Name: Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprende a aislar vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos mediante un dispositivo microfluídico con fraccionamiento por flujo de campo asimétrico. Este método permite el procesamiento continuo y automatizado.

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Agradecemos a todos los donantes que participaron en este estudio, al personal de la Base de Datos del Genoma de Letonia por proporcionar las muestras. El Instituto de Física del Estado Sólido de la Universidad de Letonia, como Centro de Excelencia, ha recibido financiación del Programa Marco Horizonte 2020 de la Unión Europea H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 en virtud del acuerdo de subvención n.º 739508, proyecto CAMART2. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto No. lzp-2019/1-0142 y Proyecto No: lzp-2022/1-0373.

Dispositivo microfluídico para el aislamiento continuo de vesículas extracelulares de orina humana

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A.A., G.M. y R.R. son fundadores, miembros de la junta directiva y accionistas de Cellbox Labs, LLC

El dispositivo microfluídico presentado ofrece un método prometedor para el aislamiento y la extracción de vehículos eléctricos de fluidos biológicos, abordando algunas de las limitaciones críticas de los métodos estándar de oro existentes, como UC y SEC12. Se sabe que la UC y la SEC requieren mucha mano de obra, consumen mucho tiempo y tienen un bajo rendimiento, lo que las hace menos adecuadas para aplicaciones de alto rendimiento en las que se necesitan grandes cantidades de vehículos eléctricos21,22. Por el contrario, el dispositivo microfluídico descrito puede procesar continuamente un volumen sustancial de hasta 20 ml de fluido biológico con una intervención mínima del usuario, lo que lo convierte en un potencial cambio de juego para entornos industriales o clínicos. Una de las principales ventajas de este dispositivo microfluídico es su capacidad para estandarizar el aislamiento de los vehículos eléctricos y mejorar la reproducibilidad en comparación con los métodos tradicionales que implican pasos manuales. Al reducir la variabilidad de la fabricación de dispositivos de aislamiento de vehículos eléctricos a través de la fabricación en masa, el rendimiento del dispositivo puede controlarse mejor y ser consistente, lo cual es vital para aplicaciones como la terapéutica y el diagnóstico basados en vehículos eléctricos. Además, la compatibilidad del dispositivo con la fabricación de grandes volúmenes a través del moldeo por inyección de reacción de sustratos adecuados mejora aún más su potencial de escalabilidad y adopción más amplia.
Para garantizar la reproducibilidad y un rendimiento constante, es necesario un protocolo extenso y bien definido, tanto para producir el chip como para su uso en experimentos. El chip está diseñado pensando en la industrialización. Sin embargo, durante la fabricación del dispositivo en el entorno de laboratorio, se debe prestar atención a evitar la formación de burbujas, garantizar una unión precisa y robusta, y realizar pruebas exhaustivas a velocidades de flujo más altas que las esperadas en experimentos reales. Esta precaución es especialmente importante para los dispositivos COC-OSTE, ya que pueden ser propensos a fugas debido a una unión fallida, especialmente a caudales más altos. Además, dado que OSTE es un material fotosensible, la fabricación del dispositivo debe realizarse con luz amarilla para evitar la exposición innecesaria a los rayos UV. Dado que esta tecnología aún se encuentra en sus etapas iniciales, los investigadores deben experimentar con diferentes velocidades de flujo para identificar la configuración óptima para su aplicación específica, ya que aún no se han establecido protocolos estandarizados para este nuevo método, y la viscosidad del líquido puede afectar claramente la eficacia del aislamiento de EV según nuestros resultados. Siguiendo estas directrices y abordando los retos de la estandarización, el potencial de este dispositivo microfluídico para el aislamiento de vehículos eléctricos puede realizarse plenamente en diversas áreas de investigación y aplicaciones.
El método de aislamiento de vehículos eléctricos mediante el dispositivo microfluídico permite realizar amplias modificaciones y solucionar problemas para optimizar el rendimiento. Para mejorar la separación de partículas, los investigadores pueden explorar canales más largos, diferentes porosidades de membrana y densidades de poros, y dimensiones alteradas. Si hay muchas partículas grandes en la salida de partículas pequeñas, probar una velocidad de entrada de tampón más alta puede ser beneficioso, mientras que si hay muchas partículas pequeñas en la salida de partículas grandes, se recomienda experimentar con un canal más largo o una membrana con poros más grandes. Abordar la absorción de partículas puede implicar el ajuste de las velocidades de flujo, las modificaciones de la superficie y la composición de OSTE o cambiar el tiempo de exposición a los rayos UV. Para los dispositivos que experimentan inestabilidad y fugas, la disminución de las velocidades de flujo y la garantía de un pegado adecuado son pasos cruciales. Para minimizar el daño de los vehículos eléctricos, los investigadores pueden reducir las velocidades de flujo, lavar con PBS más a fondo después de la esterilización del dispositivo y considerar el uso de poros de membrana más pequeños o técnicas y materiales alternativos de diseño de moldes. A través de estos ajustes, el dispositivo microfluídico se puede ajustar, liberando su potencial para diversas aplicaciones en la investigación de vehículos eléctricos y campos relacionados. Además, para optimizar el rendimiento del dispositivo, se podría incorporar la caracterización de muestras aguas arriba, incluidas las mediciones de densidad y viscosidad, para ajustar los parámetros de flujo. Además, debe hacerse especial hincapié en la naturaleza de la muestra, dada la no esterilidad comprobada de los biofluidos23. En consecuencia, la esterilización de las muestras antes de su administración en aplicaciones clínicas debe ser debidamente considerada.
A pesar de estos desafíos, el dispositivo microfluídico tiene un inmenso potencial en diversas áreas de investigación. Su capacidad para aislar continuamente los vehículos eléctricos de grandes volúmenes de muestras muy heterogéneas abre la puerta a la automatización, lo que facilita las aplicaciones de alto rendimiento y permite un análisis más profundo de los vehículos eléctricos de diversas fuentes. La integración de este módulo microfluídico en diferentes dispositivos, como cartuchos de biorreactor de celda de fibra hueca o citómetros de flujo de alta resolución, podría hacer que las aplicaciones de vehículos eléctricos sean más amigables para la industria e impulsar la innovación en campos como la administración de fármacos, el diagnóstico y los cosméticos. En general, este dispositivo microfluídico representa un importante paso adelante en el campo de la investigación de los vehículos eléctricos, ya que ofrece un método eficiente y estandarizado para el aislamiento de vehículos eléctricos con aplicaciones prometedoras en una amplia gama de investigaciones y entornos industriales.

Las vesículas extracelulares (VE) son partículas derivadas de células unidas a la membrana que comprenden dos tipos principales: exosomas (30-200 nm) y microvesículas (200-1000 nm)1. Los exosomas se forman a través de la gemación hacia adentro de la membrana endosomal dentro de un cuerpo multivesicular (MVB), liberando vesículas intraluminales (ILV) en el espacio extracelular al fusionarse con la membrana plasmática1. Por el contrario, las microvesículas se generan por gemación y fisión hacia afuera de la membrana celular2. Los VE desempeñan un papel crucial en la comunicación intercelular mediante el transporte de proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y metabolitos, lo que refleja el estado fisiológico de la célula, incluido el crecimiento, la angiogénesis, la metástasis, la proliferación y la resistencia a la terapia3. Como resultado, se han convertido en biomarcadores y dianas terapéuticas prometedoras para enfermedades, incluido el cáncer, destacando su potencial en el diagnóstico y los sistemas de administración de fármacos4.
Para utilizar plenamente los VE en el diagnóstico y la terapéutica de enfermedades, es crucial un aislamiento eficiente de varios biofluidos5. Los métodos comunes incluyen la ultracentrifugación (UC), la centrifugación en gradiente de densidad, la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la filtración y el inmunoaislamiento6. La UC es una técnica ampliamente utilizada, pero puede producir partículas de densidad similar que no son EV y pueden generar agregados EV7. SEC ha ganado popularidad debido a su capacidad para proporcionar muestras de mayor pureza al excluir partículas en función del tamaño en lugar de la densidad8. Sin embargo, la selección cuidadosa del tamaño de poro apropiado para la columna SEC y la optimización de las condiciones de cromatografía son esenciales para minimizar el coaislamiento de partículas no deseadas como quilomicrones y lipoproteínas de baja densidad8. A pesar de su eficacia, ambos métodos requieren mucho tiempo y son difíciles de automatizar, especialmente para muestras de mayor volumen, como medios celulares u orina, lo que limita su escalabilidad para aplicaciones industriales9.
En los últimos años, el fraccionamiento de campo de flujo de campo asimétrico (A4F) ha evolucionado como una poderosa técnica de separación para la separación de partículas de tamaño micro y nanométrico basadas en el tamaño y la flotabilidad10. El principio de funcionamiento de A4F se basa en un canal microfluídico dotado de una membrana porosa en su base, generando una fuerza ejercida hacia la membrana llamada flujo cruzado10. Cuando se combina con el movimiento browniano y el flujo de Poiseuille inherente al sistema, el flujo cruzado facilita la separación eficiente de partículas debido a la posición variable de las partículas dentro de la dinámica de flujo11. A pesar de los beneficios, este método se limita a volúmenes de muestra dentro del rango de microlitros12 y requiere un paso de enfoque adicional, extendiendo la duración del proceso10.
Durante la última década, la microfluídica ha ganado protagonismo como herramienta para la separación rápida, eficiente y clínicamente fiable de los EV13. Sin embargo, la mayoría de los métodos microfluídicos diseñados para la separación de VE están optimizados para muestras de EV de pequeño volumen y alta concentración o dependen de procedimientos de separación complejos14. Además, dentro del campo de la microfluídica, el polidimetilsiloxano (PDMS) es reconocido como el material de referencia debido a su transparencia óptica, biocompatibilidad y facilidad de uso15. Sin embargo, su conocida propensión a absorber pequeñas moléculas lipofílicas, incluidas las VE, puede ser problemática para su aplicación en el campo de las VE13.
El copolímero de olefina cíclica (COC) es un material de uso frecuente en microfluídica debido a su biocompatibilidad, pequeña absorción de moléculas y alta resistencia química15. Sin embargo, la fabricación de dispositivos COC a menudo implica procesos complejos o equipos especializados16. Alternativamente, el tiol-eno fuera de estequiometría (OSTE) es una alternativa prometedora al PDMS debido a la disminución de la absorción de moléculas pequeñas, la estabilidad química superior, la facilidad de fabricación y el proceso de fabricación escalable17,18. Sin embargo, debido a las complejas conexiones a los tubos, los dispositivos pueden ser propensos a tener fugas19.
El objetivo de este estudio fue diseñar y fabricar un dispositivo microfluídico que combinara OSTE y COC y el principio A4F bifurcado para la separación de EV a partir de muestras de gran volumen, como orina o medios celulares.

<table><tbody><tr><td>0,1 y micro; m carboxilato FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>Concentración de existencias: 3,6 x 1013 perlas/mL (dependiendo del lote)</td></tr><tr><td>0,5 mL tubos de microcentrífuga</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Jeringa de cono Luer de un solo uso sin aguja</td><td>RAYS</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 &micro; m poliestireno FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>Concentración de existencias: 1 x 1010 perlas/mL (dependiendo del lote)</td></tr><tr><td>10 mL Pipetas serológicas</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL (100k) Filtros centrífugos Amicon Ultra</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Tubos Protein LoBind</td><td>Jeringas Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>20 mL</td><td>BD PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 y micro; m ID Tubo de poliéter éter cetona</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa Unidades de filtro centrífugo MWCO</td><td>Merck Millipore,UFC200324</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 mL Jeringa médica sin aguja</td><td>Anhui Hongyu Wuzhou Medical</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubos cónicos</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti rotor ultracentrífugo de ángulo fijo</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 y micro; m ID tubo de politetrafluoroetileno</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 pocillos, f-bottom, unión med.</td><td>Placa de ELISA</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), sin suero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas Plataforma</td> <td>de portaobjetosMicrofluídica Chipshop</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas plataforma de portaobjetos de microscopía 2 x 16 Mini Luer&nbsp;</td><td>Chipshop microfluídico</td><td>10000387</td><td></td></tr><tr><td>controlador de presión Elveflow OB1</td> Conectores Luer del Grupo <td></td><td></td><td>Elvesys</td></tr><tr><td></td><td>Darwin Microfluidics</td><td>&nbsp; CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>Alineador de mascarillas Suss MA/BA6</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>analizador de nanopartículas&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio óptico Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Crystal Clear</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg libre. Biorreactivos de Fisher. 100 g</td> Membrana <td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>PC (diámetro de poro de 50 nm, densidad del 11,8%)</td><td>it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Bélgica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, estériles</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/columna de 35 nm</td><td>Columna Izon</td><td>SP5</td><td>SEC</td></tr><tr><td>QSIL 216 Kit de elastómero de silicona</td><td>PP& S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina Tough Black</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti rotor ultracentrífugo oscilante</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 matraz de suspensión</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>TIM4-Fc proteína</td><td>Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina)</td><td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML Sustrato de</td><td>peroxidasa de rábano picante</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima L100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidad de limpieza ultrasónica P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td> <td>universal de microplacasBio-Tek instruments</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de recolección de orina, 150 ml, estéril</td><td>APTACA</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 25 Filtro de jeringa</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Sistema de</td><td>dispersión dinámica de luz (DLS) analítico&</td><td></td>nbsp;</tr><tr><td>Zortrax Inkspire</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico a4f bifurcado

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Las vesículas extracelulares (VE) tienen un inmenso potencial para diversas aplicaciones biomédicas, como el diagnóstico, la administración de fármacos y la medicina regenerativa. Sin embargo, las metodologías actuales para aislar los vehículos eléctricos presentan desafíos significativos, como la complejidad, el consumo de tiempo y la necesidad de equipos voluminosos, lo que dificulta su traslación clínica. Para abordar estas limitaciones, nos propusimos desarrollar un sistema microfluídico innovador basado en tiol-eno de copolímero de olefina cíclica fuera de estequiometría (COC-OSTE) para el aislamiento eficiente de EV de muestras de gran volumen de manera continua. Al utilizar la separación basada en el tamaño y la flotabilidad, la tecnología utilizada en este estudio logró una distribución de tamaño significativamente más estrecha en comparación con los enfoques existentes a partir de muestras de orina y medios celulares, lo que permite apuntar a fracciones específicas de tamaño EV en aplicaciones futuras. Nuestro innovador diseño de dispositivo microfluídico COC-OSTE, que utiliza la tecnología de fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico bifurcado, ofrece un enfoque de aislamiento EV sencillo y continuo para muestras de gran volumen. Además, el potencial para la fabricación en masa de este dispositivo microfluídico ofrece escalabilidad y consistencia, lo que hace factible integrar el aislamiento de EV en diagnósticos clínicos rutinarios y procesos industriales, donde la alta consistencia y rendimiento son requisitos esenciales.

Fabricamos un dispositivo microfluídico utilizando un molde de doble negativo impreso en 3D (Figura 1) mediante litografía blanda (Figura 2A) para la separación de EV de alto rendimiento basado en el principio A4F bifurcado (Figura 2B, C). La configuración requiere una bomba y una estación de flujo continuo, como se puede ver en la Figura 3, para el aislamiento de vehículos eléctricos de manera automatizada. En primer lugar, para evaluar la prueba de concepto de los dispositivos, se preparó una mezcla de perlas de poliestireno con diámetros de 100 nm y 1000 nm para representar vesículas y restos celulares finos, respectivamente10. Se llevaron a cabo experimentos con caudales variables para la mezcla de perlas, con y sin flujo bifurcado, para investigar el efecto de la velocidad lineal en la eficiencia de separación. En todos los experimentos, la recuperación de perlas pequeñas se mantuvo constante y por encima del 90 %10, lo que demuestra el potencial del dispositivo para recuperar vehículos eléctricos.
A continuación, evaluamos y comparamos el potencial del dispositivo COC-OSTE para aislar los VE de grandes volúmenes (&gt;1 mL) de biofluidos complejos con un preprocesamiento mínimo. De este modo, se utilizó la orina de 10 donantes sanos (Figura 4) y los medios celulares de dos líneas celulares de próstata diferentes (Figura 5) como plantilla para aislar simultáneamente las VE siguiendo tres procedimientos diferentes: ultracentrifugación (UC), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y el dispositivo OSTE-COC basado en microfluídica A4F. Después del aislamiento, se evaluó el número total de partículas y su distribución de tamaño mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). En promedio, el dispositivo OSTE-COC mostró una mejor recuperación total de partículas de biofluidos en comparación con la UC, pero la significación estadística solo se logró al combinar los números de partículas de ambos puertos (Figura 4A). Para comparar el rendimiento del dispositivo con otros sistemas, se debe tener en cuenta la salida de R &amp; L junta. Como se muestra en la Figura 4, el rendimiento conjunto de la salida L y R en la recuperación de EV supera a UC y SEC. Por separado, el puerto L fue diseñado para capturar la pequeña fracción EV, mientras que el puerto R fue diseñado para recolectar la fracción EV más grande con otras moléculas de tamaño similar. Curiosamente, la recuperación utilizando el R-PORT del dispositivo OSTE-COC fue ligeramente mayor que la SEC y la UC solas (Figura 4A). La expresión de CD63 mostró un patrón similar (Figura 4C). Este hallazgo indica que el dispositivo OSTE-COC fue más efectivo en la recuperación total de EV. Se encontró una distribución de tamaño equivalente entre las diferentes metodologías, excepto para UC, que muestra una mayor distribución de tamaño de partícula (Figura 4B).
Se observaron resultados comparables en cultivos de medios celulares. En ambos escenarios, la recuperación total de partículas de ambos puertos del dispositivo mostró un rendimiento superior en comparación con las metodologías SEC o UC (como se muestra en la Figura 5A, B). En particular, los EV derivados de células PC3 demostraron una distribución de tamaño distinta, con una mayor homogeneidad en la distribución L-PORT cuando se contrastó con otros grupos experimentales (Figura 5C,D). Además, el análisis de la expresión de CD63 confirmó las mayores tasas de recuperación de EV logradas utilizando el dispositivo COC-OSTE (como se ilustra en la Figura 5E, F). En la Tabla 1 se presenta un resumen que compara las características de aislamiento de las diferentes metodologías examinadas en este estudio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg"> Figura 1: Dimensiones del molde de doble negativo en forma de serpentina 3DP y vista isométrica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg"> Figura 2: Dispositivo microfluídico COC-OSTE. (A) Esquema de los diferentes pasos principales de fabricación del dispositivo OSTE-COC. (B) Principio de funcionamiento del dispositivo. (C) Imagen del dispositivo terminado. Barra de escala: 15 mm. Esta figura ha sido modificada con permiso de Priedols et al.10 y Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg"> Figura 3: Configuración experimental del dispositivo. La bomba de jeringa está a la izquierda, el dispositivo OSTE-COC está en el medio y la estación de recuperación está a la derecha. Esta figura ha sido modificada con permiso de Priedols et al.10 y Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg"> Figura 4: Distribución del tamaño del EV urinario y recuperación de partículas de 10 donantes mediante ultracentrifugación (CU), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y el dispositivo COC-OSTE. (A) Cantidad de partículas recuperadas de cada método de aislamiento mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Los datos se representan como media +/- desviación estándar. Significación estadística denotada por * (p&lt;0.05). (B) Los diagramas de caja muestran la distribución promedio del tamaño de partícula entre todas las muestras de orina evaluadas por NTA, con bigotes que indican los valores mínimo y máximo. Los valores de p se derivaron de las comparaciones con CU, indicando **** una alta significación estadística (p&lt;0,0001). (C) La mediana y el rango de la cantidad promedio de CD63, evaluados mediante el ensayo de inmunoabsorción enzimática de doble sándwich (dsELISA), para cada método de aislamiento, se calcularon en todas las muestras. Puerto L: Puerto izquierdo; R-port: Puerto derecho. Esta figura ha sido modificada con permiso de Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg"> Figura 5: Caracterización de VE aisladas de células PC3 y LNCaP utilizando diferentes métodos. (A) Cantidad de partículas recuperada de medios PC3 mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) representada por la media +/- desviación estándar. (B) Cantidad de partículas recuperadas de medios celulares LNCaP utilizando NTA representada como media +/- desviación estándar. (C) La distribución mediana del tamaño de partícula de los EV de los cultivos PC3, junto con el rango, se determinó mediante NTA. (D) Distribución del tamaño medio de los VE aislados de cultivos LNCaP con rango. (E) Mediana y rango de expresión de CD63 para cada método de aislamiento para EV derivado de líneas celulares PC3, utilizando un ensayo de inmunoabsorción enzimática de doble sándwich (dsELISA). (F) Mediana y rango de expresión de EV CD63 derivada de LNCaP por dsELISA para cada método de aislamiento. UC: Ultracentrifugación; SEC: Cromatografía de exclusión por tamaño; Puerto L: Puerto izquierdo; R-port: Puerto derecho. Esta figura ha sido modificada con permiso de Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>UC</td>
			<td>SEC</td>
			<td>COC-OSTE</td>
		</tr><tr><td>Tiempo de procesamiento/muestra</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>Rendimiento</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Costo/muestra</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Pureza</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Automatización</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Rendimiento de los vehículos eléctricos</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Selección de tamaño</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1. Comparación de las características de aislamiento de los VE con los tres métodos: UC SEC y el dispositivo COC-OSTE. UC: Ultracentrifugación; SEC: Cromatografía de exclusión por tamaño. COC-OSTE: tiol-eno de copolímero de olefina cíclica fuera de estequiometría. +: bajo; ++: medio; +++: alto. * Depende del dispositivo.

Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

Vemos el potencial de las vesículas extracelulares, pero también reconocemos la dificultad de su aislamiento, especialmente a partir de biofluidos de muestras grandes, como los medios de los biorreactores. En esta investigación probamos si podemos utilizar el fraccionamiento asimétrico de flujo de campo para aislar vesículas extracelulares. A partir de ahora, es imposible aislar vesículas extracelulares directamente de los biofluidos en un flujo continuo para su integración en biorreactores.En cambio, los biofluidos deben recolectarse y procesarse primero, lo que agrega variabilidad y mano de obra. Nuestro dispositivo, diseñado para el aislamiento de vesículas extracelulares a partir de biofluidos de gran volumen, permite la integración con biorreactores para un flujo continuo y la automatización. Descubrimos que la viscosidad del líquido podría afectar el aislamiento de las vesículas extracelulares mediante el fraccionamiento de flujo de campo asimétrico.Estamos explorando si la adaptación de los flujos de biofluidos y tampones a la viscosidad puede mejorar el aislamiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Watson, D. C., et.al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el aislamiento y la concentración de vesículas extracelulares (EV) derivadas de la membrana externa de bacterias modificadas genéticamente. El proceso consiste en cultivar las bacterias para liberar vehículos eléctricos, seguido de pasos secuenciales de centrifugación y filtración para eliminar células y desechos.

Aislamiento y enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de la membrana externa de bacterias

Fuente: Watson, D. C., et al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el uso de la cromatografía de exclusión por tamaño con perlas de resina porosa para aislar vesículas extracelulares (EV) bacterianas de un filtrado de cultivo bacteriano. Los EV más grandes eluyen temprano al evitar los poros de la resina, mientras que las proteínas más pequeñas ingresan a los poros y se eluyen más tarde.

Aislamiento de vesículas extracelulares bacterianas mediante cromatografía de exclusión por tamaño 

Este protocolo detalla un método para aislar vesículas extracelulares (SVE), pequeñas partículas membranosas liberadas de las células, a partir de tan poco como 10 muestras de suero l. Este enfoque evita la necesidad de ultracentrifugación, requiere sólo unos pocos minutos de tiempo de ensayo, y permite el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de muestras de volúmenes limitados.

Dispositivos basados ​​en papel para aislamiento y caracterización de extracelular vesículas

Este protocolo describe una arquitectura de sistema para realizar separaciones automatizadas de partículas de pequeño volumen (0,15-1,5 ml) utilizando un dispositivo microfluídico, y analiza métodos para optimizar el rendimiento y el funcionamiento del dispositivo acustofluídico.

Una plataforma de microfluidos para el procesamiento de precisión de pequeño volumen de la muestra y su uso para Tamaño partículas biológicas separadas con un Microdevice acústica

Aquí, describimos a dos protocolos de aislamiento de vesículas extracelulares, ultrafiltración centrifugación y ultracentrifugación con centrifugación gradiente de densidad, para aislar las vesículas extracelulares de muestras de líquidos de lavado broncoalveolar murino. Las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar murino por ambos métodos se cuantifica y caracteriza.

Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

Aquí presentamos un protocolo fácilmente aplicable para evaluar la estabilidad del almacenamiento de las vesículas extracelulares, un grupo de nanopartículas naturales producidas por las células. Las vesículas se cargan con glucuronidasa como una enzima modelo y se almacenan en diferentes condiciones. Después del almacenamiento, se evalúan sus parámetros fisicoquímicos y la actividad de la enzima encapsulada.

Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

Este protocolo aísla las vesículas extracelulares (EV) lejos de los viriones con alta eficiencia y rendimiento mediante la incorporación de precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas para permitir un flujo de trabajo simplificado y una reducción del inicio requisitos de volumen, lo que resulta en preparaciones reproducibles para su uso en todas las investigaciones de vehículos eléctrico.

Purificación de preparaciones de vesícula extracelular de alto rendimiento lejos del virus

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento, la concentración y la caracterización de vesículas extracelulares de cultivos de cianobacterias. También se discuten los enfoques para purificar vesículas de cultivos a diferentes escalas, las compensaciones entre metodologías y las consideraciones para trabajar con muestras de campo.

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas

Este protocolo demuestra cómo aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEV) con un entorno de laboratorio simple. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores de sEV y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizan por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el ensayo de proteínas BCA, el western blot y el microscopio electrónico de transmisión, respectivamente.

Un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales humanas

Este protocolo proporciona un método de aislamiento rápido y específico del tamaño para pequeñas vesículas extracelulares al optimizar el tamaño de la boquilla de pulverización de aire, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de muestra, el voltaje, la ganancia y los parámetros del umbral de activación.

Optimización de los parámetros de clasificación por citometría de flujo para el aislamiento y purificación de alto rendimiento de pequeñas vesículas extracelulares

Aprende a aislar vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos mediante un dispositivo microfluídico con fraccionamiento por flujo de campo asimétrico. Este método permite el procesamiento continuo y automatizado.

Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado (Video) | JoVE Journal

Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

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