Name: Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-20T18:40:00.000+00:00
Duration: 16 min 29 s
Description: Aprende a cultivar neuronas de bag cell de Aplysia californica para obtener conos de crecimiento grandes y realizar imágenes de alta resolución de su motilidad y dinámica del citoesqueleto.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría dar las gracias a Ryan Maneri (Producciones ostrero, LLC) para filmar nuestro procedimiento y Rodney McPhail (Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Purdue) para obtener ayuda con la edición de vídeo disección. La investigación en el laboratorio de Suter es apoyado por subvenciones del NIH (R01 NS049233) y el Centro Bindley Bioscience en la Universidad Purdue de DMS

Soluciones <ul><li> L15-ASW medio de cultivo celular (1l) <ul><li> 1 bolsa de polvo L15 </li><li> Añadir 800 ml de H 2 O ultrapura </li><li> NaCl 400 mM </li><li> MgSO4 27 mM </li><li> MgCl2 28 mM </li><li> L-glutamina 4 mM </li><li> Gentamicina 50 mg / ml </li><li> HEPES 5 mM </li><li> Ajustar el pH a 7.9 </li><li> Añadir gota a gota, CaCl2 9,3 mM (parada si se precipita) </li><li> Añadir H 2 O ultrapura a 1 l </li><li> Compruebe la osmolaridad (950-1000 mg / kg) con osmómetro (presión de vapor, Wescor # 5520) </li><li> Filtro de 0,22 micras utilizando una unidad de filtración a presión positiva (Filtros: SVGV010RS Millipore) </li><li> Almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes </li></ul></li><li> Poli-L-lisina (70-150 kD) 200 mg / ml de solución estéril de valores de H 2 O ultrapura se mantiene a -20 º C </li><li> 0,5 M de MgCl2 solución </li></ul> Día 1: La disección del ganglio abdominal de Aplysia Preparación de la solución enzimática disociación <ol><li> Pesar 10.9 mg de Dispasa enzima (Worthington, Cat: LS02111) en un tubo Eppendorf </li><li> Añadir 900 l de L15-ASW medio de cultivo, y 100 l de H 2 O estéril ultrapura </li><li> Mezcle y ponga a temperatura ambiente (TA) </li></ol> La disección del ganglio abdominal <ol><li> Llene una jeringa de 50 ml con 0,5 M de MgCl2 solución. </li><li> Tener un animal en el tanque, manejar con cuidado para evitar la respuesta animal entintado defensa. </li><li> Coloque la Aplysia a su lado en una tabla de disección (espuma de poliestireno bordo), parte rostral en el lado derecho, caudal a la izquierda. </li><li> Insertar la aguja en los animales justo detrás de la cabeza e inyecte toda la solución de MgCl 2 en la cavidad corporal. </li><li> Frote suavemente el animal para dispersar a la solución de MgCl 2 en toda la cavidad del cuerpo, espere unos minutos para que el animal anestesiado por completo. </li><li> Pin de la cabeza y la cola del animal a la mesa de disección con dos agujas. </li><li> El uso de fórceps para levantar la piel, cortar la piel y la capa muscular con unas tijeras de gran tamaño en la cabeza y la cola para hacer una gran abertura en el costado. </li><li> Encontrar el ganglio abdominal en el ovario similares a un cepillo. El uso de fórceps para mantener los nervios que conectan alrededor de 1 cm en la parte delantera de los ganglios abdominales, cortar los nervios con tijeras de disección en la parte delantera de la posición de pinzas de sujeción y por detrás del ganglio abdominal. </li><li> Ganglio lugar en la solución Dispasa e incubar durante 15-16 horas a 22 ° C utilizando un baño de agua con temperatura controlada. </li></ol> Día 2: Revestimiento de las células de la bolsa Aplysia La preparación de poli-lisina cubreobjetos <ol><li> En un banco de flujo, preparar tres platos de Petri de 35 mm como platos de trabajo para la disección de los ganglios, llenándolos de 4 ml L15-ASW medio cada uno. Transferir el ganglio abdominal de la solución dispasa a uno de los platos después de 15,5 horas de trabajo de la digestión. </li><li> Con unas pinzas tomar ácido limpiado # 1.5 cubreobjetos (22x22 mm) almacenados en etanol, eliminar el alcohol y esterilizar cubreobjetos por llamas brevemente sobre mechero Bunsen. Deje enfriar brevemente antes de colocar el cubreobjetos en las placas de cultivo. </li><li> Prepare una punta de placas curvas doblando una punta amarilla sobre el quemador Bunsen (llama brevemente para evitar la fusión de plástico!). </li><li> Preparar una cantidad apropiada de 20 mg / ml de solución de poli-lisina mediante la dilución de 200 mg / ml de solución madre con agua estéril H 2 O ultrapura. </li><li> Cubra cada portaobjetos con 500 l de 20 mg / ml de poli-lisina y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lave cada cubreobjetos 3-5 veces con 500 l estéril H 2 O ultrapura cada uno. </li><li> Eliminar el agua de cubreobjetos, llenar cada plato con 4 ml de medio de cultivo L15-ASW. </li></ol> La disociación de las células de la bolsa <ol><li> Bajo un microscopio de disección, corte el ganglio abdominal en la mitad con tijeras de disección y pinzas previamente lavado con etanol al 95% (Figura 1 línea 1). </li><li> En una mitad del ganglio, corte entre el grupo bolsa de células y las células hemiganglion (Figura 1 línea 2), y cortar resto de las extensiones de los nervios en el otro lado de la bolsa de las células (Figura 1 línea 3). Trabajo en una mitad del ganglio en un momento, dejar la otra mitad en el plato, mientras que las células del primer grupo están chapados. </li><li> El uso de dos pinzas (o un fórceps y tijeras de disección), bolsa de lanzamiento de racimo de células, empujando a un lado de la vaina de tejido conectivo que rodea el cúmulo de células bolsa. Cortar el tejido conectivo con tijeras de disección, si es necesario. Tenga cuidado de no apretar y tocar el grupo de células bolsa demasiado durante este proceso. </li><li> Cuando la mayoría del tejido conectivo se elimina, la transferencia de la bag grupo de células en un plato nuevo trabajo con la punta amarilla doblada preparado con anterioridad. Tenga cuidado de no dejar que el grupo de células bolsa de quedar atrapado dentro de la punta de color amarillo o pegado en la interfase aire / medio plazo. </li><li> Triturar el grupo con la punta amarilla para eliminar las células individuales de bolsa. Para ello, pipetear el grupo dentro y fuera de la punta. Comience con bajas fuerzas de corte y aumentar la fuerza cuando sea necesario. Utilice siempre la fuerza mínima necesaria para remover las neuronas sin matar demasiadas células. </li><li> Recoger 3-5 células bolsa sana y transferirlos a un plato con un cubreobjetos poli-lisina. Evitar la captación de las células muertas (que son de color negro / transparente en el centro) y restos de tejido conectivo. </li><li> Repita el paso 6. y el lugar alrededor de 15-25 neuronas vivas en el centro de cada cubreobjetos. Si las células muertas o restos son trasladados, así, eliminar el material no deseado recogerlo o soplando fuera de las células sanas. Este proceso toma alrededor de 2.3 horas para ambos grupos. </li><li> Una vez finalizado mantener las placas de cultivo en el banco de flujo de por lo menos 2 horas a temperatura ambiente para permitir que las células se adhieren (mantener banco de flujo del ventilador apagado para evitar que las vibraciones no deseadas). </li><li> Colocar las cápsulas en una incubadora a 14 ° C durante la noche, o hasta su posterior utilización. Los conos de crecimiento se puede desarrollar en 4.10 horas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="Figura 1. Esquemática de Aplysia californica ganglio abdominal. Líneas de color indican dónde cortar para obtener clusters bolsa de la célula." /> Figura 1. Esquemática de Aplysia californica ganglio abdominal. Líneas de color indican dónde cortar para obtener clusters bolsa de la célula. Día 3: Configuración de cámara para imágenes en vivo de las células de la bolsa Aplysia Montaje de imágenes de cámara <ol><li> Antes de utilizar las células de la bolsa de experimentos con células en vivo de imágenes, inspeccionar las células en un microscopio de baja potencia. Si las células no se han desarrollado los conos de crecimiento sano, el suministro de un nuevo medio y dejar a temperatura ambiente durante 1-2 horas. </li><li> Para suministrar las placas con medio fresco L15-ASW, eliminar la mitad (~ 2 ml) de medio de edad, con una línea de vacío, y añadir 2 ml de nuevo L15-ASW medio por placa de Petri. Es importante no eliminar por completo todo el medio del plato a la vez, ya que se eliminan las células del cubreobjetos. </li><li> Para obtener imágenes de bolsa de la célula, nos reunimos dos cubreobjetos y dos separadores de plástico en una cámara de imágenes de sándwich. El cubreobjetos encima del pastel se corta más corta para permitir un fácil intercambio de medios y reactivos. Durante el montaje, cubreobjetos con células bolsa adherida debe ser sumergido en el L15-ASW medio en todo momento para evitar que las células se desprenda. </li><li> Para preparar la cámara, cortar ~ 2 mm de lado derecho de un mm # 1 cubreobjetos 22x22 con diamante pluma (cortador de vidrio) y la regla. </li><li> Con una jeringa de 1 ml, aplicar grasa de alto vacío a ambos lados de la cubreobjetos cortos, y colocar separadores de plástico a cada lado. Aplicar grasa de vacío en la parte superior de los dos separadores. </li><li> Invertir el cubreobjetos y montaje espaciador, y ponerlo en un plato de Petri que contiene las células de la bolsa en un cubreobjetos. Alinear y presionar suavemente hacia abajo para pegar cubreobjetos arriba a abajo cubreobjetos con la punta opuesta de dos Q-tips. </li><li> Con unas pinzas, suavemente levante el conjunto del sándwich de la placa de Petri sin el medio de escape. Alinear los dos cubreobjetos, si es necesario, y limpie el exceso con un medio Kimwipe. Coloque el sándwich en la parte inferior del soporte portaobjetos y coloque la tapa con cuidado utilizando clips. </li><li> Limpiar el centro de la parte superior del sándwich con Q-tips se secó en el limpiador de cristales (Sparkle es utilizado como limpiador de cristales). Rápidamente secar el limpiador de cristales con un segundo y seco Q-tip para evitar las líneas consecutivas. Haga lo mismo con el cubre parte inferior. Cubreobjetos limpio, libre de líneas de racha son importantes para imágenes de alta calidad. </li></ol> Bolsa de células en el microscopio Desde Aplysia cultivos de células neuronales en la bolsa de baja densidad, lo mejor es que la configuración de su microscopio tiene funciones etapa de posicionamiento para facilitar el cambio entre las células. Las células de la bolsa puede ser fácilmente mantenido a temperatura ambiente durante varias horas en el escenario durante los experimentos de imagen. Cambio del medio periódicamente para evitar la evaporación.

<ol><li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li>
<li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule%2C+apCAM%2C+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li>
<li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li>
<li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li>
</ol>

Aplysia neuronas de células bolsa de proporcionar un suero libre de cultivos de células neuronales del sistema con muy pocas células no neuronales. Estas neuronas forman los conos de crecimiento muy grande adecuado para hacer frente a una serie de preguntas de biología celular importante. Bolsa de neuronas de células pueden ser instrumentalizadas fácilmente y con imágenes a temperatura ambiente durante varias horas. Utilizando microscopía de fluorescencia moteado (FSM), una cuantitativa puede analizar los distintos parámetros de F-actina y ...

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos de vidrio #1 de 22x22 mm</td><td>Herramienta</td><td>VWR international</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio #1.5 de 22x22 mm</td><td>Herramienta</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 35 mm</td><td>Herramienta</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Filtros para filtración de medio</td><td>Herramienta</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV010RS</td><td></td></tr><tr><td>Grasa de alto vacío</td><td>Herramienta</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>Osmómetro</td><td>Herramienta</td><td>Wescor</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Calzas de plástico</td><td>Herramienta</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>SHSP-200</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4030</td><td></td></tr><tr><td>Medio L15</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>41300-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Reactivo</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Reactivo</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6070-12</td><td></td></tr><tr><td>Polilisina-L (70-150 kD)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Reactivo</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa neutra (Dispasa)</td><td>Reactivo</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02111</td><td></td></tr></tbody></table>

las culturas de las células nerviosas de aplysia para imágenes de alta resolución de los conos de crecimiento

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Conos de crecimiento neuronales son estructuras altamente móviles en la punta de los axones que pueden detectar señales de orientación en el medio ambiente y la transducción de esta información en el movimiento direccional hacia la celda de destino adecuado. Para entender completamente cómo la información se transmite a la orientación de la superficie celular a la base de redes citoesqueleto dinámico, se necesita un sistema de modelo adecuado para imágenes de células vivas de la dinámica de proteínas de alta resolución temporal y espacial. Típico de los conos de crecimiento de vertebrados son demasiado pequeños para analizar cuantitativamente la F-actina y la dinámica de los microtúbulos. Las neuronas de la liebre de mar Aplysia californica son 5-10 veces más grande que las neuronas de los vertebrados, fácilmente se puede mantener a temperatura ambiente y son células muy robusta de micromanipulación y mediciones biofísicas. Sus conos de crecimiento tienen muy definido regiones citoplásmicas y un sistema de citoesqueleto bien descritos. Los cuerpos de las células neuronales se pueden microinyección con una variedad de sondas para el estudio de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. En el presente Protocolo que demostrar un procedimiento para la disección de los ganglios abdominales, la cultura de las neuronas de células bolsa y la creación de una cámara de imágenes de imágenes de células vivas de los conos de crecimiento.

Aplysia californica neuronas desarrollan un gran crecimiento en los conos de la cultura que son excelentes para imágenes de alta resolución de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. Aquí, se presenta un protocolo para la disección y de las planchas de las neuronas de células Aplysia bolsa, así como para la creación de una cámara de imágenes de células vivas.

Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento

Los conos de crecimiento neuronales son estructuras altamente móviles situadas en la punta de los axones que pueden detectar señales de guía en el entorno y transducir esta información...

En el laboratorio simulado, cultivamos neuronas de la célula bagal del molusco marino Plegia californica. Estas neuronas proyectan conos de crecimiento muy grandes, lo que los convierte en un excelente sistema modelo para estudios de alta resolución sobre la motilidad y la guía de los conos de crecimiento, especialmente para analizar la dinámica del citoesqueleto. En este video, demostramos cómo realizar una disección de Plegia y el cultivo de células bagales.Hola, soy Daniel Suter del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Purdue. Hoy les mostraremos el procedimiento para el cultivo por disección e imagen de neuronas de células dorsales de plegia. Las neuronas de la C, her apia CAA se han utilizado ampliamente en estudios de aprendizaje y memoria.Dado que Apia tiene un sistema nervioso sencillo y neuronas grandes adecuadas para la electrofisiología, en nuestro laboratorio utilizamos estas neuronas porque sus conos de crecimiento son grandes y muy adecuados para la obtención de imágenes de alta resolución de la dinámica de proteínas relacionada con la motilidad y la guía del cono de crecimiento. El procedimiento completo incluye los siguientes pasos.El primer día, se sacrifica al animal y se disecciona para obtener los ganglios abdominales. El segundo día, se preparan las placas de cultivo. Se disecan los grupos celulares posteriores y se siembran neuronas individuales.El tercer día, se construye una cámara de imagen para la adquisición de imágenes de lapso de tiempo de las células mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC), demostrando y narrando el procedimiento. La encargada de realizar el procedimiento hoy será iTune Lee, una estudiante de posgrado en mi laboratorio. Ella ahora les mostrará cómo preparar neuronas de células madre.Comencemos. Las neuronas de las células posteriores forman parte del ganglio abdominal del sistema nervioso de plegia, por lo que disecaremos todo el ganglio abdominal para su digestión enzimática. Luego separaremos los dos grupos de células en bolsa del resto del ganglio.El ganglio abdominal se digerirá en esta solución de fase dos durante 15 a 16 horas para aflojar los tejidos conectivos. Ahora necesitamos preparar una jeringa grande de 60 mililitros llena con 0,5 molar de cloruro de magnesio para sacrificar al animal y herramientas de disección limpias, una pinza de disección, tijeras y tijeras grandes. Son Aplysia californica provenientes de la costa californiana, que pesan aproximadamente 150 gramos.Mantenemos los animales en un tanque para langostas durante un máximo de tres a cuatro semanas. Se inyecta la solución de cloruro de magnesio cerca de la cabeza, dentro de la cavidad corporal del animal. Frotar el animal ayuda a distribuir la solución y evita que se contraiga.Fije el animal por la cabeza y la cola sobre una tabla de espuma de poliestireno utilizando agujas de jeringa. Levante el músculo de la pared corporal con una pinza y abra la cavidad corporal con unas tijeras grandes. A continuación, corte la pared corporal a lo largo del costado desde la cabeza hasta la cola y fije el músculo a la tabla.A continuación, debe localizarse el ganglio abdominal debajo del ovario, que es un órgano amarillento con aspecto de pincel. Puede encontrarse el ganglio abdominal. Desconecte el ganglio cortando los nervios con las tijeras de disección en los lados anterior y posterior del ganglio.Luego, transfiera el ganglio a un tubo de ensayo con un mililitro de la solución desplazada y colóquelo en un baño de agua a 22 grados durante 15,5 horas. Durante esta incubación, el tejido conectivo se aflojará hasta un punto en el que los cúmulos de células posteriores puedan eliminarse fácilmente. Antes de comenzar el cultivo de células posteriores, prepararemos las laminillas sobre las cuales se cultivarán las neuronas.Cultivamos neuronas de la médula espinal sobre laminillas recubiertas colocadas en placas de Petri de 35 milímetros. Posteriormente, se sumergen en medio L-15 A SW, que es un medio de cultivo con alta concentración de sales. Para este tipo de células, generalmente preparamos entre ocho y diez placas de Petri con laminillas por animal.Ahora analicemos las herramientas utilizadas para sembrar las neuronas de las células en bolsa. Para la disección de los grupos de células en bolsa, necesitaremos tres placas de color melocotón sin cubreobjetos, llenas con L 15 A SW, pinzas y tijeras finas esterilizadas con alcohol y una punta amarilla doblada unida a una pipeta P 20. La punta amarilla se calienta pasándola rápidamente por la llama de un mechero Bunsen y luego se dobla usando pinzas.Tenga cuidado de no aplastar la parte curvada. De lo contrario, el grupo de células de la bolsa podría quedar atrapado allí más adelante. La disección y siembra de células de la bolsa de plegia se realiza a temperatura ambiente bajo el microscopio de disección.Ahora ha finalizado la incubación enzimática de 15,5 horas y podemos transferir el ganglio abdominal desde el espacio del disco a uno de los recipientes de trabajo con medio L 15 A SW. Antes de mostrar cómo se aíslan las células en bolsa, veamos primero el esquema. Para visualizar cómo se disecciona el ganglio abdominal, primero cortamos el ganglio abdominal por el centro.Como puede observarse en esta línea. Luego realizamos dos cortes en la parte delantera y trasera de la espalda. Así se agrupan, como puede verse aquí.Ahora, observando a través del estereoscopio, puede verse que el ganglio abdominal está cortado por el centro y que ahora se han realizado dos cortes en la parte frontal y posterior del grupo de células posteriores. Luego, utilizamos pinzas para encontrar una abertura en el tejido conectivo y empujamos suavemente hacia abajo la vaina de tejido conectivo que rodea el grupo de células en bolsa. Retire el tejido conectivo del grupo en una sola pieza, si es posible, utilizando las tijeras de disección.Pero tenga cuidado de no dañar el grupo de células de la bolsa. Con un medio introducido en la punta doblada, transfiera suavemente el grupo de células de la bolsa a otro recipiente de trabajo. Agite suavemente el grupo de células de la bolsa con una punta amarilla para separar células individuales del grupo.Para hacer esto, introduzca el cúmulo en la punta de la pipeta y expúlselo sin generar burbujas de aire. Transfiera las células viables del cúmulo a placas que contengan cubreobjetos recubiertos con poli. Las células muertas aparecen negras en el centro, mientras que las células viables son blancas.Es importante colocar las células en el centro del cubreobjetos para la microscopía y eliminar cualquier detrito celular y células muertas lo antes posible. Al recoger el material no deseado o soplarlo, las células sanas se adherirán rápidamente a la placa de polilisina. Aproximadamente de 15 a 25 células por cada cubreobjetos.Una vez que todas las células del primer grupo han sido posicionadas, se elimina el tejido conectivo del segundo grupo y se continúa con el mismo procedimiento de siembra celular. Después de finalizar todas las placas, déjelas reposar a temperatura ambiente sobre la bancada durante al menos dos horas para permitir que las células se adhieran adecuadamente, evitando cualquier vibración. Luego, coloque los recipientes sobre una bandeja de espuma de poliestireno o plástica y transfiéralos a una incubadora a 14 grados antes de su uso posterior.Normalmente, observamos los conos de crecimiento de plegia uno o dos días después de sembrarlos. Para la imagenología en condiciones de vida de la dinámica de los conos de crecimiento neuronal, preparamos una pequeña cámara de imagen compuesta por dos cubreobjetos separados por espaciadores de plástico. El cubreobjetos inferior tiene las neuronas adheridas a él.El cubreobjetos superior se corta más corto con un bolígrafo de diamante para permitir un intercambio fácil del medio. Sobre la platina del microscopio, el sándwich de cubreobjetos se coloca luego en un soporte hecho a medida para montarlo en el microscopio. Se utiliza grasa de alto vacío para sujetar los elementos de la cámara sin que se escape el medio. Usando una pequeña jeringa, se aplica grasa de alto vacío sobre el cubreobjetos superior y luego utilizamos pinzas para colocar los espaciadores y aplicar algo de grasa de vacío en la parte superior.Luego tomamos todo el conjunto, lo giramos y presionamos suavemente sobre la lámina cubreobjetos con las células aún sumergidas en la placa. Utilice hisopos para alinear las láminas cubreobjetos y presione la lámina superior sin romperla. A continuación, retiremos cuidadosamente el ensamblaje de la placa, limpiamos cualquier medio adicional y lo colocamos sobre la base del soporte.Coloque el preparado en el portaobjetos sin romper el cubreobjetos mediante presión. Limpie ambos cubreobjetos con limpiador de vidrio sparkle sobre un aplicador de algodón y preferimos usar sparkle porque deja menos rayas en el vidrio. Limpie el cubreobjetos con un movimiento circular desde el centro y siga inmediatamente con un aplicador de algodón seco para evitar rayas.El vidrio limpio y cubierto es muy importante para obtener imágenes de alta calidad, especialmente con óptica DIC. Las culturas neuronales de células Plegia son culturas de baja densidad, por lo que será muy útil que su microscopio tenga funciones de posicionamiento de la platina para cambiar fácilmente entre diferentes células. Ahora estamos listos para observar la morfología y la motilidad del cono de crecimiento.Visualizamos el crecimiento en morfología y motilidad mediante imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) con alta resolución y captura de lapso de tiempo. La imagen DIC es útil para esta aplicación porque proporciona una vista de la superficie de la estructura del cono de crecimiento en esta película de lapso de tiempo DIC 60X. Puede observarse claramente los tres dominios de un cono de crecimiento típico.El dominio periférico que está compuesto por afect enrich la mela podia y op podia. La zona de transición que se caracteriza por actividad de arrugamiento y el dominio central que contiene principalmente microtúbulos y orgánulos. Para estudiar los mecanismos de dirección del crecimiento, hemos desarrollado el ensayo de interacción con perlas restringidas (RBI) en este ensayo.Microesferas recubiertas con proteínas artesanales se utilizan para imitar sustratos diana celulares. La esfera se coloca sobre el dominio periférico del cono de crecimiento con una micropipeta en la película de lapso de tiempo en contraste diferencial. Puede observarse el efecto y flujo retrógrado mediante ondas que se desplazan en dirección retrógrada en el dominio central.Los orgánulos se mueven sobre microtúbulos. Después de un período inicial durante el cual no ocurren cambios significativos, se puede observar un repentino movimiento hacia adelante del límite del dominio central en dirección al microesfera retenida. Un crecimiento acompañante del borde delantero y un aumento de la tensión, además, provocan una atenuación del flujo y una extensión de los microtúbulos, que se puede observar específicamente a lo largo del eje de interacción con la microesfera.Para analizar la dinámica del citoesqueleto en los conos de crecimiento, utilizamos microscopía de manchas fluorescentes. Inyectamos microscópicamente sondas de tubulina y actina marcadas con fluorescencia en el cuerpo celular neuronal y tomamos películas de lapsos de tiempo. De los movimientos dinámicos del citoesqueleto, el afectado mostrado en rojo se ensambla a lo largo del borde anterior, es traslocado hacia atrás por el flujo retrógrado y reciclado en la zona de transición.Los microtúbulos dinámicos mostrados en verde exploran el crecimiento en la periferia mediante una combinación de comportamientos de ensamblaje y traslocación. La baja cantidad de marcado da como resultado un patrón moteado, lo que nos permite analizar cuantitativamente los diversos parámetros de la dinámica del citoesqueleto. Hemos mostrado cómo realizar la disección, el cultivo y el análisis de imágenes de células nerviosas si desea obtener imágenes de alta resolución de los conos de crecimiento neuronales.Este es realmente el sistema que debe utilizarse debido al gran tamaño de los conos de crecimiento, las regiones citoplasmáticas bien definidas y el citoesqueleto bien descrito. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

neuronal-cell-cultures-from-aplysia-for-high-resolution-imaging

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Preparación de Aplysia Sensorio-motor culturas de células neuronales

En este vídeo, se demuestra la visualización de la translocación de la PKC en células vivas mediante PKC marcado con fluorescencia.

En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia

Se demuestra cómo los cambios en la concentración de calcio libre intracelular y la eficacia sináptica puede controlarse simultáneamente en una preparación de...

Seguimiento de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el molusco<em&gt; Aplysia</em

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

Este video muestra una evaluación in vitro del colapso del cono de crecimiento neuronal por agregados de β de amiloide (Aβ). El tratamiento de las neuronas con agregados Aβ provoca la desestabilización del citoesqueleto, lo que provoca el colapso de los conos de crecimiento en la punta de los axones. Las células tratadas se comparan con las células de control para evaluar el grado de colapso del cono de crecimiento.

Evaluación in vitro de la β amiloide agregada en el colapso del cono de crecimiento neuronal

Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar...

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

El caracol marino Aplysia californica ha sido ampliamente utilizado como modelo neurobiológico para los estudios sobre bases celulares y moleculares del comportamiento. Aquí se describe una metodología para explorar el sistema nervioso de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de neuronas individuales de circuitos neuronales identificados.

Aplysia Preparación De Ganglios Para Análisis Electrofisiológicos Y Moleculares De Neuronas Individuales

Este procedimiento describe cómo iniciar, extender y conectar rápidamente neuritas organizadas en cámaras microfluídicas usando perlas revestidas con poli-D-lisina fijadas a micropipetas que guían la elongación de las neuritas.

Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional

Aquí, se describe un protocolo para estudiar cuantitativamente el montaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones (AIS) de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS pre-montado debido a la ausencia de una anquiria gigante-G.

Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón

Este protocolo demuestra un método sencillo y robusto para estudiar el crecimiento del axón in situ y la dinámica del cono de crecimiento. Describe cómo preparar cortes cerebrales agudos fisiológicamente relevantes ex vivo y proporciona una tubería de análisis fácil de usar.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

Para avanzar, los conos de crecimiento deben ejercer fuerzas de tracción contra el entorno externo. La generación de fuerzas de tracción depende de la dinámica de la actina y el acoplamiento del embrague. El presente estudio describe métodos para analizar la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y las fuerzas de tracción para el avance del cono de crecimiento.

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

Aprende a cultivar neuronas de bag cell de Aplysia californica para obtener conos de crecimiento grandes y realizar imágenes de alta resolución de su motilidad y dinámica del citoesqueleto.

Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento

Explorar más videos