Name: Uso de tintes de bajo costo para visualizar la acumulación de glucógeno y la integridad intestinal en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a evaluar glucógeno y permeabilidad intestinal en Caenorhabditis elegans usando colorantes de bajo costo. Este protocolo educativo permite estudiar metabolismo y envejecimiento con recursos limitados.

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NOTA: La bacteria Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) y las cepas de tipo salvaje Bristol N2 pueden obtenerse del CGC de la Universidad de Minnesota, EE.UU. o de una donación de un laboratorio de C. elegans . Para la seguridad de los investigadores, es imperativo el uso de equipos de protección personal. Aunque las concentraciones de reactivos como el hipoclorito y el hidróxido de sodio son bajas, es esencial usar el EPP recomendado, como se destaca en el manuscrito, para minimizar cualquier riesgo potencial asociado con estos productos químicos.
1. Contenido de glucógeno
<ol><li>Preparación de placas de prueba<ol><li>Prepare seis placas de agar NGMde 60 mm x 15 mm 20 (10 mL de agar de medios de crecimiento de nematodos, NGM, como se describe en la Tabla Suplementaria 1) por cepa de gusano y déjelas secar durante 1 día a temperatura ambiente. Mantenga las placas cerradas para evitar la contaminación.</li>
		<li>Añadir 200 μL de cultivo líquido de E. coli OP50 (con una densidad óptica = 0,600, aproximadamente a una longitud de onda de 600 nm) por placa para inocular un total de cuatro placas NGM de 60 mm x 15 mm por cepa en la campana de flujo. Deje que las placas cerradas se incuben a 37 °C durante 1 día antes de usarlas. NOTA: Prepare seis placas (paso 1.1) pero inocule solo 4 con la bacteria E. coli OP50. Reserve las dos placas restantes a 4 °C para su uso posterior cuando coloque los gusanos en condiciones de inanición. Este análisis puede realizarse por duplicado.</li>
		<li>El día de la prueba, agregue 200 μL de D-glucosa 0.025 M a dos placas de agar NGM (6 mm x 15 mm) por cepa que se sembraron previamente con la bacteria E. coli OP50. Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente en la campana de flujo. NOTA: Las placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 también se pueden secar cerca de lámparas de alcohol como alternativa al uso de una campana de flujo.</li>
	</ol></li>
	<li>Sincronización<ol><li>Aproximadamente 3 días antes de la sincronización, transfiera 3-4 trozos (3 cm x 3 cm) de un agar NGM de mantenimiento con C. elegans Bristol N2 (tipo silvestre) en diferentes etapas (alrededor de 500 gusanos por trozo) a una nueva placa (150 mm x 90 mm) que haya sido previamente sembrada con la bacteria E. coli OP50.</li>
		<li>Coloque la nueva placa con lombrices en un ambiente controlado a 20 °C y mantenga la humedad &gt;95% durante 3 días (72 h permiten que la mayoría de las lombrices alcancen la etapa adulta grávida). NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la temperatura de crecimiento dependiendo de la(s) cepa(s) de C. elegans que se utilice.</li>
		<li>Con una pipeta Pasteur, recoja los gusanos de la placa preparada con H2O destilado y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Espere la sedimentación de los gusanos por gravedad (aproximadamente 15 min) y luego retire el sobrenadante. Repite este proceso 3 veces para eliminar las bacterias. Después del último lavado, reduzca el volumen a 5 mL.</li>
		<li>Agregue 10 mL de solución blanqueadora (Tabla suplementaria 1) y agite vigorosamente con las manos durante aproximadamente 6 min.</li>
		<li>Inmediatamente después de completar la agitación, llene los tubos hasta una capacidad de 50 ml con tampón M9.</li>
		<li>Centrifugar a 1400 x g durante 3 min, retirar el sobrenadante hasta 5 mL y volver a añadir 45 mL de tampón M9. Repite este proceso 4 veces.</li>
		<li>Después del último lavado, reduzca el volumen a 15 mL y manténgalo a temperatura (20 °C) y humedad (&gt;95%) controladas durante aproximadamente 14 h. NOTA: El proceso de sincronización puede ser reemplazado por la obtención de óvulos por oviposición: Transfiera aproximadamente 20 gusanos adultos preñados a una placa NGM (6 mm x 15 mm) previamente sembrada con 200 μL de E. coli OP50. Deje que los gusanos pongan huevos durante 1 día. Después de eso, retire los gusanos preñados y espere a que los huevos eclosionen.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de lombrices<ol><li>Con una pipeta automática, añada 10 μL de los gusanos sincronizados (paso 1.2.8) a un portaobjetos de microscopio y cuente el número de gusanos. Calcular cuánto volumen se debe pipetear para obtener 500-1000 gusanos/μL.</li>
		<li>Transfiera 500-1000 gusanos sincronizados L1 (paso 1.2.8) a placas de agar NGM (150 mm x 90 mm, Tabla Suplementaria 1) sembradas con la bacteria E. coli OP50 como fuente de alimento, hasta que alcancen la etapa larvaria 4 (L4) a 20 °C. NOTA: Los gusanos se pueden transferir mediante una pipeta automática. Si no dispone de una pipeta automática, utilice una pipeta Pasteur de vidrio y los volúmenes se pueden controlar mediante etiquetas de microtubos o pipetas graduadas de vidrio.</li>
		<li>Después de 48 h de sincronización20: recoja las larvas L4 de las placas con tampón M9 (Tabla suplementaria 1), con la ayuda de una pipeta Pasteur de plástico en un tubo cónico limpio de 50 mL y lávelas 3 veces con tampón M9 fresco o repita los lavados hasta que todas las bacterias E. coli OP50 restantes se eliminen por completo (a temperatura ambiente). NOTA: El paso de lavado es importante porque algunos gusanos experimentarán inanición durante el procedimiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Ejecución del ensayo<ol><li>Transfiera 500-1000 gusanos L4 (paso 1.3.1) de cada una de las nuevas placas de agar NGM (60 mm x 15 mm) previamente preparadas (pasos 1.1.2 y 1.1.3). Manténgalos a 20 °C durante 48 h hasta el día de la prueba. Este cronograma dará como resultado tres grupos experimentales de la siguiente manera, por duplicado (Figura 1): A- (inanición): los gusanos crecerán en placas de agar NGM regulares sin la bacteria E. coli OP50; B- (regular): los gusanos crecerán en placas de agar NGM regulares sembradas con la bacteria E. coli OP50; C- (glucosa alta): los gusanos crecerán en placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 y que contienen 0,025 M de D-glucosa.</li>
		<li>El día de la prueba (después de 48 h): recoger los gusanos y darles tres lavados breves en el tampón M9 (pasos 1.2.2 y 1.2.3) NOTA: Aquí, prepare placas de agar NGM con la adición de D-glucosa (paso 1.3) y déjelas a un lado hasta que sea el momento de agregar los gusanos.<ol><li>Tinción de yodo: prepare una solución de yodo Lugol al 5% (v/v) (solución de yodo/yoduro de potasio) utilizando tampón M9 fresco. NOTA: La solución de yodo de Lugol se puede obtener de proveedores de reactivos o farmacias locales, por lo tanto, la concentración inicial puede variar. Si es necesario, calcule para obtener una solución al 5% (v/v).</li>
		</ol></li>
		<li>Transfiera aproximadamente 100 μL de gusanos lavados (paso 4.2) de cada grupo al microtubo de 1,5 mL que contiene solución diluida de Lugol (5% v/v). Con una pipeta automática en una proporción 1:5, transfiera 100 μL de gusanos a 400 μL de solución de Lugol, seguido de una agitación suave en un mezclador durante 5 min. NOTA: Si no se dispone de un mezclador, es posible agitar los microtubos con las manos cuidadosamente.</li>
		<li>Inmediatamente después de estos 5 minutos, centrifugar el microtubo de 1,5 mL (lombrices + solución de Lugol) a 1400 x g durante 3 minutos. NOTA: Si este ensayo se realiza en gusanos de la etapa L4 o superior, es posible lograr la sedimentación por gravedad en lugar de usar una centrífuga. Deje los microtubos abiertos en rejillas en la mesa de trabajo durante 10 minutos hasta que todos los gusanos se hayan asentado en el fondo del microtubo.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y lave las lombrices con 1,0 mL de tampón M9 fresco. Repita el lavado hasta que se elimine todo el yodo restante de la solución (mínimo 3 veces).</li>
		<li>Después del último paso de lavado, retire el sobrenadante, excepto un residuo de aproximadamente 100 μL. Utilícelo para volver a suspender suavemente los gusanos y para el análisis microscópico.</li>
		<li>Transfiera aproximadamente 50 μL de la solución de gusano resuspendida a portaobjetos de microscopía y cúbralos con cubreobjetos. Observe las imágenes de campo claro utilizando un microscopio estereoscópico (a 1,5x). NOTA: Si no se dispone de un microscopio estereoscópico, se puede utilizar un microscopio normal y las imágenes se pueden capturar con la cámara de un teléfono móvil (a 3,4x) utilizando un adaptador. Para evitar errores de luz/brillo/exposición, es crucial que todos los ajustes de la cámara del teléfono móvil sean coherentes para todas las fotografías.</li>
	</ol></li>
	<li>Inspección de datos<ol><li>Datos cuantitativos: Calcular el contenido de glucógeno en función de la tinción con yodo de los gusanos.<ol><li>Guarde las imágenes del microscopio estereoscópico que contengan un mínimo de 10 gusanos por grupo como un archivo de .jpeg para su posterior procesamiento. Descargue el software gratuito ImageJ para hacer esto. Los detalles se proporcionan en el Archivo Suplementario 1, Figura Suplementaria 1, Figura Suplementaria 2.</li>
			<li>Abra la imagen .jpeg con el software ImageJ (que se puede descargar de forma gratuita en https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Haga clic en Línea segmentada y delinee el gusano (un gusano a la vez). Haga clic en Analizar y, a continuación, seleccione Medir para obtener la cuantificación de la mancha. Los datos se mostrarán como la media en la tabla. La media indica los datos calculados a partir de la densidad de tinción por área de gusano.</li>
		</ol></li>
		<li>Datos cualitativos: Obtener imágenes del microscopio estereoscópico de cada grupo y comparar visualmente la tinción de los gusanos. Cree un sistema de puntuación, si es necesario, para analizar la mancha: 0 incoloro; 1 ligeramente manchado; 2 manchados y 3 muy manchados. Usando el microscopio estereoscópico, cuente manualmente aproximadamente 10 gusanos por grupo (mínimo) con un contador manual.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del ensayo de contenido general de glucógeno en C. elegans. Un esquema del experimento realizado aquí para llevar a cabo el ensayo de contenido de glucógeno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Evaluación de la permeabilidad intestinal
<ol><li>Preparación de lombrices<ol><li>Aproximadamente 14 h después de la sincronización (paso 1.2.8), transferir 500-1000 gusanos (paso 1.3.1 y NOTA) en la primera etapa larvaria (L1) a cada nueva placa de agar NGM (60 mm x 15 mm) previamente preparada y mantenerlas a 20 °C hasta el día de la prueba. Este cronograma dará lugar a dos grupos experimentales de la siguiente manera (Figura 2): A- (jóvenes): los gusanos crecerán en placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 hasta la etapa larvaria 4 (L4); B- (viejo): los gusanos crecerán en placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 hasta el7º día de la edad adulta. NOTA: Los gusanos mantenidos hasta el7º día de edad adulta deben lavarse con tampón M9 todos los días y transferirse a nuevas placas de agar NGM (60 mm x 15 mm) con 200 μL de bacteria E. coli OP50 previamente sembradas para reemplazo de alimentos y eliminación de la progenie. Los gusanos más jóvenes flotan durante la decantación y se pueden separar eliminando el sobrenadante. La proporción de gusanos pitufos aumenta con la edad. Sin embargo, la evaluación de la permeabilidad intestinal se puede realizar en cualquier etapa y edad, dependiendo del propósito del estudio.</li>
	</ol></li>
	<li>Ejecución del ensayo<ol><li>El día de la prueba, recoja los gusanos L4 (2 días después del paso 2.1.1) y los gusanos adultos al7º día (ahora en su9º día) con tampón M9 (Tabla suplementaria 1) y transfiéralos a microtubos marcados de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 1400 x g durante 3 min, retirar el sobrenadante, añadir 1,0 mL de M9 y mezclar suavemente. Repite este proceso 3 veces para eliminar las bacterias. Después del último lavado, reduzca el volumen a 500 μL.</li>
		<li>Con una pipeta automática, añada 10 μL del sedimento de lombriz a un portaobjetos de microscopio y cuente el número de lombrices. Calcular el volumen a pipetear para obtener 100 gusanos/μL.</li>
		<li>Tinción de pitufos: prepare una solución de sal disódica de erioglaucina al 25% (Tabla suplementaria 1) con agua destilada. Si es necesario, utilice el vórtice para una mejor solubilización.</li>
		<li>En los nuevos microtubos previamente identificados, utilizando una pipeta automática, añadir el volumen que contiene 100 gusanos, 100 μL de solución salina disódica de Erioglaucina al 25%, 200 μL de E. coli OP50 y completar con tampón M9 para un volumen final de 500 μL. NOTA: Los volúmenes de Erioglaucina disódica, E. coli y número de gusanos son fijos. El volumen del tampón M9 es variable y se puede utilizar para llevar el volumen final a 500 μL.</li>
		<li>Incubar durante 3 h con agitación en una batidora, protegida de la luz, a temperatura ambiente. NOTA: Si no dispone de una batidora, agite cuidadosamente los microtubos con las manos cada 15 minutos.</li>
		<li>Después de 3 h, centrifugar el microtubo de 1,5 mL a 1400 x g durante 3 min. Retire 1,0 mL de sobrenadante y lave las lombrices con 1,0 mL de tampón M9.</li>
		<li>Repita los lavados hasta que la solución de sal disódica de erioglaucina restante se elimine de la solución. Después del último paso de lavado, retire el sobrenadante, excepto un residuo de aproximadamente 250 μL. Utilícelo para resuspender cuidadosamente los gusanos y procesarlos para el análisis microscópico.</li>
		<li>Transfiera aproximadamente 50 lombrices de solución de lombriz resuspendida a portaobjetos de microscopía y cúbralos con cubreobjetos. Incubar los portaobjetos de microscopía en el refrigerador a -20 °C durante 10 min para paralizar las lombrices. NOTA: Otra alternativa para paralizar los gusanos es añadir 10 μL de solución de clorhidrato de Levamisol (10 mM ; Tabla complementaria 1) y cúbralos con cubreobjetos.</li>
		<li>Observe y cuente el número total de gusanos y los gusanos totalmente teñidos utilizando el campo claro en un microscopio estereoscópico (a 1,5x). Las imágenes se pueden obtener de la cámara de un teléfono celular (a 3.4x) acoplada a un adaptador. Para evitar errores de luz/brillo/exposición, es crucial que todos los ajustes de la cámara del teléfono móvil sean coherentes para todas las fotografías.</li>
	</ol></li>
	<li>Inspección de datos<ol><li>Datos cualitativos: Obtener imágenes del microscopio estereoscópico de cada grupo (L4 y7º día de edad adulta) y comparar visualmente la tinción de los gusanos.</li>
		<li>Cuente el número total de gusanos y el número de gusanos pitufos (gusanos azules) utilizando un microscopio estereoscópico.</li>
		<li>Expresa los resultados como el porcentaje de gusanos pitufos comparando los gusanos jóvenes (L4, como grupo de control) y los gusanos viejos (7º día de edad adulta): A x X = 100 (%) x B X = 100 x B / A Donde, A = número total de gusanos B= número de gusanos pitufos</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig02.jpg"> Figura 2: Esquema del ensayo de permeabilidad intestinal general en C. elegans. (A) Preparación de C. elegans. (B) Tinción con sal disódica de erioglaucina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación del metabolismo y el patrón de envejecimiento en Caenorhabditis elegans

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<li>Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+links+metabolic+and+inflammatory+markers+of+aging+to+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).</li>
<li>Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+bilberry+anthocyanin+extracts+on+dextran+sulfate+sodium-induced+intestinal+damage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 14 (14), 2875(2022).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+acs-22+mutant+Caenorhabditis+elegans+to+detect+the+toxicity+of+nanopolystyrene+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles.</a> Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microtubos de 1,5 mL&nbsp;</td><td>Proveedores</td> <td>locales-incubadora</td><td></td></tr> <tr><td>de 37 grados</td><td>KS 4000i&nbsp;</td><td>97014-816</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 mL</td><td>Proveedores</td> <td>locales-Placas de</td><td></td></tr> <tr><td>Petri de 6 cm&nbsp;</td><td>Proveedores</td> <td>locales-Agar</td><td></td></tr> <tr><td>bacteriológico</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Bristol N2 (tipo salvaje)</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, EE. UU.)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa anhidra&nbsp;</td><td>Neon</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>H2O destilado Proveedores</td><td></td> <td>locales-Sal</td><td></td></tr> <tr><td>disódica de erioglaucina</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo</td><td>Mylabor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Panasonic Healthcare, empresa de Norteamérica, MIR-254-PA.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de levamisol</td><td>RIPERCOL L 150F-Lugol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>solución Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>L6146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Synth</td><td>S1063-01-AH</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Centrífuga 5425R Eppendorf SE, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea Ltda.</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>N6261</td><td></td></tr><tr><td>Peptona bacteriológica</td><td>&ecirc; xodo cient&iacute; fica</td><td>91079-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica S8 Apo (S&atilde; o Paulo, Brasil)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina Sulfato</td><td>Estreptomax</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de tintes de bajo costo para visualizar la acumulación de glucógeno y la integridad intestinal en caenorhabditis elegans

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

El ensayo de contenido de glucógeno proporciona un método sólido y rápido para detectar diversas condiciones de prueba, como estudios comparativos de diferentes cepas que pueden influir en la síntesis o degradación de glucógeno. En este estudio, los gusanos L4 se sometieron a tres condiciones de prueba distintas: grupos en ayunas, alimentación y enriquecidos con glucosa. El ensayo se realizó tres veces, y cada condición se replicó dos veces en cada ensayo; en la Figura 3 se muestra una imagen representativa. Después de cada ensayo, se observaron gusanos teñidos con la solución de yodo de Lugol utilizando un microscopio estereoscópico, y se realizó una comparación cualitativa entre los grupos con respecto a la tinción de los gusanos. En cuanto a la observación visual, los gusanos del grupo de ayuno (inanición) mostraron una mancha menos intensa en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50 (regular), así como los alimentados con E. coli OP50 y D-glucosa (glucosa alta). Además, los gusanos alimentados con E. coli OP50 y D-glucosa (glucosa alta) mostraron la tinción más intensa.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes representativas del ensayo de contenido de glucógeno. Los niveles de glucógeno en C. elegans se evaluaron mediante tinción con yodo. Las imágenes microscópicas muestran gusanos representativos de C. elegans sometidos a (A) inanición, (B) condiciones regulares o (C) de glucosa alta durante 48 h. Los gusanos se tiñeron sumergiéndolos en una solución de yodo/tampón M9 de Lugol (1%) durante 5 min, siguiendo el procedimiento detallado en el paso 1.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los resultados de permeabilidad intestinal muestran la diferencia en la tinción de gusanos jóvenes (L4) con intestino intacto y gusanos viejos (7º día de edad adulta) con membranas intestinales dañadas por el envejecimiento (Figura 4). El intestino de C. elegans es un tejido de importancia central para la salud, ya que desempeña un papel fundamental en la digestión y el metabolismo y sirve como centro de señalización para la respuesta al estrésy la regulación del envejecimiento. En los gusanos jóvenes, el intestino de C. elegans está constituido por una fuerte barrera que evita la fuga de contenido intestinal. Sin embargo, a medida que estos gusanos envejecen, la función de barrera intestinal disminuye y se vuelve más sensible a la alteración debido a la degradación progresiva de las células y las microvellosidades y la acumulación de bacterias en el intestino envejecido21,22. Cuando los C. elegans jóvenes ingieren el colorante sal disódica de erioglaucina, el intestino del nematodo se tiñe (Figura 4A). Por otro lado, es posible observar que los gusanos envejecidos presentaron una extravasación del tinte, permeando todo el cuerpo del gusano, lo que indica daño a la membrana intestinal (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig04.jpg"> Figura 4: Imagen representativa de C. elegans teñida con sal disódica de erioglaucina. La imagen microscópica muestra C. elegans con intestino intacto (estadio L4) y gusanos con intestino roto (7º día de edad adulta). Los gusanos se tiñeron por inmersión en una solución salina disódica de erioglaucina al 25% durante 3 h, siguiendo el paso 2.2.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Captura de pantalla de ImageJ para seleccionar el contorno de C. elegans . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%201_RE.png" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Captura de pantalla de ImageJ para calcular la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%202_RE.png" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 1: Recetas de medios, tampones y cultivos. Composición de los diferentes medios, tampones y cultivos utilizados en el protocolo actual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Legajo Complementario 1: Descripción detallada del software ImageJ para cuantificar el contenido de glucógeno en gusanos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20File%202_NEW.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Uso de tintes de bajo costo para visualizar la acumulación de glucógeno y la integridad intestinal en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

using-low-cost-dyes-to-visualize-glycogen-accumulation-gut-integrity

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Investigación

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Biología

Se presenta un método para visualizar la cutícula en...

La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII

Aquí, describimos una técnica utilizada para visualizar el ADN genómico en nematodos fijos e intactos. El video incluye un ejemplo de protocolo para contar cromatina en ovocitos no fertilizados de C. elegans.

Fijación de etanol y tinción con DAPI: un método para visualizar el ADN en C. elegans

Se presentan sólidos métodos bioquímicos y microscópicos para el estudio...

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

El músculo esquelético es esencial para la locomoción y es la tienda principal proteína de los cuerpos. Se describen las medidas de salud musculares dentro de C. elegans. Los posibles cambios en la estructura y la función muscular se evaluó a través de las buenas prácticas agrarias localizadas y colorantes catiónicos.

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en C. elegans

Una guía paso a paso para la pérdida de acidez lysosomal en el intestino de C. elegans con el colorante vital sensible a pH 6 - carboxi - 2', 7'-Diclorofluoresceína diacetato...

Evaluación de alcalinización Lysosomal en el intestino de vivir Caenorhabditis elegans

Describimos una extracción en pequeña escala modificada y análisis colorimétricos de lactato y piruvato en el nematodo elegans C.. Cuando se utilizan kits de ensayo comerciales, el desarrollo técnico de su sensibilidad y su precisión es importante. Precipitación de proteínas en la extracción es el paso más crítico para la determinación cuantitativa de los metabolitos intracelulares.

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Este protocolo muestra cómo realizar el seguimiento un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor usando una fluorescencia verde (GFP) fusion proteína como marcador y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. El protocolo de tinción de DAPI es rápido y conserva las señales de localización subcelular de GFP y proteína.

Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Este protocolo describe cómo medir la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método es útil para la investigación biológica básica sobre la salud intestinal relacionada con la interacción entre las bacterias intestinales y su huésped y para la detección para identificar agentes probióticos y químicos para curar el síndrome del intestino con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales.

Medición de los efectos de las bacterias y los productos químicos en la permeabilidad intestinal de los ceganes

Aquí, se presenta un método para el análisis de la cinética de agregación de proteínas en el nematodo Caenorhabditis elegans. Los animales de una población sincronizada por edad se visualizan en diferentes puntos de tiempo, seguidos de un recuento de inclusión semiautomatizado en CellProfiler y se ajustan a un modelo matemático en AmyloFit.

Monitoreo de la cinética de agregación de proteínas in vivo mediante el conteo automatizado de inclusión en Caenorhabditis elegans

Aprende a evaluar glucógeno y permeabilidad intestinal en Caenorhabditis elegans usando colorantes de bajo costo. Este protocolo educativo permite estudiar metabolismo y envejecimiento con recursos limitados.

Uso de tintes de bajo costo para visualizar la acumulación de glucógeno y la integridad intestinal en Caenorhabditis elegans

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