Microscopía electrónica y de luz correlativa de inclusión posterior a Epon
12 de enero de 2024
Presentamos un protocolo detallado para la microscopía correlativa de luz y electrónica posterior a la inclusión de Epon utilizando una proteína fluorescente llamada mScarlet. Este método puede mantener la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente. Esta técnica es susceptible de una amplia variedad de aplicaciones biológicas.
La microscopía correlativa de luz y electrónica es una técnica de microscopía completamente estable, que puede combinar la información de localización proporcionada por la microscopía fluorescente y es la ultraestructura por microscopía electrónica. Sin embargo, la mentalidad de esta técnica es preservar la fluorescencia después de tener una preparación simple. Usando esta proteína fluorescente, podemos lograr luz correlativa y el microscopio electrónico que puede mantener la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente.
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo detallado para microscopía correlativa de luz y electrónica con inclusión en Epon después de la inclusión, utilizando la proteína fluorescente mScarlet. El método conserva con éxito tanto la fluorescencia como la ultraestructura, lo que lo hace aplicable a diversas aplicaciones biológicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Microscopía correlativa de luz y electrónica
- Aplicaciones de proteínas fluorescentes
- Técnicas de microscopía
Antecedentes
- Combinación de microscopía fluorescente con microscopía electrónica
- Dificultades para preservar la fluorescencia durante la preparación
- Uso de mScarlet para mejorar la imagen
Métodos Utilizados
- Técnicas de microscopía correlativa de luz y electrónica
- Tejido cerebral de ratón como modelo biológico
- Post-inclusión utilizando Epon y mScarlet
Resultados principales
- Preservación exitosa de la fluorescencia y la ultraestructura
- Imagen detallada del tejido cerebral
- Alineación efectiva de las señales de microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica
Conclusiones
- El estudio demuestra un método confiable para la microscopía correlativa de luz y electrones
- Destaca el potencial para aplicaciones más amplias en la investigación biológica
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía correlativa de luz y electrones (CLEM) con inclusión posterior en resina epoxi permite la preservación simultánea de la fluorescencia y la ultraestructura, abordando un desafío crítico en la etapa de descubrimiento de la imagenología celular. Esta capacidad mejora la desvinculación mecanicista y la validación de dianas al proporcionar un contexto espacial de alta resolución para la localización molecular. El método respalda la confianza predictiva en puntos clave de inflexión dentro de las etapas tempranas del descubrimiento y las líneas de investigación preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la localización precisa de dianas moleculares dentro de la ultraestructura celular conservada.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la correlación de señales de fluorescencia con características ultraestructurales.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización directa de las relaciones moleculares y estructurales.
- Mejora la confianza predictiva para avanzar dianas en la fase de descubrimiento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara secciones biológicas validadas para flujos de trabajo de imágenes de alto contenido posteriores.
- Asegura la reproducibilidad y los resultados cuantitativos de imágenes mediante el mantenimiento de la fluorescencia y la ultraestructura.
- Apoya la estandarización y escalabilidad de ensayos para aplicaciones de cribado que requieren resolución espacial.
- Permite la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre estructuras subcelulares.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Correlaciona datos de localización molecular con cambios ultraestructurales relevantes para la enfermedad en modelos preclínicos.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la integración de datos de imágenes multimodales.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en evidencia espacial y molecular robusta.
- Mejora el desarrollo de biomarcadores traslacionales al correlacionar la fluorescencia con la patología ultraestructural.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en el proceso de descubrimiento desde la validación temprana de objetivos hasta la investigación preclínica, conectando el análisis de localización molecular con el análisis ultraestructural.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la correlación de datos moleculares y estructurales.
- Selección: Proporciona resultados de imágenes cuantitativas y reproducibles para el desarrollo de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones de alta resolución y resultados de registro de imágenes para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Permite la alineación de marcadores moleculares con ultraestructuras relevantes para enfermedades en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de imagen reutilizable para diversos programas de I+D que requieren microscopía correlativa.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imagen y garantiza la reproducibilidad entre experimentos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos espaciales robustos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos en descubrimiento y preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica.
- Exige acceso a instrumentación avanzada de imagen y software de registro de imágenes.
- Necesita estandarización entre equipos para los protocolos de preparación de muestras y de adquisición de imágenes.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes tipos de tejidos o sistemas modelo.
- Depende de la compatibilidad de las proteínas fluorescentes con la inclusión en Epon y la preparación para microscopía electrónica.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:44
Ultrathin Sectioning for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM)
1:33
Creating the Navigation Map for CLEM and Preparation of the Ultrathin Sections for Electron Microscopy
4:07
Image Analysis of Brightfield and Fluorescence Images of the Mouse Brain Sections for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy
6:16
Registration of the Fluorescence Microscopy Image with the Electron Microscopy Image for Correlative Light and Electron Microscopy
