Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía de Time-lapse
8 de noviembre de 2006
Bien, lo que me gustaría hacer hoy es mostrarles cómo construir una cámara de flujo, una cámara de fusión para obtener imágenes en un microscopio vertical. Lo que hago entonces es crear dos espacios usando película. Así que lo que hago es tomar la película para, la corto en tiras pequeñas.
A continuación, esto formará básicamente los canales para las paredes, y los seco con un aire inclinado. Puse la tapa encima del para, y aquí está el terminado. Luego lo caliento en un bloque de calor para derretir el parámetro y, básicamente, crear un sello.
Entonces, lo que es esto, es el vidrio de cobertura aquí, y luego encima del vidrio de cobertura hay dos capas de phim como ven aquí. Y luego, encima de esto, de nuevo, hay un cubreobjetos de 22 por dos metros de dos milésimas de pulgada. Este de aquí, que presioné contra el param para que cayera el sello.
Bien, entonces el líquido va en una dirección aquí y puedo succionarlo con un papel de filtro aquí en esta dirección. Y te mostraré cómo hacerlo en un momento. Así que lo que me gusta hacer es ponerlo en una cámara humidificada, que es muy sencillo.
Tome dos tipos de tiras elevadas y tenga un filtro de papel debajo. Y para mantenerlo ruidoso mientras yo, puse la cubierta, el deslizamiento de la cubierta en la cámara de flujo. Ahora, la forma en que se introduce una solución en la cámara es que simplemente se coloca la punta de la pipeta en la entrada de la cámara y se divide.
Ahora lo que hago es incubar la cámara con la tapa cerrada durante 10 minutos. Lo que suelo hacer para succionar el líquido del otro lado es usarlo, conseguir un papel de filtro y cortarlo en tiras finas como esta. Y tomo una de estas tiras delgadas y aplico simultáneamente la solución en la entrada mientras pongo el papel de filtro en la salida para succionar el intercambio, la solución.
Así que verás que el líquido fluye a través de la solución. Y luego espero cinco minutos para el cierre medio. Ahora, lo que estoy listo para hacer es poner esa actina y la actina, en realidad tengo que polimerizar, polimerizo dentro de la cámara de flujo y son los mismos procedimientos antes.
Entonces, porque así, y luego ahora que la acción está polimerizada, lavo todo el exceso de acción no polimerizada usando un gran volumen de tampón. Así que aquí tengo alrededor de cien microlitros y son unos pocos volúmenes de tampón de la cámara de reacción. Simplemente, ya sabes, cuando el papel de filtro se satura, tengo que cambiar la dirección. ¿Bien?
Y por eso estoy listo para hacer imágenes con esto. Por lo tanto, cámara de perfusión con actina unida a ella. Ahora tomo el portaobjetos, lo monto bajo el microscopio y, dado que estoy tomando imágenes con un objetivo de aceite, voy a poner un poco de aceite de inmersión en la superficie superior de la cubierta, al tacto con la hierba, como una solución o proteína o cualquier cosa que actúe en el interior.
Así que lo que hago es que puedo intercambiar el lado de la solución mientras hago las imágenes de lapso de tiempo. Como tal.
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Visión general
Este artículo demuestra la construcción de una cámara de flujo y una cámara de fusión para imágenes en un microscopio vertical. El proceso implica crear canales utilizando parafilm y sellarlos con calor.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
Antecedentes
- Las cámaras de flujo son esenciales para varias técnicas de imagen.
- La construcción de una cámara de fusión permite capacidades de imagen mejoradas.
- El parafilm se usa comúnmente en entornos de laboratorio para crear sellos.
- Entender el proceso de construcción es crucial para los investigadores en el campo.
Propósito del estudio
- Proporcionar una guía paso a paso para construir una cámara de flujo.
- Ilustrar el uso de parafilm en la creación de cámaras de imagen.
- Mejorar la accesibilidad de las técnicas de imagen para los investigadores.
Métodos utilizados
- Cortar parafilm en tiras para formar canales.
- Secar las tiras con aire inclinado.
- Colocar un cubreobjetos encima del parafilm.
- Calentar el conjunto en un bloque de calor para crear un sello.
Principales resultados
- Se construyó con éxito una cámara de flujo funcional.
- El proceso de sellado fue efectivo para crear un ambiente estable para la imagen.
- El método demostrado es reproducible para uso en laboratorio.
- Los investigadores pueden utilizar esta técnica para varias aplicaciones de imagen.
Conclusiones
- La construcción de cámaras de flujo y fusión es sencilla.
- Este método puede facilitar estudios de imagen avanzados.
- La accesibilidad a tales técnicas puede mejorar los resultados de la investigación.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
