Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución
10 de noviembre de 2023
La aplicación de capas de soporte a rejillas de microscopía electrónica criogénica (crioEM) puede aumentar la densidad de partículas, limitar las interacciones con la interfaz aire-agua, reducir el movimiento inducido por el haz y mejorar la distribución de las orientaciones de las partículas. Este artículo describe un protocolo robusto para recubrir rejillas crioEM con una monocapa de grafeno para mejorar la preparación de muestras criogénicas.
Un desafío común en la preparación de muestras de criomicroscopía electrónica es la localización de partículas en la interfaz aire-agua, lo que hace que las partículas adopten orientaciones preferidas y se desnaturalicen. En cambio, es mejor que las partículas descansen en la superficie de la rejilla, que promueven los soportes de película delgada, como el grafeno. Otro desafío es el requisito de concentraciones de muestra relativamente altas, que también podrían abordarse con grafeno.
Las rejillas recubiertas de grafeno ofrecen numerosas ventajas para la determinación de la estructura crioEM, pero históricamente han sido difíciles de fabricar internamente de forma reproducible, así como un coste prohibitivo para su compra comercial. Este protocolo permite la deposición robusta de grafeno monocapa, lo que reduce la barrera para que los usuarios empleen estas rejillas en su investigación. El grafeno es único debido a las propiedades de su material.
Es una monocapa de carbono y, por lo tanto, presenta un ruido de fondo mínimo. Otros soportes de rejilla crioEM, como una capa delgada de carbono amorfo o escamas de óxido de grafeno, no se pueden aplicar como una sola monocapa y contribuyen con más señal de fondo. Ahora que hemos establecido un protocolo robusto para la aplicación de grafeno a las rejillas crioEM, nos gustaría continuar con la funcionalización de rejillas recubiertas de grafeno con mangos de afinidad para la captura en la red directamente de lisados celulares.
Esto podría aliviar otro cuello de botella en la preparación de muestras crioEM.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo para recubrir rejillas de microscopía electrónica criogénica (cryoEM) con una monocapa de grafeno. El uso de grafeno mejora la densidad de partículas, minimiza las interacciones con la interfaz aire-agua y mejora la distribución de la orientación de las partículas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microscopía electrónica criogénica
- Ciencia de los materiales
- Técnicas de preparación de muestras
Antecedentes
- La localización de partículas en la interfaz aire-agua es un desafío común en la cryo-EM.
- Las orientaciones preferidas pueden provocar la desnaturalización de las partículas.
- Los soportes de grafeno pueden ayudar a que las partículas descansen sobre la superficie de la rejilla.
- Históricamente, las rejillas recubiertas de grafeno han sido difíciles y costosas de fabricar.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo robusto para la deposición de grafeno monocapa en rejillas cryoEM.
- Reducir las barreras para que los investigadores utilicen rejillas recubiertas de grafeno.
- Mejorar las ventajas de la determinación de la estructura cryo-EM.
Métodos utilizados
- Desarrollo de un protocolo para el recubrimiento de grafeno.
- Evaluación de la densidad y orientación de las partículas.
- Comparación de rejillas recubiertas de grafeno con rejillas tradicionales.
- Evaluación de la reproducibilidad en la fabricación de rejillas.
Resultados principales
- Las rejillas recubiertas de grafeno mejoran significativamente la localización de partículas.
- La mayor densidad de partículas permite una mejor determinación de la estructura.
- El protocolo robusto facilita la fabricación interna de rejillas de grafeno.
- Menores costos y mayor accesibilidad para los investigadores.
Conclusiones
- El uso de grafeno en las rejillas cryo-EM aborda los desafíos clave en la preparación de muestras.
- Este protocolo permite una adopción más amplia de rejillas recubiertas de grafeno en la investigación.
- Las propiedades únicas del grafeno mejoran las capacidades cryo-EM.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Sample preparation bottlenecks in cryo-electron microscopy (cryoEM) limit the throughput and reliability of high-resolution structure determination in early discovery and structural biology pipelines. The application of monolayer graphene to cryoEM grids addresses critical challenges of particle localization, orientation bias, and sample concentration requirements, directly impacting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Robust, reproducible graphene grid protocols enable broader enterprise adoption, supporting risk-adjusted portfolio advancement and efficient resource allocation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular targets at near-atomic resolution.
- Reduces sample denaturation and orientation bias, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates confident target validation by improving particle density and imaging consistency.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible grid supports for downstream cryoEM workflows.
- Improves assay reliability by minimizing background noise and enhancing quantitative imaging outputs.
- Supports scalable screening of structurally diverse complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Enables structural studies of disease-relevant complexes, supporting translational biomarker alignment.
- Provides continuity from discovery-stage structure elucidation to preclinical validation of molecular mechanisms.
- Reduces risk of late-stage biological failure by ensuring structural data quality.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene grid preparation integrates into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structure determination and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports robust null hypothesis testing by enabling accurate structural comparisons across conditions.
- Screening: Delivers reproducible, low-background grids for quantitative imaging and assay standardization.
- Analytics: Provides high-quality diffraction patterns and density maps for statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Maintains structural data continuity for disease-relevant targets and complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reproducible grid preparation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, enhances reproducibility, and lowers sample input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing sample preparation bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in graphene handling and cryoEM grid preparation.
- Needs access to spin coaters, glow discharge units, and UV ozone cleaners.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or sample types.
- Practical limitations include handling fragility and ensuring monolayer integrity during transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
