Name: Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprende a cuantificar anticuerpos autorreactivos en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental mediante un protocolo ELISA flexible y económico. Este método permite estudiar respuestas de células B y comprender mejor la esclerosis múltiple.

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Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R03NS131908) y el Departamento de Defensa a través del Programa de Investigación de Esclerosis Múltiple bajo el Premio No. W81XWH-22-1-0517. Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este estudio también contó con el apoyo de fondos iniciales de la Universidad de Carolina del Este.

Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con las pautas experimentales aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Este (IACUC). En este estudio se utilizaron ratones hembra de tipo salvaje C57BL/6J de entre 8 y 10 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). La EAE fue inducida a partir de los reportes previamente publicados 12,13,14.
1. Colección de sérums
<ol><li>Eutanasia del ratón experimental mediante asfixia por CO2 o sobredosis de isoflurano en el momento requerido (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) después de inducir EAE mediante inmunización MOG35-55. NOTA: El número total de ratones y los puntos de tiempo para la recolección de suero pueden variar según el experimento específico.</li>
	<li>Después de que se confirme la ausencia de signos vitales mediante un pellizco en la punta del pie o la cola, coloque el ratón en posición de decúbito dorsal en una bandeja de disección y fije las extremidades en su posición con alfileres o cinta adhesiva. Oriente el cuerpo del ratón hacia la fuente de luz LED (ver Tabla de materiales) para iluminar el tórax del animal.</li>
	<li>Rocíe el pelaje del ratón con etanol al 70% y haga una incisión en la línea media de 3-4 cm a lo largo del abdomen desde la pelvis hasta el xifoides con las tijeras de disector, teniendo cuidado de evitar cualquier órgano y vasos principales (Figura 1A-C). Para facilitar el procedimiento, use las pinzas para agarrar la piel sobre la apófisis xifoides.</li>
	<li>Corte el diafragma lateralmente y luego corte la caja torácica anteriormente en ambos bordes laterales con las tijeras de resorte, deteniéndose antes de llegar al esternón en la línea media (Figura 1D). Dobla la solapa de la costilla que se creó sobre la cabeza del ratón para exponer el corazón (Figura 1E). NOTA: Se debe evitar cortar el esternón, ya que esto dañará las arterias torácicas principales que se encuentran adyacentes al hueso y reducirá el volumen de sangre que se puede recolectar.</li>
	<li>Inserte una aguja de 25 G conectada a una jeringa de 1 ml en el ventrículo izquierdo y recoja la sangre tirando suavemente del émbolo hacia atrás (Figura 1F). Para facilitar la punción de la aguja, sujete suavemente el corazón contra un par de fórceps. NOTA: Si la sangre no aparece inmediatamente en la jeringa, la aguja debe girarse lentamente y se debe probar un ángulo diferente. Sin embargo, se deben hacer esfuerzos para colocar la aguja correctamente en el primer intento para evitar crear orificios innecesarios en el corazón donde la sangre pueda filtrarse.</li>
	<li>Transfiera la sangre a un tubo estéril de 1,5 ml y deje que coagule durante 30 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el coágulo por centrifugación a 2000 × g durante 20 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante, que representa la fracción sérica, y almacene las alícuotas de un solo uso en tubos criogénicos a -80 °C para futuras pruebas.</li>
</ol>2. Ensayo ELISA
<ol><li>Vuelva a suspender el péptido MOG35-55 liofilizado (ver Tabla de Materiales) en agua para obtener un stock de 10 mg/mL. Antes de comenzar el experimento, diluya el stock a 10 μg/mL en tampón de recubrimiento (consulte la Tabla de materiales) y pipetee 100 μL/pocillo de la solución final en una placa de 96 pocillos. Selle la placa con una película adhesiva para evitar la evaporación e incube la placa durante la noche a 4 °C. NOTA: Se deben calcular al menos 2 pocillos para cada muestra y también se deben incluir 2 pocillos adicionales para un control en blanco.</li>
	<li>Paralelamente, cubra el mismo número de pocillos con 100 μL/pocillo de albúmina sérica bovina (BSA) disuelta en el tampón de recubrimiento a una concentración de 10 μg/mL. Estos pozos adicionales servirán como controles de fondo. NOTA: Se recomienda recubrir con BSA los pozos de control ya que los tampones de recubrimiento y bloqueo tienen diferentes composiciones. Tenga en cuenta que otros péptidos encefalogénicos (como PLP139-151 o MBP84-104) podrían usarse como antígenos irrelevantes en alternativa a BSA.</li>
	<li>Al día siguiente, lavar la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de solución salina tampón fosfato suplementado con Tween 20 al 0,05% (PBS-T). A continuación, añadir 100 μL/pocillo de una solución de bloqueo compuesta por BSA al 3% en PBS (sin Tween 20) e incubar la placa sellada durante 1 h a 37 °C en un horno de hibridación.</li>
	<li>Lave la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Diluir cada muestra de suero 1:100 en solución de bloqueo y añadir 100 μL/pocillo a los pocillos recubiertos de MOG35-55 y BSA. Agregue el mismo volumen de solución de bloqueo a los pozos designados como espacios en blanco. Incubar la placa sellada durante 2 h a temperatura ambiente, con agitación constante (250 rpm).</li>
	<li>Lave la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Diluir el anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:2000, ver Tabla de Materiales) en una solución hecha de BSA al 0,2% en PBS-T y añadir 100 μL/pocillo a todos los pocillos. Incubar la placa sellada durante 1 h a temperatura ambiente, con agitación constante (250 rpm).</li>
	<li>Lave la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Agregue 100 μL/pocillo de sustrato de tetrametilbencidina (TMB) de 3,3',5,5' (ver Tabla de Materiales) a todos los pocillos e incube en la oscuridad durante 1-5 min, monitoreando el desarrollo de un color azul.<ol><li>Detenga la reacción añadiendo 100 μL/pocillo de solución de parada (consulte la Tabla de materiales) y mida la densidad óptica (OD) en cada pocillo utilizando un lector de placas configurado a una longitud de onda de 450 nm. NOTA: El sustrato de TMB debe equilibrarse a temperatura ambiente durante 30-60 minutos antes de añadirlo a los pocillos.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis de datos
<ol><li>Rellene una hoja de cálculo de Excel con los valores OD leídos de la placa. Promedie los valores de OD obtenidos de pocillos duplicados (tanto recubiertos con MOG35-55 como con BSA) para cada muestra.</li>
	<li>Para cada muestra, reste el valor medio de los pocillos recubiertos de BSA del de los pocillos recubiertos de MOG35-55. Los valores de fondo corregidos resultantes serán proporcionales a la concentración de anticuerpos anti-MOG35-55 en las diferentes muestras de suero. NOTA: Los pozos en blanco deben dar como resultado valores corregidos alrededor de 0.</li>
	<li>Aplique una prueba estadística no paramétrica, como la prueba U de Mann-Whitney, para comparar los valores promedio de OD entre dos condiciones experimentales. Incluya al menos 3 muestras independientes para cada condición.</li>
</ol>

Investigación de la respuesta humoral en la desmielinización autoinmune

<ol><li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li>
<li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li>
<li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118(2021).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li>
<li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li>
<li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+multiple+sclerosis%3A+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li>
<li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li>
<li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li>
<li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li>
<li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li>
<li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li>
<li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li>
<li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297(2020).</li>
<li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Aquí, se informó de un protocolo simple y eficiente basado en ELISA para cuantificar con precisión la respuesta humoral en un modelo animal relevante de patología de EM. Este método se ha empleado recientemente para describir el nuevo papel de la proteína ataxina-1 en el control de los niveles séricos de autoanticuerpos en el paradigma MOG35-55/C57BL6J EAE12. En este sentido, se deben tener en cuenta una serie de factores para obtener resultados consistentes y biológicamente significativos con est...

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por la infiltración focal de células inmunitarias en el parénquima cerebral, la ruptura de las vainas de mielina que envuelven los axones, la activación de la glía y la pérdida neuronal1. Además del papel bien establecido de las células T patógenas, múltiples líneas de evidencia han destacado la participación de las células B en la mediación de la respuesta autoinmune contra el SNC. Las células B experimentan una expansión clonal en el cerebro de la EM y se han detectado anticuerpos contra los componentes de la mielina dentro de las lesiones desmielinizadas 2,3. Recientemente se ha documentado la activación selectiva de las células B periféricas al inicio de la enfermedad, lo que sugiere un papel putativo de este compartimento de células inmunitarias también en el inicio de la enfermedad4. El éxito de las terapias de agotamiento de linfocitos B, como los anticuerpos monoclonales anti-CD20, corrobora aún más la conexión mecanicista entre el funcionamiento aberrante de los linfocitos B y la desmielinización autoinmune 5,6. Desde un punto de vista molecular, las células B pueden contribuir a la enfermedad a través de la presentación de autoantígenos, la secreción de citocinas proinflamatorias y la producción de anticuerpos autorreactivos.
Se han desarrollado múltiples modelos animales para recapitular las características específicas del complejo fenotipo de la EM. Entre ellos, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el paradigma in vivo más utilizado y se basa en la inmunización de animales de experimentación con péptidos cortos derivados de proteínas de mielina como la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) y la proteína básica de mielina (MBP)7. Los animales inmunizados con EAE desarrollan una patología desmielinizante que se asemeja a la EM en muchos aspectos, incluyendo una respuesta humoral robusta frente al péptido encefalogénico8. Por este motivo, los estudios de EAE han sido fundamentales para diseccionar la función de las células B y los autoanticuerpos en el contexto de la enfermedad. Por ejemplo, se demostró que los anticuerpos específicos de MOG aislados de pacientes con EM pueden agravar el curso clínico en modelos EAE9. En particular, se demostró que el residuo de prolina en la posición 42 en el MOG humano es crítico para determinar la patogenicidad de los autoanticuerpos10. Más recientemente, se ha descubierto que los autoanticuerpos específicos de MOG promueven la enfermedad no solo al mediar la pérdida de mielina, sino también al estimular la reactivación de las células T autorreactivas dentro del SNC11. 
Teniendo en cuenta la importancia de las respuestas de anticuerpos en la autoinmunidad del SNC, este artículo presenta un protocolo basado en ELISA para medir de manera eficiente los niveles séricos de anticuerpos autorreactivos en ratones C57BL/6J EAE inmunizados con el péptido MOG35-55. En la primera parte del protocolo se describirá el método de recogida de suero mediante punción intracardíaca. Posteriormente, se detallarán los procedimientos para configurar el ensayo ELISA y adquirir los datos. Por último, se discutirá el análisis e interpretación de los datos.

<table><tbody><tr><td>Jeringas de 1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>agujas de 25 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB)</td><td>Thermo Fisher</td><td>N301</td><td>Store a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Sellos adhesivos</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Almacenar en 4 & deg; C</td></tr><tr><td>C57BL/6J ratones hembra</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Se deben utilizar animales de entre 8 y 10 semanas de edad para los experimentos EAE</td></tr><tr><td>Tubos criogénicos</td><td>Fisher</td><td>10-500-25</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de disección</td><td>Fisher</td><td>S111022</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disector</td><td>Fine Science Tools</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de recubrimiento ELISA</td><td>BioLegend</td><td>421701</td><td>Tienda en 4&deg; C</td></tr><tr><td>Software Excel</td><td>Hoja de cálculo</td><td>de análisis de Microsoft</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón IgG, Anuncios humanos-HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>1030-05</td><td>Tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fuente de luz LED</td><td>Fisher AMPSILED21</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Fisher</td><td>14-377-575&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de biología molecular</td><td>Corning</td><td>46-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Mouse MOG35-55 péptido</td><td>EZBiolab</td><td>cp7203</td><td>Almacenar a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Axygen</td><td>AP-12-200-P</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de muelle Noyes</td><td>Fine Science Tools</td><td>15011-12</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp Placas de 96 pocillos</td><td>BioLegend</td><td>423501</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Fisher</td><td>88-861-023</td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td>VWR</td><td>445-0024</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino (PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa refrigerada</td><td>Thermo Fisher</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>Stop solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>N600</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad que recapitula el trastorno autoinmune esclerosis múltiple (EM) a nivel histopatológico y molecular. La EAE se induce mediante la inmunización de animales de experimentación mediante inyección subcutánea de péptidos de mielina corta junto con adyuvantes específicos para impulsar la respuesta inmunitaria. Al igual que los humanos, los ratones EAE desarrollan lesiones desmielinizantes, infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC), activación de la glía y lesión neuronal. Un cuerpo consistente de evidencia también apoya un papel mecanicista para la disfunción de las células B en la etiología tanto de la EM como de la EAE. Las células B pueden servir como células presentadoras de antígenos, así como una fuente principal de citocinas proinflamatorias y autoanticuerpos. En la EAE, se generan anticuerpos contra los péptidos de mielina que se emplearon para inducir la enfermedad. Se ha demostrado que estos autoanticuerpos median la pérdida de mielina o la reactivación patogénica de las células T en el SNC. Este artículo describe un protocolo eficiente basado en ELISA para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones C57BL/6J inmunizados con el péptido glicoproteína de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55). El método propuesto sirve como una poderosa herramienta para investigar la especificidad y magnitud de la respuesta humoral aberrante en el contexto de la desmielinización autoinmune.

Para demostrar la robustez del presente ensayo ELISA, el método se probó en muestras de suero aisladas de una cohorte de ratones hembra C57BL/6J a los 20 días después de la inmunización (dpi) con 100 μg del péptido MOG35-55 en adyuvante de Freund completo (CFA) siguiendo un protocolo de inducción EAE validado 12,13,14. Los animales también recibieron 400 ng de toxina para la tos ferina los días 0 y 2. Las muestras de suero de an...

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

Por lo tanto, el enfoque de nuestro laboratorio es comprender las bases moleculares de la esclerosis múltiple, una enfermedad inmune del sistema nervioso central que se caracteriza por desmielinización, neuroinflamación y lesión axonal. Por lo tanto, este protocolo representa una alternativa económica y flexible a los kits comerciales. Nuestro se puede ajustar fácilmente para probar las respuestas de los anticuerpos de las células B contra diferentes péptidos del EEA.Mi laboratorio se dedica a comprender mejor la conexión entre la neuroinflamación y la neurodegeneración en enfermedades neurológicas crónicas como la esclerosis múltiple.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Ciertas cepas de ratón son capaces de resistir la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) con proteína básica de mielina. Aquí se describe es un protocolo de inmunización simple que invierte la falta de respuesta e induce la enfermedad paralítica en varios típicas manchas de EAE de ratón resistentes.

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

El video demuestra la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón mediante la inyección de una combinación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina y Mycobacterium tuberculosis inactivada. El modelo permite a los investigadores estudiar los mecanismos de la enfermedad y probar intervenciones terapéuticas.

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

Este video muestra el método para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inyectando péptidos derivados de mielina con un adyuvante para activar las células T autorreactivas, que migran al cerebro. La toxina de la tos ferina se administra para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que estas células T y otras células inmunitarias ingresen al cerebro. Estas células inmunitarias causan desmielinización, lo que conduce a una transmisión nerviosa...

Generación de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Los niveles elevados de proteína de líquido cefalorraquídeo pueden ser el resultado de la difusión de proteína plasmática a través de una barrera hematoencefálica alterada o de la síntesis intratecal. En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado que ayuda a discriminar ambos casos y proporciona mediciones cuantitativas de proteínas sintetizadas intratecalmente.

Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como modelo animal de esclerosis múltiple. En este artículo se describe un enfoque para la puntuación de la inflamación, desmielinización y lesión axonal de la médula espinal en EAE. Además, se presenta un método para cuantificar los niveles de luz de neurofilamentos solubles en el suero de ratones, lo que facilita la evaluación de la lesión axonal en ratones vivos.

Puntuación de la inflamación del sistema nervioso central, la desmielinización y la lesión axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental

La encefalomielitis autoinmune experimental es uno de los modelos murinos de esclerosis múltiple más utilizados. En el protocolo actual, los ratones C57BL/6J de ambos sexos son inmunizados con el péptido glicoproteico de los oligodendrocitos de mielina, lo que resulta principalmente en paresia ascendente de la cola y las extremidades. Aquí discutimos el protocolo de inducción y evaluación de EAE.

Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG35-55

Aprende a cuantificar anticuerpos autorreactivos en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental mediante un protocolo ELISA flexible y económico. Este método permite estudiar respuestas de células B y comprender mejor la esclerosis múltiple.

Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

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