Name: Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprenda a aislar células estromales de hueso, médula ósea y timo murino y timo humano. Estos protocolos optimizados para multiómica de célula única facilitan investigaciones avanzadas sobre hematopoyesis y regulación celular.

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Contamos con el apoyo de la asistencia técnica experta del centro de citometría de flujo HSCI-CRM del Hospital General de Massachusetts y del centro Bauer Core de la Universidad de Harvard. T.K y K.G contaron con el apoyo del Consejo Sueco de Investigación y C.M. de la Fundación Alemana de Investigación. Agradecemos a Sergey Isaev e I-Hsiu Lee por su ayuda en el análisis de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula.

Optimización del aislamiento de células estromales del timo y la médula ósea

<ol><li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).</li>
<li>Severe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+changes+in+bone+marrow+stromal+cell+populations+revealed+through+single-cell+protein+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).</li>
<li>Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2020+view+of+thymus+stromal+cells+in+t+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development.</a> J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).</li>
<li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+t+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), (2020).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Lischetti, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+thresholding+and+tissue+dissociation+optimization+for+cite-seq+identifies+differential+surface+protein+abundance+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma.</a> Commun Biol. 6 (1), 830(2023).</li>
<li>Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+perivascular+cells+maintain+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells.</a> Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+sources+of+pleiotrophin+control+hematopoietic+stem+cell+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).</li>
<li>Zhou, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes+promote+the+regeneration+of+stem+cells+and+haematopoiesis+by+secreting+scf%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf.</a> Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).</li>
<li>Steinmann, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+human+thymus+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Pathol%22%5BJournal%5D)">Changes in the human thymus during aging.</a> Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).</li>
<li>Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involution+of+the+ageing+human+thymic+epithelium+is+independent+of+puberty.+A+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study.</a> Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).</li>
<li>Ambrosi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+accumulation+in+the+bone+marrow+during+obesity+and+aging+impairs+stem+cell-based+hematopoietic+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).</li>
<li>Ho, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niches+promotes+myeloid+cell+expansion+during+premature+or+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).</li>
<li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myeloid+dendritic+cells+and+epithelial+cells+from+human+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus.</a> J Vis Exp. (79), e50951(2013).</li>
<li>Gustafsson, K., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+thymus+stromal+cells+from+human+and+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue.</a> Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).</li>
<li>Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html">Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html</a> (2023).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> J Vis Exp. (110), e53936(2016).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+beta-catenin+mutation+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li>
<li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+niche-specific+expression+of+cxcl12+controls+quiescence+of+treatment-resistant+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).</li>
<li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+aml%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li>
<li>O'flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+rna-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biol. 20 (1), 210(2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biol. 19 (1), 224(2018).</li>
</ol>

D.T.S. es director y accionista de Agios Therapeutics y Editas Medicines; fundador, director, accionista y miembro del consejo asesor científico de Magenta Therapeutics y LifeVault Bio, accionista y fundador de Fate Therapeutics y Garuda Therapeutics, y director, fundador y accionista de Clear Creek Bio, consultor de FOG Pharma, Inzen Therapeutics y VCanBio, y receptor de fondos de investigación patrocinados por Sumitomo Dianippon. D.T.S y K.G son inventores de US20220143099A1 patentes.

Las células estromales de los órganos hematopoyéticos son fundamentales para la producción normal de sangre y las perturbaciones del estroma hematopoyético pueden dar lugar a graves deficiencias en el mantenimiento hematopoyético y en la respuesta al estrés 9,23,24. El conocimiento de las células estromales hematopoyéticas es esencial para la comprensión de las enfermedades hematológicas 7,9,10,24 y para la capacidad de desarrollar terapias para combatirlas25,26. Sin embargo, separar de forma reproducible el estroma hematopoyético del parénquima es un reto, especialmente con la llegada de la multiómica unicelular que requiere preparaciones de muestras de alta calidad al tiempo que maximiza el rendimiento y la variedad de las células estromales. Los protocolos descritos aquí se han optimizado para ser compatibles con la mayoría de las aplicaciones multiómicas posteriores, al tiempo que se enfrentan a los desafíos de aislar células estromales hematopoyéticas 1,2,19.
La primera cuestión a tener en cuenta para el aislamiento de las células estromales hematopoyéticas son las condiciones de disociación. La disociación óptima es fundamental para liberar las células del estroma del tejido y reflejar la heterogeneidad completa del compartimento del estroma 1,2. La elección de la mezcla de disociación correcta depende del alcance experimental y de los protocolos posteriores. Recomendamos preparar las mezclas de disociación lo más frescas posible y mantenerlas en hielo hasta su uso. Algunos componentes son difíciles de disolver, como la dispasa, y pueden requerir más tiempo para la mezcla de la pipeta. No se recomienda el vórtice, ya que puede alterar la conformación nativa de las enzimas de la digestión, lo que en última instancia conduce a su inactivación. Es importante destacar que el EDTA inhibirá la actividad enzimática y debe evitarse durante los pasos de digestión activa, pero puede emplearse para detener la reacción si el tampón que contiene la enzima no se puede eliminar rápidamente. Además de la mezcla de enzimas en sí, dos puntos son críticos para una disociación eficiente del tejido, (1) trituración y corte minuciosos para aumentar el área de superficie y, (2) tiempo de incubación suficiente con las enzimas de digestión. El tejido tímico humano es, por ejemplo, significativamente más difícil de disociar que el tejido murino y, por lo tanto, los tiempos de digestión deben ser más largos. Si no se realiza un ajuste para el tejido humano, el rendimiento estromal y la variedad celular disminuirán (Figura 2A). Las enzimas de disociación requieren una temperatura óptima de 37 °C, lo que inevitablemente influye en la expresión génica27. Aunque la disociación en frío o a temperaturas más bajas sería deseable para conservar los estados celulares, actualmente no existen comercialmente combinaciones de enzimas de disociación activas en frío adecuadas para el hueso y la médula ósea. Para cualquier tejido que requiera digestión, la heterogeneidad y el porcentaje de contribución adquirido de los diferentes tipos de células cambiarán invariablemente con el tiempo de digestión, la composición del cóctel de enzimas y el procesamiento. Aguas abajo de estos pasos iniciales, la heterogeneidad y la representación se limitarán aún más por los pasos de filtración, como el tamaño de las boquillas durante la clasificación y la captura de tipos de células difíciles (por ejemplo, adipocitos del estroma) y los diámetros de los canales de los dispositivos fluídicos. Por lo tanto, al comparar conjuntos de datos, debemos tener en cuenta que estas diferencias en los protocolos pueden afectar la representación de las subpoblaciones. De ello se deduce lógicamente que debemos estar atentos a mantener los mismos pasos de procesamiento al medir el impacto de las perturbaciones en los sistemas estromales.
Si bien el costo de la secuenciación ha disminuido y está disminuyendo, las tecnologías de células individuales a menudo están limitadas por el número de células que se pueden analizar. Para optimizar la capacidad de cada kit de reactivos, se empleó la depleción magnética de células hematopoyéticas siempre que fue posible. Esto permite evitar un gran número de células contaminantes, que son mucho más numerosas que el estroma, tanto en la médula ósea como en las fracciones de muestras tímicas. Sin embargo, si el material de partida es limitado, como en el caso del tejido tímico post-trasplante, el aumento de la pérdida inespecífica de células en el que invariablemente incurren las estrategias de depleción magnética puede hacer que esto no sea aconsejable. Además, durante la preparación y digestión de los tejidos, la trituración, el corte y la liberación enzimática de los componentes de la matriz extracelular generan una gran cantidad de residuos. Este tipo de contaminante, si se deja en la muestra para su análisis, puede causar problemas de obstrucción en el procesamiento posterior, causar pozos negativos para la clasificación de índice de celda única e inflar mucho los porcentajes de la puerta principal en el análisis. La tinción con calceína se utilizó para dar positivo a las células/células vivas. La calceína viene en diferentes colores, lo que la hace altamente adaptable a su matriz de tinción. Cuando trabaje con calceína, tenga cuidado de no someter el tinte a ciclos repetidos de congelación y descongelación (es decir, siempre prepárelo fresco y manténgalo a temperatura ambiente después de disolverlo).
La capacidad de multiplexar muestras basadas en anticuerpos codificados con códigos de barras con oligonucleótidos de ADN28 permite una mayor utilidad de las reacciones de secuenciación de células individuales en plataformas como 10x Genomics. Los anticuerpos hashtagping diseñados para la multiplexación de muestras vienen con diferentes objetivos para las moléculas de la superficie celular o la membrana nuclear y especificidad tanto para ratones como para humanos. Si bien el sistema de hashtags celulares se ha utilizado con éxito para múltiples tejidos, los experimentos que combinan mezclas de enzimas de digestión con el uso posterior de hashtags pueden conducir a una recuperación drásticamente reducida. Hemos intentado incluir pasos de lavado adicionales después de la disociación y agregar EDTA para inhibir la actividad de las enzimas de la digestión. Sin embargo, incluso con estos pasos, se espera una menor identificación de hashtags que las células hematopoyéticas. Se descubrió que con los protocolos de digestión enzimática, las tasas de captura de hashtags estaban entre el 30% y el 70%. Esto ocurre a pesar de que el mismo clon de anticuerpo con un conjugado de fluorocromo marcó >90% de las células estromales de la misma población. Cualquier diseño experimental que combine la digestión enzimática del tejido con el hashtagging debe ser pilotado y se debe tener precaución para garantizar la inhibición enzimática.

En el adulto sano, la producción de novo de células sanguíneas se produce en la médula ósea y el timo. Las células estromales en estos sitios son esenciales para el mantenimiento de la hematopoyesis, pero el estroma constituye menos del 1% del tejido 1,2,3,4. Por lo tanto, la obtención de aislados puros de estroma portador de hematopoyesis constituye un desafío importante, particularmente para la multiómica unicelular que requiere un procesamiento oportuno para obtener muestras de alta calidad. Los componentes de diferentes cócteles de digestión pueden interferir con ciertos pasos en el análisis multiómico 5,6. Los protocolos presentados aquí detallan el aislamiento de una amplia variedad de células estromales de la médula ósea y los tejidos tímicos.
Las perturbaciones de los constituyentes estromales tanto en la médula ósea como en el timo dan lugar a una profunda alteración en el desarrollo de las células sanguíneas y pueden dar lugar a neoplasias malignas 7,8,9. El estroma portador de la hematopoyesis se daña después del condicionamiento citotóxico y el trasplante de médula ósea, lo que resulta en una reducción de la secreción de citocinas y factores de crecimiento que sostienen las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC)2,10,11. Además, el envejecimiento afecta a las células estromales de la médula ósea y el timo, lo que probablemente contribuya al envejecimiento de los fenotipos hematopoyéticos. El timo es el primer órgano que sufre una involución extensa asociada a la edad. La grasa y el tejido fibrótico comienzan a reemplazar al estroma de soporte de las células T desde el inicio de la pubertad12,13. En la médula ósea, el contenido de adipocitos aumenta con la edad y los nichos vascular y endosteal se remodelan significativamente 14,15,16.
Para permitir el estudio del estroma de soporte de hematopoyesis en múltiples estados de estrés y en el caso del timo tanto de tejido humano como murino, hemos optimizado los protocolos de digestión publicados anteriormente 1,2,8,17,18. Estos protocolos garantizan un aislamiento eficiente y reproducible de las células, y son compatibles con la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y otros tipos de multiómicas.

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>7AAD (7-aminoactinomicina D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de Linaje Anti-Humano 3-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>643510</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 ratones</td><td>Jackson</td><td>664</td><td>Machos o hembras, 8-12 semanas de edad</td></tr><tr><td>Calcein&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>65-0853-78</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Corning Coladores de células estériles, blanco, tamaño de malla: 70 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Solución Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90083</td><td>&nbsp; 2500 U/mL</td></tr><tr><td>Estreptavidina de ratón Easysep RapidSpheres Kit de aislamiento</td><td>StemCell Technologies</td><td>19860</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>A31605-01</td><td>Qualified One Shot</td></tr><tr><td>Human Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM&nbsp;</td><td>Millipore Sigma 5401127001</td><td></td><td>grado de investigación</td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Gibco</td><td>12350</td><td></td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD235a-BV77</td><td>BD Biosciences</td><td>740785</td><td></td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD31-PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>303130</td><td></td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD45-BV77</td><td>Biolegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD4-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>562658</td><td></td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD66b-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD8-APC/Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557760</td><td></td></tr><tr><td>Ratón antihumano EpCam-BV421</td><td>Biolegend</td><td>324220</td><td></td></tr><tr><td>Protector Inhibidor de ARNasa</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD105-PE /dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120424</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD11b-Biotina</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD140a-APC</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-1401-81</td><td></td></tr><tr><td>Rata Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD31-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612802</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD31-BV421</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD3-Biotina</td><td>Biolegend</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD45.2-Biotina</td><td>Biolegend</td><td>109804</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD45R/B220-Biotina</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD51-PE</td><td>Biolegend</td><td>104106</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón EpCam-BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563134</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Ly-6A/E(Sca-1)-AF700</td><td>Biolegend</td><td>108142</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotina</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Ter119-Biotina</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Ter119-PE</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Ter119-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116222</td><td></td></tr><tr><td>Stemxyme&nbsp;</td><td>LS004107</td><td></td> <td>Bioquímica de Worthington</td></tr></tbody></table>

aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

La secuenciación unicelular ha permitido el mapeo de poblaciones celulares heterogéneas en el estroma de los órganos hematopoyéticos. Estas metodologías proporcionan una lente a través de la cual estudiar la heterogeneidad no resuelta previamente en estado estacionario, así como los cambios en la representación del tipo de célula inducidos por tensiones extrínsecas o durante el envejecimiento. Aquí, presentamos protocolos paso a paso para el aislamiento de poblaciones de células estromales de alta calidad de timo murino y humano, así como de hueso murino y médula ósea. Las celdas aisladas a través de estos protocolos son adecuadas para generar conjuntos de datos multiómicos de una sola celda de alta calidad. Aquí se analizan los impactos de la digestión de la muestra, el agotamiento del linaje hematopoyético, el análisis/clasificación FACS y cómo estos factores influyen en la compatibilidad con la secuenciación de una sola célula. Con ejemplos de perfiles FACS que indican una disociación exitosa e ineficiente y rendimientos de células estromales aguas abajo en el análisis posterior a la secuenciación, se proporcionan indicadores reconocibles para los usuarios. Tener en cuenta los requisitos específicos de las células estromales es crucial para obtener resultados reproducibles y de alta calidad que puedan avanzar en el conocimiento en el campo.

Estos protocolos producen variedades de células estromales reproducibles del timo y la médula ósea adecuadas para el análisis de citometría de flujo, así como multiómicas de una sola célula, como la secuenciación de SCRNA. El tejido tímico murino experimenta una remodelación significativa en respuesta a factores estresantes, como el condicionamiento citotóxico que precede al trasplante de médula ósea o el proceso natural de envejecimiento. Como consecuencia, la celularidad tímica se reduce drásticamente en ambos entornos (Figura 1A). Mientras que un timo de un ratón salvaje de 8 semanas de edad contiene aproximadamente 100 millones de células, se puede esperar que la celularidad de un ratón de 2 años sea la mitad de eso, y un timo 4 días después de la irradiación y el trasplante de médula ósea puede ser tan bajo como 5.00.000 células (Figura 1A).
El condicionamiento citotóxico ablacionará preferentemente las células hematopoyéticas, por lo que el compartimento estromal se enriquecerá proporcionalmente (Figura 1B). Sin embargo, la baja celularidad general hará que el aislamiento de un número suficiente de células estromales tímicas sea un desafío. Por lo tanto, puede ser necesario agrupar animales para obtener números de celda compatibles con las aplicaciones multiómicas posteriores y minimizar la pérdida de material siempre que sea posible. Para realizar multiómicas en células estromales tímicas, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de células vivas, únicas, CD45-Ter119- (Figura 1C) garantizará que se pueda clasificar un número suficiente de células de la mayoría de las condiciones de estrés.
Para preservar la heterogeneidad del compartimento del estroma, normalmente no clasificamos un solo marcador positivo del estroma, sino que seleccionamos las células hematopoyéticas. Todavía se recomienda incluir marcadores de células estromales positivos para el análisis para garantizar que se haya logrado una disociación tisular adecuada. Sin embargo, el aislamiento de FACS es imperfecto y, según lo determinado por scRNAseq, entre el 30% y el 50% de las células clasificadas serán de origen hematopoyético (Figura 1D, E). Esto se puede mejorar mediante el agotamiento magnético de las células CD45+ antes de FACS; sin embargo, esto no se recomienda para condiciones de celularidad tímica reducida (Figura 1A), ya que la pérdida de material que viene con el procesamiento adicional involucrado en el agotamiento magnético da como resultado rendimientos del estroma demasiado bajos para aplicaciones posteriores.
Para el aislamiento del estroma tímico humano, el paso más crítico es la digestión enzimática. Si se apresura la etapa de disociación, el rendimiento general de células estromalas, así como la representación del subtipo de células estromalas, disminuirá gravemente (Figura 2A). También se recomienda incluir siempre los marcadores de endotelio tímico y epitelio para asegurar que la digestión de los tejidos ha sido óptima, ya que la simple obtención de marcadores hematopoyéticos negativos no será suficiente para medir la liberación real de células estromales. Esto se ejemplifica en la Figura 2A, donde el porcentaje de células negativas para marcadores hematopoyéticos es mayor en la muestra digerida durante 30 min en comparación con la muestra incubada durante 90 min. Sin embargo, como se observa en la puerta consecutiva, el rendimiento de las células endoteliales y epiteliales es muy pobre en el protocolo de digestión más corto (Figura 2A).
Para el aislamiento de FACS de células estromales tímicas humanas para aplicaciones multiómicas, se sugiere la tinción con un cóctel de anticuerpos de linaje hematopoyético, así como anticuerpos CD4 y CD8, además del marcador panhematopoyético CD45 y el marcador eritroide CD235a (Figura 2B) para mejorar el enriquecimiento de células estromales. Por lo tanto, para el análisis multiómico humano del estroma tímico, las células vivas, únicas, CD45-CD235a-Linaje-CD4-CD8- deben clasificarse por FACS (Figura 2B). Como se ha visto para scRNAseq de muestras murinas, esto todavía resulta en la contaminación del 30%-50% de las células hematopoyéticas, pero esto aún proporciona una resolución aceptable del compartimento del estroma del timo humano (Figura 2C, D).
Para el estroma óseo y BM se utilizó la misma estrategia que para el tejido tímico; Las células estromales se aíslan mediante compuerta en células negativas para marcadores hematopoyéticos, y se incluyen otros marcadores de células estromales como controles de digestión (Figura 3). La disociación del tejido calcificado como el hueso da lugar a una acumulación significativa de residuos. La adición de calceína como colorante de viabilidad permitirá la exclusión de la mayoría de estos desechos, que de otro modo inflarían falsamente los números clasificados y disminuirían las frecuencias de la población cerrada (Figura 3). Esto se ejemplifica en los gráficos FACS que comparan la compuerta en todas las celdas y solo la compuerta en Calcein+ (Figura 3). Como se ha visto para las células estromales tímicas humanas, el porcentaje de células con marcadores hematopoyéticos negativos no es una lectura fiable de la eficiencia de la disociación ósea y del tejido BM (Figura 3). Si bien la puerta CD45-Ter119- puede contener una gran cantidad de células en una muestra en la que falló el paso de digestión, un análisis más detallado de los marcadores típicos de células óseas y estromales óseas CD31, CD140a y CD51 demuestran claramente una liberación deficiente del estroma (Figura 3 y Figura 4).
Para el aislamiento de FACS de células óseas murinas y estromales BM, se sugiere el uso de la estrategia de compuerta como se muestra en la Figura 3, donde solo clasificamos CD45-Ter119-Calceína+, pero monitoreamos las propiedades de dispersión frontal y lateral y la expresión de marcadores de células estromales de la población clasificada para garantizar una digestión óptima (Figura 3A). La combinación de la depleción de células magnéticas de la médula ósea con linaje hematopoyético positivo antes de FACS y la clasificación en las puertas mostradas da como resultado la secuenciación de células individuales con un estroma del &gt;90%. Un ejemplo de este tipo de ejecución de secuenciación de scRNA (Figura 5A,B) ilustra esta baja contaminación hematopoyética después de la anotación basada en el transcriptoma de las células analizadas (ejemplos de genes marcadores hematopoyéticos, Figura 5C). Esto contrasta marcadamente con las preparaciones del estroma tímico en las que no se realizó el agotamiento magnético de las células antes de la etapa de clasificación debido al limitado material de partida en el tejido tímico posterior al trasplante (Figura 1F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig01.jpg"> Figura 1: Análisis de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular del estroma tímico murino. (A) Cuantificación del número de timocitos en ratones de 8 semanas de edad (Control), ratones de 8 semanas de edad irradiados letalmente y trasplantados 4 días antes (trasplante) y ratones de 2 años (Aged ). (B) Gráficos representativos de citometría de flujo que demuestren el enriquecimiento en subtipos de células estromales 4 días después de la irradiación letal y el trasplante. (C) Estrategia de compuerta por citometría de flujo para clasificar el estroma tímico murino para el análisis multiómico de una sola célula. (D) UMAP del timo murino que indica estroma (azul) y células hematopoyéticas (rojo). (E) UMAPs que muestran genes marcadores hematopoyéticos murinos en muestras de timo. (F) Cuantificación de células estromales y hematopoyéticas murinas en muestras de scRNAseq de timo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig02.jpg"> Figura 2: Análisis de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular del estroma tímico humano. (A) Gráficos FACS que muestran resultados representativos del impacto de diferentes tiempos de digestión en la liberación de poblaciones de células del estroma tímico humano. (B) Estrategia de activación por citometría de flujo para clasificar el estroma tímico humano para el análisis multiómico de una sola célula. (C) UMAP de timo humano que indica estroma (azul) y células hematopoyéticas (rojo). (D) UMAPs que muestran genes marcadores hematopoyéticos humanos en muestras de timo. (E) Cuantificación de células estromales y hematopoyéticas humanas en muestras de scRNAseq de timo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig03.jpg"> Figura 3: Los marcadores estromales de médula ósea murina y la calceína son útiles para estimar la eficiencia de la disociación. (A) Análisis representativo de citometría de flujo de células estromales de médula ósea murina CD45-Ter119 controladas en todas las células y células Calceína+. Con la posterior activación de CD31- que muestra una mayor proporción de células CD140a+CD51+ al seleccionar las células Calceína+. (B) Análisis de citometría de flujo representativo de una digestión ósea fallida con células CD140a+CD51+ faltantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig04.jpg"> Figura 4: Estrategia de activación del estroma de la médula ósea. (A) Estrategia de activación por citometría de flujo para clasificar el estroma de la médula ósea murina para multiómicas unicelulares. (B) Análisis de citometría de flujo representativo de una digestión fallida de la médula ósea con células CD140a+CD51+ faltantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig05.jpg"> Figura 5: Secuenciación de ARN unicelular de médula ósea con composición de células estromales y hematopoyéticas. (A) UMAP de hueso murino y médula ósea que indica estroma (azul) y células hematopoyéticas (rojo). (B) Cuantificación de células estromales y hematopoyéticas en muestras de hueso murino y médula ósea. (C) UMAP de genes marcadores hematopoyéticos en muestras de médula ósea murina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.

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Investigación

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Inmunología e Infección

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