Name: Un ensayo químico de acetil-clic para medir la acetilación de la acetil 1 de la histona acetiltransferasa 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprende a utilizar el ensayo químico de acetil-clic para medir la actividad de HAT1 en sustratos peptídicos. Este método escalable permite el cribado de alta capacidad de inhibidores de moléculas pequeñas con aplicaciones en descubrimiento de fármacos.

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Agradecemos a George Zheng por proporcionar H4K12CoA. Agradecemos a los miembros de Gruber Lab por sus útiles discusiones y comentarios. Agradecemos el apoyo de los NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) y la Fundación V (V2022-022).

1. Método 1: Producción y purificación del complejo recombinante HAT1/Rbap46
<ol><li>Descongelación, recuperación y expansión de células HEK293f<ol><li>Descongele 1-10 millones de células de mamíferos HEK293f26 en 30 ml de medios de expresión freestyle 293 en un matraz de 100 ml. Incubar en 8% de CO2 a 37 °C mientras gira a 60 rpm.</li>
		<li>Al día siguiente, cuente y verifique la viabilidad de la celda, luego ajuste la velocidad de rotación a 120 rpm. Expandir a 300 mL de cultivo en un matraz de 1 L, manteniendo la densidad de siembra en 500.000 células/mL y dividiendo las células antes de que la densidad supere 3 x 106 células/mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfección HEK293f<ol><li>Siembre 5 x 105 células/mL en un cultivo de 300 mL en un matraz de 1 L y cultive durante 24 h. Al día siguiente, cuente las células para asegurarse de que estén entre 7,5 x 105 y 1,2 x 106 células/ml.</li>
		<li>Preparar una mezcla de 300 μg de pHEK-FLAG-HAT1 y 300 μg de ADN plasmídico pHEK-Rbap46 en 30 mL de PBS. Agregue 1.2 mL de polietilenimina (PEI) al ADN/PBS y mezcle. Incubar durante 20 min a RT. Añadir la mezcla de DNA/PBS/PEI al cultivo de 300 mL e incubar a 37 °C durante 48 h a 120 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Recolección de células<ol><li>Cuente las células para asegurarse de que estén entre 1,7 x 106 y 2,5 x 106 células/ml. A esta densidad celular, añadir forskolina a una concentración final de 12,5 μM para activar HAT1 e incubar las células durante 30 min, 37 °C, 120 rpm.</li>
		<li>Pulverizar las células a 300 x g durante 5 min, lavar una vez con 30 ml de PBS y congelar rápidamente en N2 líquido. Almacenar a -80 °C hasta la purificación de la proteína o proceder directamente a la purificación.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de perlas FLAG complejas HAT1/Rbap46<ol><li>Lisar las células y preparar el extracto de proteína.<ol><li>Prepare el tampón de lisis añadiendo un comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa (PIC) a 50 ml de RSB-500 (20 mM de Tris-HCl pH 7,5, 500 mM de NaCl, 25 mM de MgCl2).</li>
			<li>Descongele el gránulo celular de 300 ml de cultivo en hielo y lise con 40 ml de tampón de lisis helado con Triton X-100 al 0,1%. Sonicar en hielo, luego centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4°C. Recoja todo el sobrenadante en un tubo de 50 ml con hielo, que ahora es el extracto de proteína.</li>
		</ol></li>
		<li>Prepara las cuentas de FLAG.<ol><li>Divida las perlas FLAG en cuatro tubos cónicos de 15 ml añadiendo 400 μl de suspensión de perlas de agarosa M2-FLAG en cada tubo que contenga 5 ml de glicina 0,1 M pH 3,5, Triton X-100 al 0,01 %. Agite vigorosamente cada tubo durante 5 s con la mano.</li>
			<li>Centrífuga de impulsos durante 30 s a 1000 x g a 4 °C, aspirar sobrenadante, lavar dos veces con 5 mL de RSB-500 + 0,1% Triton X-100 (Tx-100; sin inhibidor de la proteasa) e incubar en hielo.</li>
		</ol></li>
		<li>Realizar inmunoprecipitación con FLAG.<ol><li>Agregue 10 ml de extracto de proteína a cada tubo cónico de 15 ml que contenga perlas lavadas. Incubar los tubos a 4 °C con rotación invertida durante al menos 90 min o toda la noche.</li>
			<li>Lavar las cuentas encuadernadas 5 veces en 10 mL de RSB-500 + 0,1% Tx-100. Para cada lavado, invierta el tubo 2x-5x para resuspender las perlas, luego gránulos a 1000 x g durante 1 min a 4 °C. Por último, lavar 1 vez en RSB-100 (20 mM de Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de NaCl, 25 mM de MgCl2) + 0,1% de Tx-100.</li>
		</ol></li>
		<li>Elución del péptido FLAG: Eluir el complejo HAT1 en 1,5 ml de tampón de elución (EB) que contiene 0,5 mg/ml de péptido FLAG. Incubar a 4 °C durante al menos 1 h o toda la noche. Centrifugar por pulsos las perlas eluidas a 1000 x g durante 30 s a 4 °C y recoger el sobrenadante, que contiene el complejo HAT1/Rbap46 purificado.</li>
		<li>Concentra la proteína y elimina el péptido FLAG.<ol><li>Agregue eluido a un tubo de filtro de corte de 20 ml y 10,000 Dalton. Aumente el volumen a 15 ml con EB. Centrifugar a 2500 x g durante 15 min a 4 °C, repitiendo dos veces con 15 mL adicionales de EB cada vez.</li>
			<li>Recupere el eluido final del tubo del filtro y verifique la concentración de proteínas por A260. Espere una concentración de 1 mg de proteína total en 6 ml de EB (por cultivo inicial de 300 ml). Compruebe la pureza de la proteína mediante SDS-PAGE, Coomassie e inmunotransferencia, y almacene las alícuotas a -80 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Método 2: curva estándar de acetil-clic HAT1
<ol><li>Preparación de la curva estándar<ol><li>Sintetizar un péptido H4 N-terminal de control positivo con la secuencia: SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotina)], donde [Pra] denota Propargilglicina.</li>
		<li>Resuspender el péptido Pra a 0,1 mg/mL en DMSO. Mezcle el péptido Pra con el péptido de histona H4 biotinilado (1-23-GGK-biotina) para crear una curva estándar (Figura 2; volúmenes encontrados en la Tabla 1). Las curvas patrón pueden hacerse frescas antes del atado de la placa o, si se hacen de antemano, mezclarse con 20 μl de urea 8 M y almacenarse a -20 °C hasta la etapa 3.3.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Método 3: Ensayo de acetil-clic HAT1
<ol><li>Ensamblaje de reacciones de acetilación con inhibidores de prueba<ol><li>Ensamble reacciones de acetilación por duplicado en tubos de PCR de 0,2 ml o placas de PCR de 96 pocillos a partir de los siguientes componentes: péptido H4 de histona biotinilado (1-23-GGK-biotina) resuspendido en DMSO a 0,1 mg/ml (34,8 μM), enzima HAT1 prediluida en EB, tampón 20x (1M Tris pH 8,5, 0,1% NP40), DTT de 2 mM, 4-pentinoil-CoA disuelto en agua a 1 mg/ml (1 mM). Una reacción de 20 μL comprende 10 μL de enzima, 1 μL de péptido H4, 1 μL de tampón 20x, 1 μL de DTT premezclado y alícuota a pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos en hielo.</li>
		<li>Añadir 1 μL de DMSO (control negativo) o compuesto de prueba disuelto a 1-10 μM, o H4K12CoA25 (o inhibidor de control positivo adecuado), por pocillo. Mezclar mediante un pipeteo suave e incubar durante 10 minutos en hielo para permitir que se formen complejos enzima-inhibidores.</li>
	</ol></li>
	<li>Continuación de la reacción de acetilación<ol><li>Combine 2 μL de 4-pentinoil-CoA con 4 μL de agua, luego agréguelos a los pocillos. Mezclar suavemente mediante pipeteo, centrifugar a 300 x g durante 30 s a RT para recoger el contenido e incubar a 37 °C durante 1 h en tubos o placas tapados con lámina resellable.</li>
		<li>Procesar el contenido directamente para los productos de reacción o enfriar con 20 μL de urea 8 M y almacenar a -20 °C hasta el procesamiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Unión peptídica a la placa de neutravidina<ol><li>Agregue el contenido de la reacción con o sin urea a las placas de 96 pocillos recubiertas de neutravidina negra prebloqueada con albúmina sérica bovina (BSA) que contienen 80 μL de PBST (PBS + 0,1% Tween-20) por pocillo.</li>
		<li>Agregue péptidos de curva estándar por duplicado a sus propios pocillos que contengan 80 μL de PBST. Unir los péptidos con una suave agitación orbital durante 1 h a temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol></li>
	<li>Lavado: Una vez finalizada la unión, aspire el líquido de los pocillos y lave los pocillos con 200 μL de PBST 3x 15 pasadas (volumen de carrera de 180 μL) utilizando una arandela de placas.</li>
	<li>Reacción química de clic<ol><li>Prepare los reactivos para la reacción de clic de la siguiente manera: 100 mM de ligando Tris(3-hidroxipropiltriazolymetil)amina (THPTA) en agua y 20 mM de CuSO4 en agua. THPTA previene la hidrólisis catalizada por Cu (II) y apaga los radicales y peróxidos generados a partir de O2 / Cu / ascorbato.</li>
		<li>Añadir la mezcla THPTA/Cu a 300 mM de ascorbato de sodio en agua y 2,5 mM de azida de biotina en DMSO. La reacción de un clic contiene 140 μL de PBS, 10 μL de THPTA, 10 μL de CuSO4, 10 μL de ascorbato de sodio, 20 μL de biotina-azida. Mezcle siempre los reactivos de clic frescos, luego dispense 190 μL a cada pocillo, selle la placa e incube a 37 ° C durante 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavado: Aspirar el líquido de los pocillos y lavar la placa 3 veces con PBST (180 μL de volumen sistólico, 15 pasadas por cada lavado).</li>
	<li>Unión estreptavidina-rábano picante peroxidasa: Diluir estreptavidina-HRP (0,224 mg/ml) 1:10 en estreptavidina (0,224 mg/ml), luego diluir aún más 1:1000 en PBST. Añadir Steptavidin-HRP: mezcla de estreptavidina (100 μL por pocillo) e incubar a RT durante 1 h con una suave agitación orbital.</li>
	<li>Lavar 3 veces con PBST como en los pasos anteriores.</li>
	<li>Oxidación roja Amplex<ol><li>Combine los reactivos de detección de rojo Amplex de la siguiente manera: 4,45 ml de tampón NaHPO4 (1x = 50 mM de concentración final), 50 μL de rojo amplex (20 mM diluidos en DMSO), 500 μl deH2O2 diluido.</li>
		<li>Diluir H2O2 del 30% de stock al 3% en 1x tampón NaHPO4 , luego añadir 22,7 μL de 3% H2O2 en 977 μL de 1x tampón NaHPO4 (este es el H2O2 utilizado para la reacción amplex). Añadir 100 μL de la mezcla de reacción de rojo amplex por pocillo, incubar a RT durante 30 min protegido de la luz, y luego detectar la excitación/emisión de fluorescencia 571/585 nm utilizando un lector de placas de fluorescencia estándar.</li>
	</ol></li>
	<li>Cálculo de la inhibición enzimática: Calcule el porcentaje de inhibición (Figura 3) de acuerdo con la siguiente fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66054/66054eq01.jpg" style="margin: auto;">, donde D es el valor de fluorescencia de las reacciones de control tratadas solo con DMSO, X es el valor de las reacciones tratadas con compuestos de prueba y BG es el valor de los pocillos de fondo (control del péptido H4, sin enzima añadida).</li>
	<li>Curva de dosis: Seleccione los compuestos de prueba que inhiben la actividad de la enzima HAT1 para repetir los ensayos, con el compuesto diluido en serie. Determinar empíricamente las diluciones de los compuestos. Por ejemplo, comience con una concentración de stock de 2 mM y, a continuación, diluya en serie 1:3 durante ocho diluciones. A continuación, diluir 1:20 en ensayos enzimáticos que producen una dosis máxima de 100 μM.<ol><li>Representación gráfica de la curva: Utilice la regresión de mínimos cuadrados para ajustar las curvas de inhibición dosis-respuesta (utilizando los valores de inhibición porcentual del paso 3.10) en el software de análisis de datos (GraphPad Prism) y derive los valores de IC50 para cada compuesto (Figura 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Reacción de acetilación con acetil-CoA:<ol><li>Utilícelo para confirmar la actividad enzimática con el cofactor nativo acetil-CoA en lugar de 4-pentinoil-CoA. Llevar a cabo ensayos de acetilación de HAT1 como se describe en los pasos 3.1-3.2 con acetil-CoA en lugar de 4-pentinoil-CoA.</li>
		<li>Localice los productos de la reacción en membranas de nitrocelulosa (1-2 μL), déjelos secar, luego séquelos con anticuerpos anti-H4-lisina-12-acetilo o anti-H4-lisina-5-acetil. Cuantificar la señal de inmunotransferencia mediante densitometría.</li>
	</ol></li>
</ol>

Desarrollo de un ensayo basado en clic para el cribado de la actividad de la enzima HAT1

<ol><li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li>
<li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast%3A+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li>
<li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li>
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<li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li>
<li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47(2019).</li>
<li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967(2021).</li>
<li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li>
<li>Campos, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+program+for+processing+newly+synthesized+histones+H3.1+and+H4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).</li>
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</ol>

Hemos presentado patentes que describen el ensayo de acetil clic HAT1 (PCT/US20/29395). J.J.G. informa de acuerdos de consultoría con Sharma Therapeutics, LLC y Guidepoint y apoyo a la investigación (a su institución) de Hummingbird Biosciences.

En la última década, la química de clic se volvió prominente20, permitiendo el diseño preciso de estructuras químicas que interactúan. En este contexto, diversas conexiones covalentes bioortogonales21 han surgido como opciones prometedoras para la formación de complejos en su entorno natural. La química de clic emplea pares de grupos funcionales que exhiben reacciones rápidas y selectivas, comúnmente conocidas como "reacciones de clic". Estas reacciones se producen de forma eficiente en condiciones acuosas suaves y respetuosas con el medio ambiente. En este trabajo se presenta el desarrollo de una plataforma diseñada para identificar y caracterizar la actividad de la acetiltransferasaHAT1 24. Esta plataforma utiliza un ensayo enzimático basado en péptidos de alto rendimiento habilitado por la química de clic.
Una de las principales ventajas de este ensayo es que se basa en el complejo enzimático humano HAT1/Rbap46 obtenido a partir de la purificación de células humanas en lugar de una fuente bacteriana. Además, este método mide directamente la actividad enzimática en el sustrato peptídico, eliminando la necesidad de reacciones acopladas que podrían ser susceptibles de inhibición inespecífica. Si bien existen métodos basados en anticuerpos para evaluar la actividad enzimática21, el ensayo acetil-clic ofrece claras ventajas al evitar la variabilidad biológica y los costos relacionados con los anticuerpos. Además, hemos validado con éxito sus capacidades de alto rendimiento en placas de 96 pocillos, lo que hace factible la realización de cribados químicos extensos. Es probable que el enfoque de la química de clic también se pueda adaptar para su uso con otras acetiltransferasas. Por ejemplo, las acetiltransferasas recombinantes podrían incubarse con otros péptidos de histonas que imitan sus sustratos naturales en combinación con 4-pentinoil-CoA para inducir la acilación del péptido. A continuación, se podrían adaptar rápidamente los pasos de ensayo posteriores para la unión de péptidos, la funcionalización y la oxidación del rojo amplex. Se debe tener cuidado de diseñar controles positivos y negativos apropiados para las curvas estándar para permitir la cuantificación del ensayo.
Deben tenerse en cuenta ciertas limitaciones del ensayo. En primer lugar, aunque este protocolo se ha optimizado para HAT1, no todas las acetiltransferasas pueden aceptar el pentinoil-CoA como mimético de la acetil-CoA. Por lo tanto, el desarrollo de moléculas donantes de acilo adicionales podría considerarse26, o podría ser necesaria la mutagénesis de la bolsa catalítica para permitir la aceptación de cofactores compatibles con clic27,28. En segundo lugar, dado que la afinidad por los cofactores habilitados para el clic puede diferir del cofactor natural, se recomienda utilizar ensayos de seguimiento secundarios para confirmar los resultados, por ejemplo, la detección basada en anticuerpos (véase el paso 3.12). Finalmente, se deben realizar ensayos enzimáticos, biofísicos y celulares confirmatorios adicionales para confirmar los resultados. La unión de moléculas pequeñas a complejos proteicos puede ser confirmada por instrumentos que miden la resonancia del plasmón de superficie, por ejemplo29.
Hay algunos pasos críticos que se deben destacar para garantizar que el ensayo se ejecute sin problemas y que los resultados correspondientes sean precisos. El crecimiento exponencial de las células 293f debe ser evidente antes y después de la transfección del ADN para lograr una buena expresión de proteínas. Se deben emplear plásmidos que producen una alta expresión de proteínas en sistemas de transfección transitorios, por ejemplo, el plásmido pHEK-293 utilizado aquí. La enzima HAT1 es activada por la forskolina en este protocolo, pero se han logrado resultados similares con ortovanadato, lo que sugiere que las modificaciones postraduccionales son necesarias para la actividad de HAT1. Hemos observado que las preparaciones enzimáticas purificadas de HAT1/Rbap46 son relativamente estables y pueden sobrevivir a los ciclos de congelación/descongelación sin pérdida de actividad enzimática. Sin embargo, recomendamos congelar las alícuotas enzimáticas en pequeñas cantidades. Por lo general, no usamos enzimas después de más de un ciclo de congelación/descongelación.
Durante el ensayo de acetil-clic, es importante incluir siempre las reacciones de control por triplicado: las reacciones tratadas con DMSO sirven como controles negativos, y las reacciones tratadas con H4K12CoA sirven como controles positivos para la inhibición enzimática, respectivamente. Los valores de fluorescencia de la reacción enzimática tratada con DMSO deben situarse en la curva estándar lineal entre un 25 y un 50 % de péptido Pra positivo para evitar la saturación de la señal. Esto puede requerir una valoración cuidadosa de la cantidad de la enzima HAT1/Rbap46 en las reacciones de control antes de las pruebas de drogas. Por ejemplo, la enzima HAT1/Rbap46 se puede diluir 1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:75 y 1:100 en EB, y luego se puede usar en reacciones de clic de acetilo para determinar la cantidad de enzima requerida para generar una señal entre el 25% y el 50% del péptido Pra. Hemos encontrado que 100 nM de enzima es típicamente suficiente, pero debe determinarse empíricamente para cada nueva preparación de enzima. El propósito de mezclar estreptavidina-HRP con estreptavidina es disminuir la señal de oxidación amplex. La dilución de estreptavidina se puede ajustar a la señal de salida según sea necesario. Si se genera una señal rápida, puede ser necesario leer la placa antes de los 30 minutos para evitar la saturación de la señal. Durante la optimización inicial del ensayo, sugerimos leer a los 5 minutos, 15 minutos y 30 minutos. Las lecturas en serie se pueden realizar sin influir en la señal. Si el ensayo está bien calibrado, las señales rojas de amplex generadas entre 5 min y 30 min deben escalar linealmente.

Entre las numerosas acetiltransferasas eucariotas, HAT1 fue la histona acetiltransferasa inicial que se aisló 1,2,3. Investigaciones posteriores han establecido firmemente su papel fundamental en la replicación de la cromatina, particularmente en la síntesis de nuevos nucleosomas durante la faseS 4. Nuestros esfuerzos de investigación condujeron al reconocimiento de que HAT1 está altamente estimulado por el tratamiento con factor de crecimiento epidérmico (EGF) en células mamarias5. Además, ha salido a la luz que HAT1 es necesaria para la rápida proliferación celular y la formación de tumores in vivo 6,7,8,9. Los datos indican que HAT1 es fundamental en la coordinación de los procesos anabólicos y epigenéticos para la división celular, impulsando el crecimiento tumoral.
HAT1 diacetila la cola aminoterminal de la histona H4 en las lisinas 5 y 12 en complejo con la proteína chaperona Rbap46, que se une a la histona y presenta el aminoterminal a HAT1. Los tetrámeros de histonas o disomas10, junto con HAT1/Rbap46 y otras chaperonas de histonas11, se importan al núcleo. A continuación, se liberan histonas para depositarlas en la horquilla de replicación u otros sitios para apoyar la activación o represión de genes. La función de la marca de diacetilación HAT1 en la histona H4 no se comprende completamente. Es probable que se elimine rápidamente en un lapso de 15 a 30 minutos por la acción de las histonas desacetilasas 12,13,14,15 después de que H4 se inserta en la cromatina. Por lo tanto, la marca de diacetilación HAT1 no se propaga en la cromatina y puede no cumplir un verdadero papel epigenético, aunque se ha postulado un papel en el reclutamiento de enzimas modificadoras de la cromatina a la cromatinanaciente 12. Además, HAT1 no acetilla directamente la cromatina; Su actividad se restringe a las histonas solubles.
El desarrollo de inhibidores de la acetiltransferasa de histonas de moléculas pequeñas se ha visto obstaculizado por ensayos inespecíficos y de bajo rendimiento, lo que a menudo resulta en la generación de compuestos biológicamente reactivos16,17. El ensayo de referencia para medir las actividades de la acetiltransferasa requiere el uso de 3-H-acetil-coA, lo que limita el rendimiento y requiere radiación. No obstante, recientemente, se han descrito y confirmado inhibidores de la acetiltransferasa de moléculas pequeñas específicos y muy potentes dirigidos a CBP/p30018 y KAT6A/B19,20 mediante el uso de 3-H-acetil-CoA. De cara al futuro, se están diseñando ensayos mejorados para lograr un mejor rendimiento y evitar riesgos de laboratorio.
Los avances recientes en el monitoreo de la acetilación21 han utilizado la química de clic para permitir el monitoreo de reacciones enzimáticas. Hay una variedad de precursores habilitados para clics a los que se puede acceder por rutas sintéticas simples o disponibles para su compra que se pueden incorporar en reacciones enzimáticas. Estas reacciones se llevan a cabo típicamente en sistemas recombinantes, aunque los ensayos basados en células también son factibles22. La ventaja de los cofactores y sustratos habilitados para clic es que el cribado puede medir directamente la actividad enzimática sin necesidad de sistemas de lectura acoplados que a menudo se ven perturbados por los compuestos de cribado y requieren pasos de manipulación adicionales. Esto permite tratamientos con inhibidores solo durante la etapa enzimática, mientras que todas las etapas posteriores de funcionalización y detección se llevan a cabo después de un lavado extenso para eliminar los compuestos, lo que limita la posibilidad de que se produzcan interferencias en el ensayo. Estas ventajas hacen que el diseño de los ensayos habilitados para clic sea preferible a los ensayos acoplados que comúnmente se basan en la detección de coenzima A libre.
Una consideración importante es la aceptación de los cofactores habilitados para hacer clic en el sitio activo de la enzima. Es posible que los cofactores habilitados para clics existentes no sean totalmente compatibles con el sitio activo optimizado para el cofactor nativo. La información estructural y el modelado se pueden utilizar para diseñar sustituciones de aminoácidos para ampliar el sitio activo e incorporar sustratos alterados23. Esto puede permitir un cribado con una cinética enzimática mejorada y niveles más bajos de sustrato y enzimas. El inconveniente de este enfoque es que las bolsas catalíticas alteradas pueden no identificar los inhibidores que interactúan fuertemente con la enzima nativa. En última instancia, se requiere una combinación de enfoques para identificar y validar posibles inhibidores enzimáticos.
Aquí, describimos un método desarrollado para purificar y ensayar la actividad de la enzima HAT1 utilizando el cofactor clic 4-pentinoil-CoA24. Este ensayo (Figura 1) utiliza la secuencia de la enzima nativa en complejo con su proteína asociada requerida Rbap46, que se ha demostrado que aumenta la actividad enzimática. La purificación de la enzima a partir de células humanas permite la activación enzimática en el celulo, lo que puede preservar modificaciones postraduccionales estimulantes importantes para la actividad enzimática completa. El diseño y la optimización de ensayos enzimáticos recombinantes para cribados químicos de alto rendimiento se han utilizado con éxito para identificar y caracterizar inhibidores de moléculas pequeñas HAT1.

<table><tbody><tr><td>4P CoA</td><td>Cayman Chemical</td><td>10547</td><td>Cofactor químico de clic</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Fisher Sci</td><td>A12222</td><td>Sustrato de fluorescencia</td></tr><tr><td>Biotina-PEG-Azida Alfa</td><td>Aesar</td><td>J64996MC</td><td>Química</td></tr><tr><td>de clic Sulfato de cobre</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 7758-98-7 Química de</td><td>clic</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 67-68-5</td><td>diluyente</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Acros Organics</td><td>03-12-3483</td><td>agente reductor</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>VWR</td><td>102987-310</td><td>Expresión de proteínas</td></tr><tr><td>Freestyle 293 Expression Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>12338018</td><td>Media</td></tr><tr><td>Freestyle 293-F</td><td>cells Thermo Fisher</td><td>R790-07</td><td>Expresión de proteínas</td></tr><tr><td>H4-péptido/1-23-GGK-biotina</td><td>Anaspec</td><td>AS65097</td><td>sustrato peptídico</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 7365-45-9</td><td>EB tampón</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno solución al 30%</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; Z00183-99-0</td><td>iniciador</td></tr><tr><td>M2 FLAG lodo de anticuerpos</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A2220</td><td>Purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Filtro Macrosep 10K (Pall Lab)</td><td>VWR</td><td>89131-980</td><td>Purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Placa de neutravidina</td><td>Thermo Sci</td><td>15127</td><td>BSA-pre-bloqueado</td></tr><tr><td>NP40 (IGEPAL)</td><td>MP Biomedical</td> 198596 <td>20x tampón</td><td>plásmido</td></tr><tr><td>pHEK-293</td><td>Takara Bio</td><td>3390</td><td>Expresión de proteínas</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato 10x</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; Z00082-33-6</td><td>tampón de lavado</td></tr><tr><td>Péptido de Pra</td><td>Genscript</td><td>Síntesis personalizada</td> Ascorbato de sodio <td>biotinilado</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 134-03-2</td><td>Química de clic</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 7647-14-5</td><td>Tampón EB</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio</td><td>Tampón</td><td>VWR International</td><td>7558-80-7</td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>EMD Millipore</td><td>189730</td><td>competidor</td></tr><tr><td>Estreptavidina-HRP</td><td>Señalización celular</td><td>3999S</td><td></td></tr><tr><td>enzima THPTA ligando</td><td>Fisher Sci</td><td>1010-500</td><td>Química de clic</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 77-86-1</td><td>Búfer 20x</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 9002-93-1</td><td>Búfer EB</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp; 9005-64-5</td><td>Tampón de lavado</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-13-6</td><td>Quencher</td></tr></tbody></table>

un ensayo químico de acetil-clic para medir la acetilación de la acetil 1 de la histona acetiltransferasa 1

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, también conocida como histona acetiltransferasa 1, desempeña un papel crucial en la síntesis de cromatina al estabilizar y acetilar el H4 naciente antes del ensamblaje de nucleosomas. Es necesario para el crecimiento tumoral en varios sistemas, lo que lo convierte en un objetivo potencial para el tratamiento del cáncer. Para facilitar la identificación de compuestos que pueden inhibir la actividad enzimática de HAT1, hemos ideado un ensayo de clic acetil para un cribado rápido. En este sencillo ensayo, empleamos HAT1/Rbap46 recombinante, que se purifica a partir de células humanas activadas. El método utiliza el análogo de acetil-CoA 4-pentinoil-CoA (4P) en un enfoque de química de clic. Esto implica la transferencia enzimática de un mango alquino a través de una reacción de acilación dependiente de HAT1 a un péptido N-terminal H4 biotinilado. A continuación, el péptido capturado se inmoviliza en placas de neutravidina, seguido de una funcionalización química con biotina-azida. Posteriormente, se emplea el reclutamiento de estreptavidina-peroxidasa para oxidar el rojo amplex, lo que da como resultado una salida fluorescente cuantitativa. Mediante la introducción de inhibidores químicos durante la reacción de acilación, podemos cuantificar la inhibición enzimática en función de una reducción de la señal de fluorescencia. Es importante destacar que esta reacción es escalable, lo que permite un cribado de alto rendimiento de posibles inhibidores de la actividad enzimática de HAT1.

Se deben incluir curvas estándar duplicadas (16 pocillos) en cada placa para garantizar el rendimiento adecuado del ensayo. Los datos de la curva estándar deben configurarse en forma de tabla, con un rango de 100% a 0% de acuerdo con la proporción de péptido que contiene Pra y péptido H4 nativo en solución (Tabla 1). La señal roja Amplex será la más alta en los pocillos peptídicos H4 nativos al 100 % y la más baja en los pocillos peptídicos H4 nativos al 0 % pra/100 % H4 nativos. Una vez que se ha detectado la fluorescencia y se han promediado los pocillos, el gráfico de patrones resultante debe ajustarse a una línea recta (Figura 2), aunque se puede observar saturación de la señal a concentraciones superiores al 50% de Pra. La mezcla inadecuada de Pra con péptidos de control H4 puede dar lugar a poca o ninguna señal roja amplex o cambios no lineales en la señal roja amplex entre 0-50% Pra. Los resultados adecuados de la señal y la curva indican que se ha producido la reacción química de clic y los datos se pueden analizar en consecuencia.
Es importante incluir siempre las reacciones de control por triplicado: las reacciones tratadas con DMSO sirven como controles negativos, y las reacciones tratadas con H4K12CoA sirven como controles positivos para la inhibición enzimática, respectivamente. Estos deben incluirse en cada placa para garantizar un rendimiento robusto del ensayo y permitir cálculos de inhibición porcentual. Los pocillos de control positivo que contienen 1 μM de H4K12CoA deben tener una señal roja amplex baja, que es similar a la de los pocillos peptídicos 0% Pra/100% H4. Los pocillos de control negativo que contienen DMSO deben tener una señal similar a la salida fluorescente de los pocillos con 50% de Pra/50% de péptido H4. Los pozos compuestos de prueba contendrán diferentes señales de amplex. Promedio de pocillos duplicados o triplicados para obtener un valor medio de la señal con error estándar.
Calcule la inhibición enzimática con la fórmula anterior, donde D es la salida fluorescente de DMSO, X es la salida experimental y BG es la salida del péptido H4 sin enzima o el pozo 0% en la curva estándar. La salida de fluorescencia de las reacciones del compuesto de ensayo será inferior a la de DMSO si el compuesto de ensayo inhibe la actividad enzimática y dará lugar a valores porcentuales de inhibición positivos. El efecto contrario se observará en las reacciones en las que no se ha producido ninguna inhibición enzimática. En la figura 3 se muestran datos de ejemplo de compuestos de ensayo analizados a dos concentraciones (1 μM y 10 μM). Las diluciones en serie de los compuestos también se pueden probar utilizando este ensayo, donde se puede encontrar el IC50 del compuesto con el ajuste de la curva no lineal de los datos (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig01.jpg"> Figura 1: Esquema químico de clic de acetilación/acilación HAT1. La reacción de clic de acetilación de HAT1 se produce con HAT1 purificado y la proteína Rbap46 en una solución con péptido H4 de histona biotinilada, 4-pentinoil-CoA y compuestos de prueba. Una vez completadas las reacciones, la solución se une a una placa recubierta de neutravidina y se completa la química de clic con sulfato de cobre y biotina-azida. La adición final de estreptavidina-HRP y rojo amplex da como resultado una salida fluorescente roja. La comparación de las intensidades de fluorescencia roja de amplex determina la actividad de acetilación de HAT1. Esta figura ha sido modificada con permiso de Gaddameedi et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplo de curva estándar. Después de promediar los valores de la curva estándar para cada par, grafique las medias ± SEM contra los porcentajes de péptidos Pra de control positivo. La curva resultante debe parecerse a la curva mostrada y ajustarse a una línea lineal. Este ensayo tiene un límite de detección (LOD) del 1,8% ± 0,89% y un límite de cuantificación (LOQ) del 5,4% ± del 3,1%24. La curva estándar puede saturarse para porcentajes de Pra &gt;50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig03.jpg"> Figura 3: Prueba de nuevos compuestos por triplicado. Se utilizó el ensayo de acetil-clic para evaluar la actividad inhibitoria de los compuestos recién sintetizados. Los compuestos se diluyeron a 10 μM y 1 μM para realizar pruebas por triplicado, con mediana indicada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66054/66054fig04.jpg"> Figura 4: Dilución en serie de compuestos de ensayo en el ensayo de clic de acetilo HAT1. Los compuestos se diluyeron de 100 μM a 0,01 μM y se probaron por duplicado. Las curvas de dosis resultantes muestran que los compuestos A y C inhiben la actividad de HAT1 en casi un 100% durante varias diluciones. A continuación, se utilizaron los datos para calcular el IC50 de los compuestos que se utilizarían en experimentos posteriores. Los datos son medios ± SEM de experimentos duplicados. Los valores de R2 para ajustes no lineales son 0,84, 0,78 y 0,94 para los compuestos A, B y C, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66054/66054fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>% de control positivo</td>
			<td>Péptido de control positivo [2,5 rxns] "pra" diluido a 0,1 mg/ml en DMSO (que contiene alquinos)</td>
			<td>Péptido H4 [2,5 rxns] diluido a 0,1 mg/ml en DMSO</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>75</td>
			<td>1.875 μL</td>
			<td>0,625 μL</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>1,25 μL</td>
			<td>1,25 μL</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>0,625 μL</td>
			<td>1.875 μL</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>1,25 μL (de 1:10)</td>
			<td>1,25 μL</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μL (de 1:10)</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>8,5 μL</td>
			<td>25,5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Dilución del péptido control Pra a péptido H4. Proporciones de péptido "Pra" de control positivo y péptido H4 que se utilizan para crear una curva estándar. Después de que el stock de Pra se resuspenda inicialmente a 4 mg/ml en DMSO, debe diluirse 1:40 en DMSO hasta una concentración final de 0,1 mg/ml. El péptido H4 biotinilado también debe diluirse a 0,1 mg/ml (34,8 μM) en DMSO. Luego, cada péptido debe mezclarse en las proporciones mostradas. Cada patrón se agregará por duplicado a la placa de 96 pocillos. Los valores de salida de fluorescencia deben promediarse juntos para crear la curva estándar.

Los ensayos químicos rápidos y precisos para detectar inhibidores específicos son una herramienta importante en el arsenal de desarrollo de fármacos. Aquí, presentamos un ensayo químico escalable de acetil-clic para medir la inhibición de la actividad de acetilación de HAT1.

Un ensayo químico de acetil-clic para medir la acetilación de la acetil 1 de la histona acetiltransferasa 1

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Nuestro ensayo de clic de acetil desarrollado sirve como herramienta para evaluar la actividad de la acetiltransferasa HAT1, que es clave para aislar las histonas H4 antes de la incorporación de nucleosomas. Nuestro objetivo es utilizar este método para el cribado de alto rendimiento de inhibidores de moléculas pequeñas contra la enzima HAT1. Este método mide la actividad enzimática directamente sobre el sustrato peptídico.Esto ofrece ventajas en comparación con otros ensayos enzimáticos, ya que evita la variabilidad biológica y los costes relacionados con los anticuerpos. Esto también es de alto rendimiento y se puede adaptar para su uso con otras acetiltransferasas. Recientemente hemos publicado un inhibidor de HAT1 de molécula pequeña basado en este ensayo que tiene actividad en células y animales.Continuamos usando este ensayo para examinar bibliotecas químicas adicionales y realizar relaciones de actividad estructural. Estamos avanzando en métodos para rastrear la producción de histonas, el plegamiento, el acompañamiento y la integración de la cromatina. Esto pone de relieve la necesidad de mejorar las herramientas químicas para explorar los mecanismos biológicos y estimular el descubrimiento de fármacos.Nuestro objetivo es demostrar que dirigirse a la producción de histonas puede tener un beneficio terapéutico para enfermedades como el cáncer.

an-acetyl-click-chemistry-assay-to-measure-histone-acetyltransferase

Research

Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Este protocolo describe los pasos necesarios para ejecutar ensayos de desacetilación in vitro e in vivo con el fin de establecer el papel de las proteínas como sustratos de desacetilación específicos para las sirtuinas y estudiar más a fondo el papel de la acetilación reversible de lisina como modificación postraduccional.

Ensayos de desacetilación para desentrañar la interacción entre las sirtuinas (SIRT2) y proteína-sustratos específicos

El presente método sirve para identificar inhibidores de la isoforma específica de histona deacetilasas (HDAC) en células HeLa por el análisis UHPLC-MS de múltiples sustratos. Este es un método libre de anticuerpos desarrollado para reflejar actividad HDAC1 y HDAC6 en la vida del ambiente celular, en contraste con solo isoform análisis sin células.

Medición simultánea de HDAC1 y HDAC6 actividad en HeLa células usando UHPLC-MS

El propósito de este artículo es proporcionar a una guía completa y sistemática a la purificación eficiente de las histonas H3 y H4 y la cuantificación de residuos de histona acetilado.

Purificación de proteínas de histona H4, H3 y la cuantificación de las marcas acetilado histonas en las células y el tejido cerebral

Las histona de clase 1 (HDACs) como la RpdA han cobrado importancia como posibles objetivos para tratar las infecciones fúngicas. Aquí presentamos un protocolo para el enriquecimiento específico de RpdA con etiqueta TAP combinado con un ensayo de actividad HDAC que permite la prueba in vitro de la eficacia de los inhibidores de la histona deacetilasa.

Enriquecimiento en un solo paso de una histona deacetilasa con etiqueta TAP del hongo filamentoso Aspergillus nidulans para la prueba de actividad enzimática

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Los inhibidores de las acetiltransferasas de histona (HATs, también conocidos como acetiltransferasas de lisina), como CBP/p300, son terapias potenciales para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, se necesitan métodos rigurosos para validar estos inhibidores. Tres métodos in vitro para la validación incluyen ensayos HAT con acetiltransferasas recombinantes, inmunoblotting para la acetilación de histona en el cultivo celular, y ChIP-qPCR.

Ensayos para validar los inhibidores de la acetiltransferasa histona

El estudio de la acilación grasa tiene importantes implicaciones en las interacciones y enfermedades de las proteínas celulares. Aquí se presenta un protocolo modificado para mejorar la detección química de clics de proteínas aciladas grasas, que se puede aplicar en varios tipos de células y combinarse con otros ensayos, incluida la persecución de pulsos y la espectrometría de masas.

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Aquí presentamos un método para expresar proteínas de histonas acetiladas utilizando la expansión del código genético y ensamblar nucleosomas reconstituidos in vitro.

Sitio Específico De La Acetilación De Lisina De Histonas Para La Reconstitución De Nucleosomas Utilizando La Expansión Del Código Genético En Escherichia coli

Aquí presentamos un protocolo para automatizar el análisis de modificación posttraduccional de histonas unicelulares utilizando una estrategia de marcaje isotópico de dos plexos y la digestión con ArgC. Este flujo de trabajo permite un perfil cuantitativo, reproducible y de alta sensibilidad de la heterogeneidad de la cromatina y las respuestas epigenéticas a resolución de célula única.

Preparación automatizada de muestras para el análisis multiplexado de modificaciones posttraduccionales de histonas unicelulares (sc-hPTM2)

Aprende a utilizar el ensayo químico de acetil-clic para medir la actividad de HAT1 en sustratos peptídicos. Este método escalable permite el cribado de alta capacidad de inhibidores de moléculas pequeñas con aplicaciones en descubrimiento de fármacos.

Un ensayo químico de acetil-clic para medir la acetilación de la acetil 1 de la histona acetiltransferasa 1

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