Name: Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 53 s
Description: Aprende a extraer veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial de polietileno y solución de aminoácidos. Este método eficiente facilita el análisis de proteínas y funciones del veneno.

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Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hainan (Subvención n.º 323QN262), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención n.º 31701843 y 32172483), el Fondo de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola de Jiangsu (Subvención No. CX(22)3012 y CX(21)3008), la Fundación "Shuangchuang Doctor" de la provincia de Jiangsu (subvención n.º 202030472) y el fondo inicial de la Universidad Agrícola de Nanjing (subvención n.º 804018).

1. Cría de insectos
<ol><li>Alimente Corcyra cephalonica con harina de maíz a una temperatura de 26 ± 1 °C y una humedad relativa del 40% ± 10%.</li>
	<li>Cría una cepa de T. dendrolimi del insectario Jilin en interiores utilizando los huevos de Corcyra cephalonica como huéspedes. Alimente a los adultos de avispa al 10% con agua de sacarosa en tubos de Drosophila a una temperatura de 26 ± 1 °C, humedad relativa del 70% ± 10%, luz (L): oscuridad (D) período de 14 h: 10 h.</li>
</ol>2. Preparación de tarjetas de huevo de película plástica de polietileno
<ol><li>Tome una película de plástico de polietileno con una longitud de 16 cm, un ancho de 12 cm y un grosor de 20 μm. Presione 30 protuberancias semicirculares con un diámetro de 2-3 mm y una altura de aproximadamente 3 mm utilizando una varilla abrasiva de vidrio de acuerdo con el diseño estándar de la placa PCR de 96 orificios. NOTA: El proceso de prensar 30 protuberancias semicirculares con una varilla de molienda de vidrio debe realizarse prestando atención a la presión porque una prensa demasiado fuerte perforará el plástico y contaminará la varilla de molienda sin veneno extraída.</li>
	<li>Desinfecte la película de plástico de polietileno prensado exponiendo ambos lados a la luz ultravioleta (UV) durante 1 h.</li>
	<li>Agregue una pequeña cantidad de alcohol polivinílico al 10% a la superficie semicircular.</li>
</ol>3. Parasitismo por Trichogramma dendrolimi 
<ol><li>Después de la anestesia con CO2 , coloque las avispas hembras de T. dendrolimi en una caja de recolección, y el número de avispas fue de ~ 3000.</li>
	<li>Coloque el lado convexo de la tarjeta de huevo de película hacia la caja de recolección y asegure los bordes con una banda elástica.</li>
	<li>Añadir 4 μL de solución de aminoácidos (6 g/L de leucina, 4 g/L de fenilalanina, 4,25 g/L de histidina) a cada protuberancia semicircular. Cúbrelo con una película plástica plana de polietileno de 16 cm de largo y 12 cm de ancho. Use una banda elástica para cubrir herméticamente la caja de recolección con dos hojas de plástico.</li>
	<li>Deje que las avispas T. dendrolimi parasiten libremente durante 4-8 h y proporcione un 10% de agua de sacarosa a través del algodón mojado.</li>
</ol>4. Recolección del veneno de T. dendrolimi 
<ol><li>Obtenga la solución de aminoácidos parasitados de la protuberancia interna de la tarjeta de huevo artificial y transfiérala a la tapa de los tubos de 1,5 ml.</li>
	<li>Cubra la tapa del tubo con una red de nailon de 10 μm con un diámetro de 25 mm, sujete firmemente la red de nailon y el tubo de centrífuga. Coloque el tubo de centrífuga en posición vertical para una centrifugación corta con una minicentrífuga (1360 x g) durante 10 s y recoja la solución filtrada (~100 μL de veneno de T. dendrolimi ).</li>
	<li>Mida la concentración de veneno de T. dendrolimi recolectado utilizando un kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Tabla de materiales).</li>
	<li>Almacene el veneno a -80 °C para su posterior análisis.</li>
</ol>5. Análisis SDS-PAGE
<ol><li>Añadir 30 μL de veneno de T. dendrolimi a 10 μL de tampón de carga de muestras de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) 4x (Tabla de materiales) y calentar a 95 °C durante 10 min.</li>
	<li>Realice el funcionamiento del gel SDS-PAGE a 130 V durante 120 min.</li>
	<li>Tiñir y decolorar el gel SDS-PAGE utilizando el aparato de tinción de proteínas (Tabla de materiales).</li>
</ol>

Parasitación artificial del huésped por Trichogramma dendrolimi y extracción de veneno

<ol><li>Pennacchio, F., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+developmental+strategies+in+parasitic+hymenoptera%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera.</a> Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).</li>
<li>Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+advances+on+composition%2C+function+and+evolution+of+venom+proteins+in+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps.</a> Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Asgari, S., Rivers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venom+proteins+from+endoparasitoid+wasps+and+their+role+in+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions.</a> Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).</li>
<li>Moreau, S. J. M., Guillot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+prospects+on+biosynthesis%2C+structures%2C+and+functions+of+venom+proteins+from+parasitic+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).</li>
<li>Yan, Z. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+venom+serpin+splicing+isoform+of+the+endoparasitoid+wasp+Pteromalus+puparum+suppresses+host+prophenoloxidase+cascade+by+forming+complexes+with+host+hemolymph+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases.</a> Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).</li>
<li>Woelke, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+and+biology+of+two+new+egg+parasitoid+species+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+reared+from+eggs+of+Heliconiini+butterflies+%28Lepidoptera%3A+Nymphalidae%3A+Heliconiinae%29+in+Panama%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+History%22%5BJournal%5D)">Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama.</a> Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).</li>
<li>Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+with+Trichogramma+in+China%3A+History%2C+present+status%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives.</a> Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).</li>
<li>Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+potassium+chloride+and+magnesium+sulfate+on+parasitoid+wasp+oviposition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition.</a> Science. 218, 4568(1982).</li>
<li>Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kairomonal+stimulation+of+oviposition+into+an+artificial+substrate+by+the+endoparasitoid+Microplitis+croceipes+%28Hymenoptera%29Braconidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae).</a> Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).</li>
<li>Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+Habrobracon+hebetor%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Biological+Control%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of Habrobracon hebetor.</a> Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).</li>
<li>Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+Trichogramma+ostriniae+with+artificial+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs.</a> Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).</li>
<li>Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviposition+behavior+of+twelve+species+of+Trichogramma+and+its+influence+on+the+efficiency+of+rearing+them+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro.</a> Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).</li>
<li>Xing, J. Q., Li, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+of+an+egg+parasite+Anastatus+japonicus+Ashmead+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro.</a> Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).</li>
<li>Moreau, S. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22It+stings+a+bit+but+it+cleans+well%22%3A+Venoms+of+Hymenoptera+and+their+antimicrobial+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">"It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).</li>
<li>Moreau, S. J. M., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venom+proteins+from+parasitoid+wasps+and+their+biological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function.</a> Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).</li>
</ol>

El autor no tiene nada que revelar ni intereses financieros contrapuestos.

Aquí, presentamos un método para extraer veneno de T. dendrolimi utilizando huéspedes artificiales. Los puntos clave en el experimento de recolección de veneno son los siguientes. (1) Durante la preparación, T. dendrolimi debe anestesiarse rápidamente con una concentración adecuada de CO2. Si la concentración deCO2 es demasiado baja, será insuficiente para anestesiar el Trichogramma rápidamente. Por el contrario, si la concentración es demasiado alta, Trichogramma...

Las avispas parasitoides son insectos himenópteros parásitos que son recursos importantes para el control biológico1. Existe una gran variedad de avispas parasitoides, con más de 600.000 especies estimadas2. La diversidad de avispas parasitoides supera con creces la de otros artrópodos venenosos, como serpientes, caracoles cono, arañas, escorpiones y abejas. El veneno es un factor parasitario importante en las avispas parasitoides. Para un parasitismo exitoso, el veneno se inyecta en el huésped, modulando el comportamiento, la inmunidad, el desarrollo y el metabolismo delhuésped. Además, el veneno de las avispas parasitoides muestra una notable diversidad en sus estructuras moleculares, objetivos y funciones, lo que refleja una compleja coevolución con sus huéspedes. Por lo tanto, el veneno parasitoide es un recurso valioso y subestimado de moléculas activas con fines insecticidas o médicos4. A diferencia del veneno de serpientes, caracoles cono, arañas, escorpiones y abejas, el veneno de avispa parasitoide no se puede recolectar por estimulación directa o estimulacióneléctrica. El método actual de extracción del veneno de avispa parasitoide es diseccionar el depósito de veneno. Sin embargo, las avispas parasitoides suelen ser pequeñas, y la disección de avispas parasitoides requiere altas habilidades técnicas. Por lo tanto, si podemos encontrar una manera de recolectar el veneno de las avispas parasitoides de manera eficiente y conveniente, será de gran ayuda investigar el veneno de las avispas parasitoides.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) es un género de avispas parasitoides diminutas (~0,5 mm de largo)6. Estas avispas se encuentran entre los agentes de control biológico más utilizados, especialmente en los huevos de diversas plagas de lepidópteros, tanto en la agricultura como en los bosques. Por ejemplo, T. dendrolimi, una de las especies de Trichogramma más utilizadas en China, se ha aplicado ampliamente para controlar una variedad de plagas agrícolas y forestales, como Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis y Chilo suppressalis. Estudios previos demostraron que las avispas Trichogramma podían inyectar sus huevos en huéspedes artificiales7. Los anfitriones artificiales se pueden crear utilizando materiales como cera8, agar9, Parafilm10 y película plástica11. La solución en huéspedes artificiales que induce suficiente oviposición para Trichogramma puede ser simple, como aminoácidos o sales inorgánicas12. Basado en la característica de que T. dendrolimi puede parasitar huéspedes artificiales, este estudio proporciona un nuevo método para extraer veneno de avispas parasitoides utilizando huéspedes artificiales. Este enfoque tiene como objetivo abordar las deficiencias de bajo rendimiento, baja pureza y susceptibilidad a la contaminación en las técnicas de extracción actuales. Mediante el uso de este método, se puede extraer una gran cantidad de veneno de alta pureza de T. dendrolimi , lo que satisface las necesidades de investigación científica y detección de moléculas bioactivas con fines insecticidas o médicos.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; m Red de nailon</td><td>Millipore NY1002500</td><td></td><td>Para filtrar los huevos</td></tr><tr><td>10% Alcohol polivinílico</td><td>Aladdin</td><td>P139533</td><td>Para atraer&nbsp; T. dendrolimi&nbsp; para poner huevos</td></tr><tr><td>10% Sacarosa agua</td><td>Sinopharm Reactivo Químico&nbsp;</td><td>10021463</td><td>Alimentar Trichogramma dendrolimi</td></tr><tr><td>4x tampón de carga LDS</td><td>Ace Hardware</td><td>B23010301</td><td>SDS-PAGE Caja de</td></tr><tr><td>recogida</td><td>Deli</td><td>8555</td><td>Contenedor para T. dendrolimi parasitism</td></tr><tr><td>Future PAGE&nbsp; 4&ndash; 12% (12 pocillos)</td><td>Ace Hardware</td><td>J70236502X</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>GenScript eStain L1 aparato de tinción de proteínas</td><td>GenScript</td><td>L00753</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Varilla de molienda de vidrio&nbsp; &nbsp;</td><td>Applygen</td><td>tb6268</td><td>Protuberancias semicirculares&nbsp;</td></tr><tr><td>L- Leucina</td><td>Solarbio</td><td>L0011</td><td>Componentes artificiales del huésped</td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Aladdina</td><td>A2219458</td><td>Componentes artificiales</td></tr><tr><td>del huésped L-fenilalanina</td><td>Solarbio</td><td>P0010</td><td>Componentes del huésped artificial</td></tr><tr><td>Minicentrífugas</td><td>Scilogex</td><td>D1008</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>MOPS-SDS tampón de funcionamiento Ace</td><td>Hardware</td><td>B23021</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA Omni-Easy Instant</td><td>Shanghai Yamay Biomedical Technology&nbsp;</td><td>ZJ102</td><td>Para la esimación de la concentración de proteínas del veneno</td></tr>, <tr><td>disposición de la placa PCR de 96 orificios</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB1400L</td><td>Protuberancias semicirculares&nbsp;</td></tr><tr><td>Película plástica de polietileno</td><td>Suzhou Aopang Trading &nbsp;</td><td>001c5427</td><td>Tarjeta de huevo artificial</td></tr><tr><td>Marcador de proteína de color preteñido (10&ndash; 180 kDa)</td><td>YiFeiXue Biotech</td><td>YWB007</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Banda elástica</td><td>Guangzhou qianrui biología ciencia y tecnología</td><td>009</td><td>Apriete la película de plástico y la caja de recolección</td></tr><tr><td>Estera de septos de caucho de silicona, 96 pocillos, orificio redondo</td><td>Sangon Biotech</td><td>F504416-0001</td><td>Protuberancias semicirculares&nbsp;</td></tr></tbody></table>

extracción de veneno de la avispa parasitoide trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Las avispas parasitoides son un grupo diverso de insectos himenópteros que sirven como recursos invaluables para el control biológico de plagas. Para garantizar el éxito del parasitismo, las avispas parasitoides inyectan veneno en sus huéspedes para suprimir la inmunidad de sus huéspedes, modular el desarrollo, el metabolismo e incluso el comportamiento de los huéspedes. Con más de 600.000 especies estimadas, la diversidad de avispas parasitoides supera a la de otros animales venenosos, como serpientes, caracoles cono y arañas. El veneno de avispa parasitoide es una fuente poco explorada de moléculas bioactivas con aplicaciones potenciales en el control de plagas y la medicina. Sin embargo, la recolección de veneno parasitoide es un desafío debido a la incapacidad de usar estimulación directa o eléctrica y la dificultad en la disección debido a su pequeño tamaño. Trichogramma es un género de avispas parasitoides de huevo diminutas (~0,5 mm) que se utilizan ampliamente para el control biológico de plagas de lepidópteros tanto en la agricultura como en los bosques. Aquí, reportamos un método para extraer veneno de T. dendrolimi usando huéspedes artificiales. Estos huéspedes artificiales se crean con una película de polietileno y soluciones de aminoácidos y luego se inoculan con avispas Trichogramma para el parasitismo. Posteriormente, el veneno fue recogido y concentrado. Este método permite la extracción de grandes cantidades de veneno de Trichogramma al tiempo que evita la contaminación de otros tejidos causada por la disección, un problema común en los protocolos de disección de reservorios de veneno. Este enfoque innovador facilita el estudio del veneno de Trichogramma , allanando el camino para nuevas investigaciones y posibles aplicaciones.

La concentración de proteínas de las muestras representativas de veneno se midió utilizando el kit de ensayo de proteínas, con los resultados presentados en la Tabla 1. Los resultados mostraron que la concentración de proteína de veneno recolectada por este método varió de 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, mientras que el control negativo de la solución de aminoácidos solo tuvo una concentración de proteína de 0,03 μg/μL a 0,05 μg/μL. La concentración de proteína de veneno recolectada por este método es mucho may...

Aquí, presentamos un protocolo para extraer veneno de Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial creado con una película de polietileno y una solución de aminoácidos.

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

La falta de métodos eficientes de extracción de veneno a menudo limita la investigación sobre el veneno de avispas parasitoides, especialmente en avispas parasitoides diminutas. Este estudio proporciona un método eficiente para extraer el veneno de Trichogramma con un seguimiento posterior al estudio del veneno de Trichogramma, como la compensación de proteínas y el análisis de la función del veneno. Anteriormente, ningún método de intercambio de veneno de avispa parasitoide requería la distinción de la reserva de veneno.Sin embargo, las avispas parasitoides son diminutas. No solo los requisitos técnicos para distinguir el veneno eran altos, sino que también es común la continuación de otros tejidos durante la disección. Nuestro método normal utiliza un huésped artificial, evitando así este tipo de problemas.En el futuro, nos centraremos en la agricultura y las aplicaciones médicas del veneno de Trichogramma. Nuestro objetivo es utilizar genes específicos de veneno insecticida para el control de plagas. Mientras tanto, planeamos investigar el potencial sin explotar del veneno de Trichogramma en metodología, particularmente su utilidad prospectiva en la mejora de las técnicas de inm

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Aprende a extraer veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial de polietileno y solución de aminoácidos. Este método eficiente facilita el análisis de proteínas y funciones del veneno.

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

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