Name: Inmunoprecipitación con un gel de afinidad anti-epítopo para estudiar las interacciones proteína-proteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprende inmunoprecipitación con gel de afinidad anti-epítopo para estudiar interacciones proteína-proteína usando células HEK-293. Este método valida asociaciones entre PRDM16 y EHMT1 con aplicaciones en biología celular.

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Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) y MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).

La Figura 1 presenta una descripción general del protocolo.
1. Preparación de soluciones y tampones
<ol><li>Tampón de lisis de proteínas: Prepare el tampón de lisis de proteínas siguiendo un informe publicado anteriormente7 (Tabla 1).</li>
	<li>Tampón de lisis de proteínas + inhibidor de proteasa (PI): Añada un inhibidor de proteasa (véase la tabla de materiales) al tampón preparado anteriormente (paso 1.1). Conservar a -20 °C.</li>
	<li>Tampón de muestra: Mezclar 900 μL de 4 tampones de muestra Laemmli (ver Tabla de Materiales) y 100 μL de 2-mercaptoetanol. Conservar a -20 °C.</li>
	<li>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) con monolaurato de sorbitán de polioxietileno (20) (PBS-P): Mezclar 1.998 L de PBS y 2 mL de monolaurato de sorbitán de polioxietileno (20) (ver Tabla de Materiales). Almacene a temperatura ambiente.</li>
	<li>1x Tampón Tris/Glicina/SDS: Mezcle 450 mL de DDW y 50 mL de 10x Tris/Glycine/SDS. Preparar a temperatura ambiente el día de su uso.</li>
</ol>2. Transfección de plásmidos
<ol><li>Cultivo de células HEK-293 en una placa recubierta de colágeno de 10 cm hasta subconfluencia (80%-95%) utilizando el medio de águila modificado de Dulbecco que contiene 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades/mL de penicilina G y 10.000 μg/mL de estreptomicina) (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Prepare 1-10 μg de plásmido7 a transfectar por plato y haga una mezcla de transfección. Añadir 150 mM de NaCl a un volumen final de 250 μL por plato. Agita y gira la mezcla.</li>
	<li>Añadir 60 μL de 1 mg/mL de polietilenimina (PEI, ver Tabla de Materiales) por placa, seguido de 150 mM de NaCl hasta un volumen final de 250 μL de solución de PEI.</li>
	<li>Agregue la solución de PEI a la mezcla de transfección para hacer una solución mezclada. Inmediatamente vórtice (a la velocidad máxima durante 3-5 s, realice lo mismo a partir de entonces) y gire hacia abajo.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 15-30 min. Durante este tiempo, cambie el medio de las células HEK-293.</li>
	<li>Espolvorear 500 μL/plato de solución mezclada por todo el plato de células HEK-293 e incubar durante la noche (13-14 h).</li>
	<li>Realice el intercambio medio al día siguiente.</li>
</ol>3. Lisis celular y preparación de muestras
NOTA: Para evitar la degradación de las proteínas, los pasos posteriores deben realizarse sin conservar ni congelar y descongelar la muestra en la medida de lo posible.
<ol><li>Aproximadamente 48 h después de la transfección, lavar las células tres veces con PBS helado, añadir 500 μL/plato de tampón de lisis de proteínas + PI, y recoger las células mediante un raspador celular y una pipeta en un tubo con baja adsorción de proteínas en hielo.</li>
	<li>Agite el vórtice cada 5 min e incube las muestras en hielo durante 10 min.</li>
	<li>Centrifugar a 16.400 x g durante 10 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo fresco de 1,5 mL con baja adsorción de proteínas. Las muestras pueden almacenarse a -80 °C.</li>
	<li>Determine la concentración de proteínas de las muestras con un kit de medición de concentración de proteínas de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Separe 200-1000 μg de la misma cantidad de proteína en cada muestra, luego agregue tampón de lisis de proteínas + PI para ajustar el volumen total a 500-1000 μL. NOTA: Los siguientes pasos se realizan con hielo.</li>
</ol>4. Preparación de la lechada
NOTA: Prepare una suspensión 1:1 de gel de proteína G y gel de afinidad con etiqueta de epítopo el día anterior o el día de la inmunoprecipitación.
<ol><li>Preparación de un gel de proteína G<ol><li>Con una punta con el extremo cortado, mezcle bien y luego separe el gel de proteína G (consulte la tabla de materiales) de manera que se preparen 20 μL de perlas por muestra.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 20 s a 4 °C y colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen. Deseche el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Añadir 1 mL de tampón de lisis de proteínas + PI al gel de proteína G preparado en el paso 4.1.2 y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Centrifugar a 12.000 x g durante 20 s a 4 °C, colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Repita el paso 4.1.3 tres veces.</li>
		<li>Agregue un volumen igual de tampón de lisis de proteínas al gel de proteína G para hacer una suspensión de gel de proteína G 1:1. La suspensión de gel de proteína G puede almacenarse a 4 °C durante aproximadamente 1 día.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de un gel de afinidad de etiquetas epitopo<ol><li>Con una punta con el extremo cortado, agite bien y luego separe el gel de afinidad de la etiqueta de epítopo (consulte la Tabla de materiales) de modo que se preparen 10-15 μL de perlas por muestra.</li>
		<li>Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C y esperar 1 minuto en hielo para que las perlas se nivelen. Deseche el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Añadir 1 mL de tampón de lisis de proteínas + PI al gel de afinidad de etiquetas de epítopos preparado en el paso 4.2.2 y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C, colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen y desechar el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Repita el paso 4.2.3 dos veces.</li>
		<li>Añadir 500 μL de glicina 0,1 M (pH 3,5) al gel de afinidad de la etiqueta de epítopo preparado en el paso 4.2.4 y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Este paso se realiza para eliminar los anticuerpos libres de la marca epítopo. Dentro de los 20 minutos posteriores a la adición de glicina, centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C, colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que se nivelen y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 500 μL de tampón de lisis de proteínas + PI al gel de afinidad de la etiqueta de epítopo preparado en el paso 4.2.5 y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C, colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Repita el paso 4.2.6 tres veces.</li>
		<li>Añada un volumen igual de tampón de lisis de proteínas al gel de afinidad de la etiqueta de epítopo para preparar una suspensión de gel de afinidad de la etiqueta de epítopo 1:1. La suspensión de gel de afinidad con etiqueta epitope puede almacenarse a 4 °C durante aproximadamente 1 día.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Aclarado previo con el gel de proteína G y captura de complejos proteicos con el gel de afinidad de etiqueta de epítopo
<ol><li>Mezcle una suspensión de proteína G 1:1 (preparada en el paso 4) con una pipeta provista de una punta de corte y añada 40 μL cada vez a la muestra.</li>
	<li>Rotar la muestra durante 1 h en un rotador (ver Tabla de Materiales) en aproximadamente 30 s por ciclo en una cámara refrigerada (4 °C).</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 20 s a 4 °C y colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen.</li>
	<li>Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 mL con baja adsorción de proteínas.</li>
	<li>Separe la muestra para la entrada de la muestra en el paso 5.4 y transfiérala a un nuevo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Añadir 20-30 μL de suspensión de gel de epítopo 1:1 a la muestra.</li>
	<li>Gire sobre un rotor durante aproximadamente 30 s por ciclo en una cámara refrigerada (4 °C) durante 2 h.</li>
	<li>Añada tampón de muestra a la entrada preparada en el paso 5.5 para diluirla a 4x, y caliente a 98 °C durante 10 min. La entrada se puede almacenar a -80 °C. NOTA: Debido a la posibilidad de degradación de proteínas debido a la congelación y descongelación, se deben realizar los pasos posteriores sin preservar la proteína tanto como sea posible.</li>
</ol>6. Lavado y elución de las proteínas precipitadas
<ol><li>Ajuste la temperatura del bloque de calor a 98 °C.</li>
	<li>Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C y esperar 1 minuto en hielo para que las perlas se nivelen. Deseche el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón de lisis de proteínas + PI y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Gire sobre un rotor durante aproximadamente 30 s por ciclo en una cámara refrigerada (4 °C) durante 5 minutos. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C, esperar 1 min en hielo para permitir que las perlas se nivelen y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Repita el paso 6.3 de 5 a 10 veces.</li>
	<li>Añadir 10 μL de tampón de muestra a la muestra preparada en el paso 6.4. Hervir a 98 °C durante 10 min.</li>
	<li>Centrífuga a 5.000 x g a 4 °C durante 30 s.</li>
	<li>Coloque una columna en un tubo nuevo con baja adsorción de proteínas y transfiera el gel a la columna usando una pipeta con una punta cortada. Se utiliza una columna para evitar la contaminación del gel.</li>
	<li>Centrífuga a 9.730 x g durante 1 min a 4 °C. Recoja el flujo continuo. La muestra se puede almacenar a -80 °C. NOTA: Si la degradación de la muestra es una preocupación, se debe realizar la siguiente inmunotransferencia sin congelación.</li>
</ol>7. Inmunotransferencia
NOTA: Los procedimientos de inmunotransferencia se basan en informes previos 7,8.
<ol><li>Cargue muestras enteras en un gel de poliacrilamida de dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE, consulte la tabla de materiales). NOTA: Si es necesario, utilice geles de pocillos grandes de manera que se pueda transferir toda la muestra. Aquí se utilizaron geles con pocillos de 50 μL.</li>
	<li>Coloque los geles en la cámara de electroforesis y agregue 1x tampón Tris/Glycine/SDS (consulte la Tabla de materiales) hasta el volumen apropiado alrededor de los geles.</li>
	<li>Geles electroforosos a 100 V y 400 mA.</li>
	<li>Transfiera a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF, consulte la tabla de materiales).</li>
	<li>Bloquee las manchas de la membrana de PVDF con leche desnatada al 5% en PBS-P durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la membrana tres veces con PBS-P en una coctelera a máxima velocidad durante 5 minutos. Realice el mismo procedimiento a partir de entonces al lavar.</li>
	<li>Incubar durante la noche en un agitador con el anticuerpo primario (ver Tabla de Materiales) a 4 °C.</li>
	<li>Lave la membrana tres veces con PBS-P al día siguiente.</li>
	<li>Incubar durante 1 h con el anticuerpo secundario en un agitador a temperatura ambiente. NOTA: Si el peso molecular de la proteína objetivo está cerca de la cadena pesada IgG, que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, se puede usar un anticuerpo secundario específico de cadena ligera para evitar la superposición de la banda objetivo con la cadena pesada IgG. En este estudio se utilizaron anticuerpos específicos de cadena ligera7 o Veriblot como reactivo de detección de IP (véase la tabla de materiales).</li>
	<li>Identificar bandas de proteínas con sustratos luminiscentes de peroxidasa. La membrana se puede guardar en PBS después de lavarla dos veces con PBS-P.</li>
	<li>Peque durante 10 min con una solución de decapado (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Lavar tres veces y bloquear con leche descremada al 5% en PBS-P. A partir de entonces, el protocolo es el mismo que en el paso 7.6 en adelante.</li>
</ol>

Análisis de interacción de proteínas en células HEK-293 mediante coinmunoprecipitación

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+from+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).</li>
<li>Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+proteomics%3B+current+achievements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B-Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional proteomics; current achievements.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+polypeptide+marker+sequence+useful+for+recombinant+protein+identification+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification.</a> Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Gerace, E., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+pull-down+of+proteins+using+anti-FLAG+M2+agarose+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads.</a> Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).</li>
<li>Einhauer, A., Jungbauer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLAG+peptide%2C+a+versatile+fusion+tag+for+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemical+and+biophysical+methods%22%5BJournal%5D)">The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins.</a> Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).</li>
<li>Egusa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+of+PPAR%CE%B1+maintains+thermogenic+capacity+of+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes.</a> iScience. 26 (7), 107143(2023).</li>
<li>Nagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+classical+brown+adipocytes+in+the+adult+human+perirenal+depot+is+highly+correlated+with+PRDM16-EHMT1+complex+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression.</a> PLoS One. 10 (3), e0122584(2015).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li>
<li>Kajimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+brown+and+white+fat+gene+programs+through+a+PRDM16%2FCtBP+transcriptional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex.</a> Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).</li>
<li>Shinkai, Y., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9+methyltransferase+G9a+and+the+related+molecule+GLP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP.</a> Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).</li>
<li>Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+effects+on+adipocytes+are+influenced+by+the+presence+of+lysine+methyltransferases%2C+G9a+%28EHMT2%29+and+GLP+%28EHMT1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1).</a> Biology. 12 (5), 674(2023).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT1+controls+brown+adipose+cell+fate+and+thermogenesis+through+the+PRDM16+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex.</a> Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).</li>
<li>Bian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+establishing+a+protein-protein+interaction+network+using+tandem+affinity+purification+followed+by+mass+spectrometry+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101569(2022).</li>
<li>Cristea, I. M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of protein complexes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li>
<li>Holden, P., Horton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crude+subcellular+fractionation+of+cultured+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines.</a> BMC Research Notes. 2, 243(2009).</li>
<li>Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+detergent+concentration+conditions+for+immunoprecipitation+%28IP%29+coupled+with+LC-MS%2FMS+identification+of+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins.</a> Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).</li>
<li>Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+salt+fractionation+of+nuclei+to+analyze+chromatin-associated+proteins+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells.</a> BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175(2017).</li>
</ol>

Declaramos que ninguno de los autores tiene ningún conflicto de intereses relacionado con este estudio.

Este protocolo es casi iguala los protocolos 5,7,14,15 reportados anteriormente. El punto importante de este protocolo es que nunca detenemos el experimento desde la etapa de lisis celular hasta la etapa de inmunoprecipitación. La degradación de proteínas dificulta la detección de IBP. El curso de tiempo prolongado y los ciclos repetidos de congelación y descongelación degradan las proteínas. La electroforesis en SDS-PAGE también debe realizarse el mismo día de la inmunoprecipitación, no solo para minimizar la degradación de proteínas, sino también para maximizar la detección de IBP.
En adipocitos termogénicos, la interacción entre EHMT1 y PRDM16 fue reportada en un estudio previo13. El complejo EHMT1 - PRDM16 regula el destino y la termogénesis de las células de los adipocitos marrones13. EHMT1 hace que PRDM16 se estabilice interrumpiendo la interacción de PRDM16 - proteína de unión a proteína amiloide (APPBP) 216. Esta estabilización de PRDM16 está regulada por cullin(CUL) 2-APPBP2 y EHMT116.
En este estudio, se utilizaron células HEK-293 debido a que las células HEK-293 son ampliamente utilizadas en la producción de proteínas recombinantes17. Se pueden utilizar otras líneas celulares que son fáciles de transfectar con plásmidos, como las células Cos-7 y las células Hela. Se utilizó PEI para la transfección porque la PEI es más económica y sencilla en comparación con la lipofección convencional.
El aclarado previo, la rotación en un gel de afinidad de etiquetas de epítopo y el lavado son pasos particularmente importantes en este método. La limpieza previa puede eliminar las proteínas que se unen de forma no específica al gel. Además, el tiempo de rotación con el gel de afinidad de la etiqueta de epítopo es importante porque un tiempo excesivo puede dar lugar a la detección de proteínas inespecíficas, y un tiempo insuficiente puede dificultar la detección de las proteínas objetivo.
Cabe señalar los siguientes puntos. Las células HEK-293 se desprenden fácilmente; Por lo tanto, se deben utilizar platos recubiertos de colágeno al preparar las muestras. La solución de PEI es citotóxica; Por lo tanto, el medio debe reemplazarse después de la transfección sin salir de las células durante un período prolongado. Si no se observan IBP, la cantidad de plásmidos transfectados puede ser insuficiente y/o la cantidad de proteína introducida en el IP puede ser baja. Además, si el número de lavados es excesivo, es posible que se pasen por alto las interacciones. Para abordar estos, se puede considerar lo siguiente: aumentar la cantidad de plásmido introducido en las células HEK-293, aumentar la cantidad de proteína utilizada para la IP y reducir el número de lavados. Además, si se deja demasiado sobrenadante en el lavado final, se desbordará de los pocillos del gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida. Si se observan bandas inespecíficas, la cantidad de plásmido/proteína utilizada para la IP puede ser demasiado alta, o el número o la intensidad de los lavados pueden ser insuficientes. Estos problemas pueden abordarse reduciendo la cantidad de plásmido/proteína utilizada para la IP, aumentando el número de lavados o aumentando la potencia de lavado aumentando la concentración de sal en el tampón de lavado.
Los detergentes de uso común, como el éter de polioxietileno (10) octilfenilo, pueden alterar los IBP funcionalmente significativos18. Los detergentes más suaves pueden aumentar la recuperación de complejos funcionalmente importantes, mientras que pueden producir un nivel inaceptable de interacciones inespecíficas debido a una solubilización incompleta. El tampón de lisis de proteínas utilizado en el estudio actual contiene un 1% de éter de polioxietileno (10) octilfenil. Este tampón lisa proteínas citoplasmáticas con altas cantidades de proteínas sobreexpresadas por los plásmidos transfectados. Cuando la inmunoprecipitación se realiza en muestras preparadas separando núcleos y citoplasma, el fondo disminuye en comparación con las muestras preparadas por lisis de células completas, y se pueden identificar bandas diana claras17. Si la inmunoprecipitación se realiza con proteínas en el núcleo, las proteínas nucleares pueden extraerse utilizando un kit de extracción nuclear comercial o destruyendo y retirando el citoplasma con tampón bajo en sal que contiene detergente y posteriormente extrayendo proteínas nucleares con tampón alto en sal19. El tiempo de desarrollo en el inmunoblot debe ajustarse no solo para evitar el fondo, sino también para detectar ciertas bandas.
Este método tenía varias limitaciones. En primer lugar, utilizamos un PPI que se espera que detecte. En segundo lugar, debido a que la expresión de cada gen depende de la combinación de plásmidos, es posible que no se obtenga suficiente proteína y, por lo tanto, es posible que la interacción no se detecte.
En resumen, con este método, los IBP pueden confirmarse de forma económica y sencilla en comparación con la espectrometría de masas. El PPI entre las diversas proteínas fusionadas con la etiqueta del epítopo también se puede confirmar mediante el uso de anticuerpos de afinidad contra cada etiqueta en lugar del gel de afinidad de la etiqueta del epítopo. Se pueden realizar métodos de inmunoprecipitación similares en otros tipos de células mediante la introducción de un plásmido que exprese cualquier proteína fusionada con la etiqueta DYKDDDDK. Además, el uso de anticuerpos endógenos en lugar de un gel de afinidad de etiqueta de epítopo permite confirmar los IBP endógenos en varios tipos de células.

Las proteínas desempeñan un papel importante en todas las funciones celulares, incluido el procesamiento de la información, el metabolismo, el transporte, la toma de decisiones y la organización estructural. Las proteínas median sus funciones interactuando físicamente con otras moléculas. Las interacciones proteína-proteína (IBP) son importantes para mediar las funciones celulares, como la mediación de la transducción de señales, la detección del entorno, la conversión de energía en movimiento físico, la regulación de la actividad de las enzimas metabólicas y de señalización, y el mantenimiento dela organización celular. Por lo tanto, los IBP se pueden utilizar para dilucidar funciones desconocidas2. Los métodos para detectar IBP se pueden clasificar en tres tipos: in vitro, in vivo e in silico. Para la detección in vitro de IBP se han utilizado la coinmunoprecipitación (co-IP), la cromatografía de afinidad, la purificación por afinidad en tándem, las matrices de proteínas, la visualización de fagos, la complementación de fragmentos de proteínas, la cristalografía de rayos X y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear3. Entre estos métodos, la co-IP es ampliamente utilizada debido a su simplicidad.
La etiqueta de fusión FLAG consta de ocho aminoácidos (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), incluido un sitio de escisión de enteroquinasa, y fue diseñada específicamente para la cromatografía de inmunoafinidad4. Las proteínas marcadas con DYKDDDDK se reconocen y capturan mediante un anticuerpo anti-DYKDDDDK. Por lo tanto, se reducen de manera eficiente utilizando perlas de agarosa de unión DYKDDDDK5 para confirmar su unión a proteínas específicas de una manera simple. La inmunoprecipitación se puede realizar en una variedad de células, y una amplia gama de IBP se puede confirmar utilizando anticuerpos contra la proteína de interés. La inmunoprecipitación y la elución de péptidos con perlas de agarosa anti-DYKDDDDK han sido reportadas previamente5.
Aquí, proporcionamos un método de inmunoprecipitación simple en el que un plásmido que codifica una proteína marcada con DYKDDDDK se introduce transitoriamente en las células HEK-293 para confirmar la asociación de dos proteínas de interés. Ciertos anticuerpos DYKDDDDK pueden unirse tanto al extremo N-terminal como al extremo C-terminal de las proteínas de fusión, pero no a otros6. Por lo tanto, para evitar confusiones, se debe elegir el anticuerpo que reconoce la etiqueta fusionada con los extremos N y C. Al insertar una etiqueta de epítopo, puede ser posible evitar cambios conformacionales en la proteína insertando de 3 a 12 pares de bases entre la etiqueta de epítopo y la proteína objetivo. Sin embargo, la secuencia insertada debe ser un par de bases en múltiplos de 3 para evitar el cambio de marco.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH8.0)</td><td>Gen nipón</td><td>311-90075</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Gel de proteínas prefabricadas, 10 pocillos, 50 y micro; L</td><td>Biorad</td><td>4561034</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glicina/SDS</td><td>Biorad</td><td>1610772</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Gel de afinidad</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-ratón, oveja ab entera ligada a HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-conejo, burro Ab entero ligado a HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células M</td><td>Sumitomo Baquelita</td><td>MS-93170</td><td></td></tr><tr><td>Plato de Colágeno I 100 mm</td><td>IWAKI</td><td>4020-010</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Cóctel Inhibidor de la Proteasa sin EDTA</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX suplemento</td><td>Invitrogen 10565042</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00626</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>077-00735</td><td></td></tr><tr><td>HA-Tag (C29F4) Conejo mAb #3724</td><td>Señalización celular</td><td>C29F4</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Tampón</td><td>de muestra Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Columnas de cromatografía Biorad</td><td></td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell para mini geles prefabricados</td><td>Biorad</td><td>1658004JA</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG M2 producido en ratón</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-FLAG-PRDM16</td><td>Este documento</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-EHMT1</td><td>Este documento</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-vector</td><td>Este documento</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Grado de transfección Lineal Clorhidrato de polietilenimina</td><td>PSI</td><td>24765</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>Thermo scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Éter de polioxietileno(10) octilfenil</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno(20) Monolaurato de sorbitán</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>167-11515</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs Cytiva</td><td></td><td>17061801</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubos</td><td>eppendorf</td><td>30108442</td><td></td></tr><tr><td>ROTATOR RT-5</td><td>TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr>leche<td>desnatada</td><td>Morinaga</td><td>0652842&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución de pelado</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>193-16375</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack</td><td>Biorad</td><td>1704156B03</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo System</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Veriblot</td><td>Abcam</td><td>ab131366</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actina (13E5) Conejo mAb&nbsp;#4970</td><td>Señalización celular</td><td>4970S</td><td></td></tr></tbody></table>

inmunoprecipitación con un gel de afinidad anti-epítopo para estudiar las interacciones proteína-proteína

Immunoprecipitation with an Anti-Epitope Tag Affinity Gel to Study Protein-Protein Interactions

Las interacciones proteína-proteína (IBP) desempeñan un papel fundamental en los fenómenos biológicos, como la organización celular, la transducción de señales intracelulares y la regulación transcripcional. Por lo tanto, la comprensión de los IBP es un punto de partida importante para una mayor investigación de la función de la proteína diana. En este estudio, proponemos un método simple para determinar la unión de dos proteínas diana mediante la introducción de vectores de expresión de mamíferos en células HEK-293 utilizando el método de polietilenimina, lisando las células en un tampón de lisis de proteínas casero y tirando de las proteínas diana en un gel de afinidad de etiqueta de epítopo. Además, el PPI entre las diversas proteínas fusionadas con la etiqueta del epítopo puede confirmarse mediante el uso de anticuerpos de afinidad contra cada etiqueta en lugar del gel de afinidad de la etiqueta del epítopo. Este protocolo también podría utilizarse para verificar varios IBP, incluidos extractos nucleares, de otras líneas celulares. Por lo tanto, se puede utilizar como método básico en una variedad de experimentos de PPI. Las proteínas se degradan por un curso de tiempo prolongado y ciclos repetidos de congelación y descongelación. Por lo tanto, la lisis celular, la inmunoprecipitación y la inmunotransferencia deben realizarse de la manera más fluida posible.

Los adipocitos termogénicos, también conocidos como adipocitos marrones y beige, tienen efectos potenciales contra la obesidad y la intolerancia a la glucosa. El dominio PR (PRD1-BF1-RIZ1 homólogo) 16 (PRDM16) es un cofactor de transcripción que desempeña un papel importante en la determinación de la identidad de los adipocitos termogénicos 9,10.
EHMT1 (histona-lisina N-metiltransferasa 1 eucromática), también conocida como GLP, cataliza principalmente la mono y dimetilación de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9) utilizando el cofactor S-adenosil metionina11. Un informe previo indicó que EHMT1 es una metiltransferasa esencial en el complejo PRDM16 que controla el destino de las células grasas termogénicas a través de la metilación de histonas12,13. Además, hemos informado previamente que los niveles de expresión de PRDM16 y EHMT1 están significativamente correlacionados con los de los genes termogénicos en el tejido adiposo marrón perirrenal humano (BAT), lo que sugiere que tanto PRDM16 como EHMT1 juegan un papel importante en el desarrollo de BAT humano8.
Para demostrar la eficacia de este protocolo como método de confirmación de los IBP, transfectamos DYKDDDDK-PRDM16 y HA-EHMT1 en células HEK-293 e inmunoprecipitamos DYKDDDDK-PRDM16 utilizando el protocolo anterior. PRDM16 marcado con DYKDDDDK y EHMT1 marcado con HA se insertaron en los sitios de clonación del vector de expresión de mamíferos pcDNA3.1 (ver Tabla de Materiales). La inmunotransferencia confirmó la asociación entre DYKDDDDK-PRDM16 y HA-EHMT1 en los grupos transfectados con DYKDDDDK-PRDM16 y HA-EHMT1 (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de la coinmunoprecipitación. Aquí se muestra el esquema del protocolo. El lado derecho muestra el flujo de trabajo del protocolo; El lado izquierdo muestra una representación gráfica de las reacciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig02.jpg"> Figura 2: PRDM16 se asocia con EHMT1. Las células HEK-293 se transfectaron con el vector (control negativo), DYKDDDDK-PRDM16, o DYKDDDDK-PRDM16 y HA-EHMT1. Posteriormente, se realizó una coinmunoprecipitación utilizando un gel de afinidad de etiqueta DYKDDDDK, seguido de inmunotransferencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Tampón de lisis de proteínas 250 mL (0,22 μm de filtración, almacenar a 4 °C)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Ml</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td>
			<td>12.5</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr><tr><td>5 M de NaCl</td>
			<td>7.5</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>0,5 M Ácido etilendiaminotetraacético</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr><tr><td>Glicerol</td>
			<td>25</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>Éter de polioxietileno (10) octilfenilo</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>DDW (en inglés)</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>250</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición del tampón de lisis de proteínas.

Las interacciones proteína-proteína son importantes para dilucidar la función de las proteínas diana, y la coinmunoprecipitación (co-IP) puede confirmar fácilmente los IBP. Transfectamos transitoriamente un plásmido que codifica una proteína marcada con un epítopo en células HEK-293 y desarrollamos un método de inmunoprecipitación para confirmar fácilmente la unión de dos proteínas objetivo.

Inmunoprecipitación con un gel de afinidad anti-epítopo para estudiar las interacciones proteína-proteína

Protein-protein interactions (PPIs) play a pivotal role in biological phenomena, such as cellular organization, intracellular signal transduction, and ...

El alcance de nuestra investigación abarca la exploración de los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo y la función de la grasa marrón y beige. Los troncos, los factores de fricción y los cofactores como el complejo PRDM 16, la NFIA y el complejo PPR alfa ELK-1 que hemos encontrado más recientemente controlan el destino y la función de las células grasas marrones y beige. Además, se ha identificado la diafonía de los adipocitos de las células inmunitarias como actores clave.Para avanzar en la investigación en su campo, empleamos varias tecnologías de vanguardia. Estos incluyen la PCR cuantitativa y la inmunoprecipitación de cromatina para analizar los cambios en la expresión génica, así como la inmunoprecipitación y la espectrometría de masas para investigar las alteraciones en las interacciones proteína-proteína, PPI, asociadas con la diferenciación en adipocitos beige. A pesar de seguir el protocolo estándar para la inmunoprecipitación, la detección de IBP a menudo resulta un desafío.La degradación de las proteínas es la causa principal de este problema, que debemos evitar cuidadosamente. Este protocolo es más simple y menos costoso que otras técnicas para examinar los IBP, y no incluye la congelación y descongelación en el proceso, lo que reduce la degradación de las proteínas tanto como sea posible.

immunoprecipitation-with-an-anti-epitope-tag-affinity-gel-to-study

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

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Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

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