco el papel filtro en la salida para absorber el intercambio, la solución.Así que verá el líquido fluyendo a través de la solución. Luego espero cinco minutos para el cierre medio. Ahora lo que estoy listo para hacer es colocar efectivamente la actina, y la actina, que en realidad tengo que polimerizar, la polimerizo dentro de la cámara de flujo y es exactamente el mismo procedimiento que antes.Entonces, debido a esto, y ahora que la acción está polimerizada, lavo todo el exceso de acción no polimerizada utilizando un gran volumen de tampón. Aquí tengo aproximadamente cien microlitros, lo que equivale a varios volúmenes de la cámara de reacción de tampón. Simplemente, ya saben, cuando el papel filtro se satura, tengo que cambiar la dirección. ¿De acuerdo?Y así estoy listo para realizar la imagenología con esto. Entonces, la cámara de perfusión con actina unida a ella. Ahora tomo el portaobjetos, lo coloco debajo del microscopio, y dado que estoy realizando la imagenología con un objetivo de inmersión en aceite, voy a colocar un poco de aceite de inmersión sobre la superficie superior del cubreobjetos, en contacto directo, de manera que la solución tampón, la proteína o cualquier cosa sobre la actina dentro quede adecuadamente cubierta.Lo que hago es que puedo cambiar efectivamente el lado de la solución mientras realizo la adquisición de imágenes con lapso de tiempo. Así.

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Investigación

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Biology

Biología

Imágenes microscópicas de vida las células endoteliales que expresan GFP-actina permite la caracterización de los cambios dinámicos en las estructuras del citoesqueleto. A diferencia de las técnicas que utilizan las muestras fijadas, este método proporciona una evaluación detallada de los cambios temporales en el citoesqueleto de actina en las células del mismo, antes, durante y después de diversos estímulos físicos, farmacológicos o inflamatorios.

Estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan GFP-actina

Los microtúbulos son polímeros inherentemente inestables, y su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Aquí se describen los protocolos que utilizan microtúbulos segmentados con tapones estabilizadores fotoescindible. La despolimerización de los microtúbulos segmentados puede ser activado con una alta resolución temporal y espacial, ayudando de este modo el análisis de los movimientos con los extremos de los microtúbulos desmontaje.

Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends

Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Aquí se presenta un protocolo integral para realizar experimentos ultrarrápidos de abrazadera de fuerza en motores de miosina-5 procesuales, que podrían extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso. El protocolo detalla todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis.

Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

Este protocolo es una guía para visualizar actina dinámica y microtúbulos utilizando un ensayo de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF) in vitro .

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Este artículo presenta protocolos para la ingeniería y caracterización de redes compuestas tridimensionales sintonizables de filamentos de actina coentrelazados y microtúbulos. Los compuestos experimentan una reestructuración activa y movimiento balístico, impulsado por motores de miosina II y quinesina, y están sintonizados por las concentraciones relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras y reticulantes pasivos.

Reconstitución y caracterización de compuestos de actina-microtúbulos con dinámica y mecánica accionada por motor sintonizable

En este trabajo, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para estudiar la poroelasticidad de los geles de actomiosina en condiciones controladas. Se cuantifica la dinámica del gel de actomiosina y el disolvente incrustado, a través de la cual se demuestra la porosidad de la red. También discutimos los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.

La mecánica de las redes de actomiosina contráctil (poro-)elástica como sistema modelo del citoesqueleto celular

Aquí, presentamos métodos para preparar ensamblajes de actina cuasi-bidimensionales (2D) entrelazados, reticulados y de cristal líquido a partir de proteínas purificadas.

Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

Aprende a construir cámaras de flujo y fusión para microscopía usando parafilm y calor. Este método permite crear sellos estables para estudios de imagen avanzados en neurociencia y biología celular.

Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía de Time-lapse

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