Generación de una línea celular RIP1 knockout U937 utilizando el sistema CRISPR-Cas9

Nuestra investigación se centra en la muerte celular del programa de mamíferos, estudiando específicamente el equilibrio entre apoptosis y necroptosis en el contexto de la hiperglucemia. Más recientemente, se ha demostrado que la proteína de muerte celular RIP1 quinasa modula la expresión génica durante la necroptosis. Nuestro desafío experimental actual es manipular genéticamente las células inmunes que crecen en suspensión, particularmente eliminando el gen de la quinasa RIP1 usando CRISPR-Cas9.

Nuestro protocolo ofrece dos ventajas distintas. Mejora los métodos de transfección para las células inmunitarias que crecen en suspensión mediante el uso de lentivirus, y elimina la necesidad de clonación de una sola célula durante el proceso de creación de un knockout genético utilizando CRISPR-Cas9. Nuestros resultados allanaron el camino para estudiar el papel de la quinasa RIP1 en el cambio hiperglucémico en la necroptosis. Para comenzar la raya del cuadrante, Escherichia coli alberga el ARN guía del vector lentiviral en placas de agar Luria-Bertani o LB complementadas con 100 microgramos por mililitro de ampicilina.

Incube las placas a 37 grados Celsius durante uno o dos días hasta que las colonias individuales sean visibles en el área más diluida de la placa. Después de la incubación, utilizando un asa estéril, seleccione una sola colonia y agréguela a cinco mililitros de caldo LB, suplementado con 100 microgramos por mililitro de ampicilina en un tubo cónico de 50 mililitros. Ventile y pegue con cinta adhesiva la tapa del tubo.

Incube el tubo en un agitador orbital a 37 grados Celsius y 225 RPM durante ocho horas. Mientras tanto, agregue 40 mililitros de caldo LB, complementado con 100 microgramos por mililitro de ampicilina en cuatro tubos de 50 mililitros. Después de la incubación, transfiera 40 microlitros del cultivo cultivado a cada uno de los cuatro tubos.

Ventile y pegue con cinta adhesiva las tapas de los tubos antes de incubarlos en un agitador orbital a 37 grados Celsius y 225 RPM durante 12 a 16 horas. Al día siguiente, centrifugar los cultivos a 3, 220 x g en un rotor de cubo oscilante durante 20 minutos. Decantar los sobrenadantes en un vaso de precipitados de desecho y combinar los cuatro gránulos en 10 mililitros de caldo LB, complementado con ampicilina.

Centrifugar los pellets combinados a máxima velocidad en un rotor de cubeta oscilante durante 20 minutos para obtener un solo pellet y desechar la mayor cantidad posible de sobrenadantes en el vaso de precipitados de desechos. Siembra HEK293T células a una concentración de tres a cinco veces 10 a la potencia de seis células en un matraz T25 que contiene DMEM. Incube el matraz durante la noche a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%.

Mientras tanto, prepare la mezcla de transfección utilizando una proporción de plásmidos de 1:1:1:1 y una proporción de 3:1 de reactivo de transfección a ADN plasmídico con medio sérico reducido. Mezcle 75 microlitros de reactivo de transfección, 2.500 microlitros de medio sérico reducido y 25 microgramos de ADN plasmídico total. Deje que la mezcla se incube a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos.

A continuación, pipetee con cuidado la mezcla de transfección en las células HEK293T confluentes en el matraz que contiene el medio. Agite suavemente el matraz para asegurar una homogeneización adecuada de la mezcla y incube a 37 grados centígrados durante 48 horas. Después de dos días de incubación, transfiera el medio del matraz de células HEK293T productor a un tubo cónico de 15 mililitros.

Centrifugar el tubo a 800 x g durante cinco minutos para granular las celdas de HEK293T restantes. Retire con cuidado todo el virus que contiene sobrenadante sin alterar el gránulo y transfiéralo a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Cuente y calcule el volumen requerido de la suspensión celular U937 para obtener un pellet de 2 x 10 a la potencia de seis celdas.

A continuación, centrifugar la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros a 400 x g durante 10 minutos y decantar el sobrenadante, dejando el sedimento celular en el tubo. Vuelva a suspender el sedimento celular en el virus que contiene sobrenadante y centrifugar el tubo a 290 x g durante 60 minutos. Después de la centrifugación, use una pipeta para volver a suspender el sedimento con el sobrenadante que contiene el virus en el tubo.

Coloque el tubo en un rotador de extremo a extremo durante 60 minutos. A continuación, centrifugar el tubo a 400 x g durante 10 minutos y volver a suspender el pellet en una proporción de 1:1 del virus que contenga sobrenadantes y medios RPMI 1640 completos, suplementados con FBS inactivado por calor al 10%. Transfiera la mezcla celular a un nuevo matraz de cultivo de tejidos T25 y incube a 37 grados centígrados durante 48 horas.

Después de la incubación, centrifugar las células U937 a 400 x g durante 10 minutos y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo con medios RPMI 1640 completos, complementados con FBS inactivado por calor al 10% y cinco microgramos por mililitro de puromicina. Transfiera el cultivo celular a un matraz T25.

Incube las células a 37 grados centígrados durante dos o tres semanas, revisando las células cada uno o dos días en busca de signos de crecimiento. El análisis de Western blot confirmó la pérdida de expresión de la proteína RIP1 en las células mutantes RIP1 CRISPR sin señal detectable en comparación con la señal fuerte en las células de control de tipo salvaje y no objetivo. El tratamiento con TCZ indujo una muerte celular necroptótica significativa en células de control de tipo salvaje y no objetivo, que se revirtió con el tratamiento con necrostatina-1.

Por el contrario, las células knockout RIP1 CRISPR mostraron una muerte celular significativamente menor en comparación con las células de control de tipo salvaje y no objetivo sin efecto de la necrostatina-1, lo que indica una pérdida de la función RIP1. La microscopía de fluorescencia de células vivas mostró un aumento significativo en la producción de superóxido mitocondrial en células de control de tipo salvaje y no objetivo después del tratamiento con TCZ, que se redujo con el tratamiento con necrostatina-1s. Las células knockout RIP1 CRISPR exhibieron una producción mínima de superóxido mitocondrial sin efecto observable del tratamiento con necrostatina-1.