Name: Un flujo de trabajo semiautomatizado para la criopreservación de esperma de coral para apoyar los biobancos y la acuicultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Aprenda un protocolo semiautomatizado para la criopreservación de esperma de coral que mejora la eficiencia durante los eventos de desove limitados. Este método escalable apoya la conservación de la biodiversidad marina y los programas de restauración de arrecifes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimización de la criopreservación de esperma de coral a partir de especies de coral amenazadas

<ol><li>Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2014-2017+global-scale+coral+bleaching+event%3A+Insights+and+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts.</a> Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).</li>
<li>Anthony, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interventions+are+needed+to+save+coral+reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">New interventions are needed to save coral reefs.</a> Nature Ecology & Evolution. 1 (10), 1-3 (2017).</li>
<li>Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+resource+banking+for+wildlife+research%2C+management%2C+and+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Genome resource banking for wildlife research, management, and conservation.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 41 (4), 228-234 (2000).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+and+using+germplasm+and+dissociated+embryonic+cells+for+conserving+Caribbean+and+Pacific+coral%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Preserving and using germplasm and dissociated embryonic cells for conserving Caribbean and Pacific coral.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33354(2012).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+frozen+repository+for+the+Great+Barrier+Reef+coral+created%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">First frozen repository for the Great Barrier Reef coral created.</a> Cryobiology. 65 (2), 157-158 (2012).</li>
<li>Zuchowicz, N., Daly, J., Lager, C., Williamson, O., Hagedorn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freezing+on+the+beach%3A+A+robust+coral+sperm+cryopreservation+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Freezing on the beach: A robust coral sperm cryopreservation design.</a> Cryobiology. 101, 135-139 (2021).</li>
<li>Hobbs, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+coral+biobanking+science+in+Australia+-+transitioning+into+applied+reef+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Marine+Science%22%5BJournal%5D)">A decade of coral biobanking science in Australia - transitioning into applied reef restoration.</a> Frontiers in Marine Science. , 9(2022).</li>
<li>Daly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+can+assist+gene+flow+on+the+Great+Barrier+Reef%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation can assist gene flow on the Great Barrier Reef.</a> Coral Reefs. 41, 455-462 (2022).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assisted+gene+flow+using+cryopreserved+sperm+in+critically+endangered+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assisted gene flow using cryopreserved sperm in critically endangered coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (38), e2110559118(2021).</li>
<li>Daly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+cryopreservation+of+coral+larvae+using+vitrification+and+laser+warming%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Successful cryopreservation of coral larvae using vitrification and laser warming.</a> Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).</li>
<li>Daly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+proof+of+concept+demonstration+of+nanowarming+in+coral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Sustainable+Systems%22%5BJournal%5D)">The first proof of concept demonstration of nanowarming in coral tissue.</a> Advanced Sustainable Systems. , (2023).</li>
<li>Powell-Palm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+revival+of+Hawaiian+stony+corals+via+isochoric+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and revival of Hawaiian stony corals via isochoric vitrification.</a> Nature Communications. 14, 4859(2023).</li>
<li>Reef Restoration and Adaptation Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gbrrestoration.org">https://gbrrestoration.org</a> (2023).</li>
<li>Florida Coral Rescue. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue">https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue</a> (2023).</li>
<li>Harrison, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrison%2C+PL+%22Coral+reefs%3A+An+ecosystem+in+transition%22">Coral reefs: An ecosystem in transition</a>. , Chapter 6 59-85 (2011).</li>
<li>Hagedorn, M., Carter, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryobiology%3A+Principles%2C+species+conservation+and+benefits+for+coral+reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Cryobiology: Principles, species conservation and benefits for coral reefs.</a> Reproduction, Fertility and Development. 28 (8), 1049(2016).</li>
<li>Zuchowicz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+coral+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessing coral sperm motility.</a> Scientific Reports. 11, 61(2021).</li>
<li>Thomas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+cryovial+dispensing+system+for+cell+banking%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+%26+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated cryovial dispensing system for cell banking.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 37 (17), 22-23 (2017).</li>
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<li>Bailey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+sperm+counting+methods+using+limits+of+agreement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Validation of sperm counting methods using limits of agreement.</a> Journal of Andrology. 28 (3), 364-373 (2007).</li>
<li>Hu, E., Yang, H., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cryopreservation+of+spermatozoa+of+blue+catfish+%28Ictalurus+furcatus%29%3A+Establishment+of+an+approach+for+commercial-scale+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput cryopreservation of spermatozoa of blue catfish (Ictalurus furcatus): Establishment of an approach for commercial-scale processing.</a> Cryobiology. 62 (1), 74-82 (2011).</li>
<li>Pickett, B. W., Berndtson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+bovine+spermatozoa+by+freezing+in+straws%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: A review.</a> Journal of Dairy Science. 57 (11), 1287-1308 (1974).</li>
<li>Westbrook, C. E., Daly, J., Bowen, B., Hagedorn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+collector+urchin+embryo%2C+Tripneustes+gratilla%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the collector urchin embryo, Tripneustes gratilla.</a> Cryobiology. 15, 104865(2024).</li>
<li>Maria, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryotubes+for+the+cryopreservation+of+Tambaqui+fish+semen+%28Colossoma+macropomum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Use of cryotubes for the cryopreservation of Tambaqui fish semen (Colossoma macropomum).</a> Cryobiology. 70 (2), 109-114 (2015).</li>
<li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biobanking%3A+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+%26+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreservation & Biobanking. 21 (1), 106-110 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ovation ALI-Q 2 VS Pipeta Controller - Pipeta de alícuota</td><td>Vistalab</td><td>2100-1005</td><td>Manejo de fluidos &ndash; medición del volumen de espermatozoides, adición de solución crioprotectora, alícuota de muestras en crioviales</td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 5 mL (a granel)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Nunc 170355</td><td>Manejo de fluidos &ndash; medición del volumen de espermatozoides, adición de solución crioprotectora, alícuota de muestras en crioviales</td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 10 mL (a granel)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nunc&nbsp; 170356</td><td>Manejo de fluidos &ndash; medición del volumen de espermatozoides, adición de solución crioprotectora, alícuotas de muestras en crioviales</td></tr><tr><td>P2 0.2&ndash; 2 y micro; Pipeta</td><td>L Gilson</td><td>F144054M</td><td>Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación móvil</td></tr><tr><td>P10 1&ndash; 10 y micro; Pipeta</td><td>L Gilson</td><td>F144055M</td><td>Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación móvil</td></tr><tr><td>P20 2&ndash; 20 y micro; Pipeta L</td><td>Gilson</td><td>&nbsp; F144056M</td><td>Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación móvil</td></tr><tr><td>P200 20&ndash; 200 y micro; Pipeta</td><td>L Gilson F144058M</td><td></td><td>Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación móvil</td></tr><tr><td>P1000 100&ndash; 1000 y micro; Pipeta L</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td>Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación de la</td></tr> movilidad <tr><td>Bomba de vacío</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>Preparación de agua de mar filtrada para la preparación de soluciones Sistema de</td></tr><tr><td>filtración reutilizable en la tapa de la botella Thermo</td><td>Scientific</td><td>DS0320-5045</td><td>Preparación de agua de mar filtrada para la preparación</td></tr> <tr><td>de soluciones0,22-y micro; M Discos filtrantes, mezclas de ésteres de celulosa&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>Preparación de agua de mar filtrada para la preparación de soluciones Agua de</td></tr><tr><td>mar filtrada</td><td>N/A</td><td>&ndash;</td><td>Medio base para la activación de espermatozoides y soluciones crioprotectoras</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>Producto químico crioprotector utilizado a una concentración final de 10% v/v en agua de mar filtrada para la criopreservación de esperma</td></tr><tr><td>Cafeína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750</td><td>Se utiliza para activar la motilidad de los espermatozoides</td></tr><tr><td>Fracción de choque térmico BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Se utiliza para minimizar la adherencia de los espermatozoides a los portaobjetos de pozo CASA</td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml - Thermo con bastidores</td><td> Scientific</td><td>339651</td><td>Preparación de la solución de activación de espermatozoides</td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml con estanterías</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>Para la recogida de haces de gametos y muestras de esperma filtradas</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Thermo Scientific</td><td>Samco 202PK</td><td>Para ayudar a la recogida de haces de gametos de la superficie del agua</td></tr><tr><td>100-&micro; mCanastas de filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>Para excluir óvulos durante la separación de la muestra de semen</td></tr><tr><td>Bastidores Eppendorf</td><td>Interpath</td><td>511029</td><td>Dilución y activación de espermatozoides para la concentración y la evaluación móvil</td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>Dilución y activación de espermatozoides para la concentración y la evaluación móvil</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio 18x18 mm</td><td>Marca</td><td>4700 45</td><td>Evaluación de la concentración y motilidad de los espermatozoides mediante microscopía de fase</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio liso, prelimpios, 75x25 mm</td><td>Corning</td><td>2947</td><td>Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante microscopía</td></tr><tr><td>de fase Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante microscopía de fase</td></tr><tr><td>Portaobjetos CASA (Leja 20-&micro; m 4 cámaras, SC-20-01-04-B)</td><td>IMV Technologies</td><td>025107</td><td>Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)Cámara de recuento de espermatozoides</td></tr> <tr><td>de Makler (CASA)</td><td>IVFStore</td><td>SM-373</td><td>Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)</td></tr><tr><td>accu-bead&reg; cuentas de recuento</td><td>Hamilton-Thorne</td><td>710111</td><td>Evaluación de la concentración y motilidad de los espermatozoides mediante el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)</td></tr><tr><td>Sistema CASA + ordenador portátil</td><td>Hamilton Thorne</td><td>Ceros II</td><td>Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)</td></tr><tr><td>Gafas de seguridad</td><td>genéricas</td><td>;</td><td>Equipo de protección personal para usar cuando se manipula DMSO y nitrógeno líquido</td></tr><tr><td>Bata de laboratorio Manga</td><td>larga, largo y</td> largo<td>;</td><td>Equipo de protección personal para usar cuando se manipula DMSO y nitrógeno líquido</td></tr><tr><td>Criogonos (par)</td><td>Tempshield</td><td>Mid-Arm Equipo de</td><td>protección personal para usar cuando se manipulan DMSO y nitrógeno líquido</td></tr><tr><td>Pinzas medianas</td><td>Genéricas</td><td>;</td><td>Para la extracción de muestras criopreservadas de los criobastidores y la manipulación de muestras en nitrógeno líquido</td></tr><tr><td>Escáner de código de barras (compatible con 2D)</td><td>Zebra</td><td>DS2278</td><td>Para la lectura de códigos de barras 1D y 2D en crioviales para la gestión de muestras</td></tr><tr><td>Vial de 2,0 ml CryoStorage, rosca externa, pretapado, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), lineal y legible por humanos</td><td>Eppendorf</td><td>30079434</td><td>Crioviales con código de barras para la criopreservación de muestras de esperma</td></tr><tr><td>Rack criovial</td><td>Simport</td><td>T315</td><td>Bastidor para sujetar crioviales, con base de bloqueo para permitir el destapado y el taponado con una sola mano</td></tr><tr><td>Estantes de congelación</td><td>Personalizado</td><td>&ndash;</td><td>Sistema de criopreservación diseñado a medida para el esperma de coral, que utiliza componentes impresos en 3D y fácilmente disponibles. La lista de piezas y las instrucciones de montaje están disponibles en Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)</td></tr><tr><td>Tapa de rejilla de congelación</td><td>Personalizado</td><td>&ndash;</td><td>Sistema de criopreservación diseñado a medida para el esperma de coral, que utiliza componentes impresos en 3D y fácilmente disponibles. La lista de piezas y las instrucciones de montaje están disponibles en Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)</td></tr><tr><td>Termo de congelación &ndash; Contenedor de alimentos al vacío de doble pared de acero inoxidable 18/8 de 1,5 litros</td><td>Isosteel</td><td>&nbsp; VA-9683&nbsp;</td><td>Sistema de criopreservación diseñado a medida para el esperma de coral, que utiliza componentes impresos en 3D y fácilmente disponibles. La lista de piezas y las instrucciones de montaje están disponibles en Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)</td></tr><tr><td>Temporizadores de laboratorio</td><td>Genéricos</td><td>&ndash;</td><td>Para el momento del equilibrio crioprotector antes de la criopreservación</td></tr><tr><td>Baño de nitrógeno 9L</td><td>BelArt</td><td>M16807-9104</td><td>Para el enfriamiento de muestras durante la criopreservación y la retención de muestras durante la clasificación y la manipulación</td></tr><tr><td>Registrador de datos de termopar: multicanal</td><td>Omega</td><td>HH520</td><td>Monitoreo de temperatura durante la criopreservación para determinar la velocidad de congelación y el punto final</td></tr><tr><td>Sonda de termopar &ndash; Tipo K</td><td>Omega</td><td>5SC-TT-K-30-36 Monitoreo de</td><td>temperatura durante la criopreservación para determinar la velocidad de congelación y el punto final</td></tr><tr><td>Bolígrafos criogénicos/bolígrafos permanentes de color</td><td>Staedtler Lumocolor</td><td>318</td><td>Opcional para marcar tapas crioviales para ayudar con la gestión de muestras</td></tr><tr><td>Cargador seco - cargado</td><td>Taylor Wharton</td><td>CXR100 o CX500</td><td>Para la transferencia de muestras criopreservadas desde el campo/sitios de recolección hasta el biorepositorio para almacenamiento</td></tr></tbody></table>

un flujo de trabajo semiautomatizado para la criopreservación de esperma de coral para apoyar los biobancos y la acuicultura

A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture

Los pasos descritos en este protocolo se basan en los métodos originales para la criopreservación de esperma de coral descritos por Hagedorn et al.4 y el refinamiento posterior de Zuchowicz et al.6, proporcionando mejoras clave para aumentar la eficiencia del procesamiento de esperma para la criopreservación y el biobanco. El uso de crioviales con código de barras y un autopipeteador de alícuotas simplifica el procedimiento de empaquetado de esperma al eliminar la necesidad de imprimir y etiquetar a mano los crioviales, y reduce la tensión de pipetear a mano grandes cantidades de muestras. Es importante destacar que estas mejoras también reducen el tiempo necesario para la preparación de muestras para la criopreservación, de alrededor de 8-10 minutos a menos de 5 minutos. Junto con el uso de CASA, estas mejoras reducen el número de personal necesario para un biobanco eficiente de esperma de coral, de 4 a 6 en los métodos originales, a tan solo dos personas utilizando el protocolo actual. Además, el uso de crioviales con código de barras significa que cada tubo tiene un identificador único, por lo que cada uno se puede rastrear dentro de la base de datos con mayor resolución que el método anterior utilizando etiquetas impresas por lotes.
Las pruebas de campo del protocolo en dos eventos de desove durante la temporada de desove de la Gran Barrera de Coral de 2022 en Australia dieron como resultado la criopreservación y el biobanco de 389 muestras de 57 colonias de 5 especies por parte de dos operadores (una persona para CASA, una persona para la criopreservación), con una persona adicional que ayuda con la ruptura del haz y la separación de esperma según sea necesario. Durante el evento de desove de noviembre de 2022 en Konomie (North Keppel Island) en Queensland, Australia, dos operadores criopreservaron 150 muestras de 24 colonias de Acropora millepora durante un período de 2 h. El procesamiento eficiente y la criopreservación de este volumen de muestras de un número tan grande de colonias de coral fueron posibles principalmente gracias a la eficiencia obtenida en el tiempo de preparación de la muestra y la transferencia simplificada de metadatos entre estaciones de trabajo.
Pruebas adicionales del flujo de trabajo durante el desove en diciembre de 2023 determinaron que, para el esperma de coral, la cámara de recuento Makler proporcionó datos de motilidad y concentración más precisos en comparación con los portaobjetos de cámara de un solo uso de cubreobjetos fijos disponibles en el mercado que se utilizan habitualmente con los sistemas CASA. La cámara de recuento de Makler se validó para CASA utilizando microperlas de látex disponibles comercialmente a una concentración conocida con un volumen de muestra de 4 μL y la configuración estándar de CASA17 utilizada para el esperma de coral. Estos análisis mostraron recuentos consistentes con baja variabilidad (44,5 ± 0,7 millones/mL) que se encontraban dentro del rango de concentración esperado (46,0 ± 7,0 millones/mL) proporcionado por el fabricante (Figura 2). Una comparación de los datos de CASA para Acropora millepora recolectados utilizando la cámara de conteo Makler y los portaobjetos de la cámara de cubreobjetos fijos encontró una diferencia significativa en los recuentos de concentración de espermatozoides entre los dos tipos de cámaras (P = 0.002; Figura 2), con los portaobjetos de la cámara de cubreobjetos fijos registrando menos de la mitad de la concentración determinada mediante la cámara de recuento Makler. Esta tendencia también se observó en muestras de esperma de otras dos especies de coral (datos no mostrados). Las pruebas realizadas durante diciembre de 2023 tampoco encontraron diferencias significativas en las concentraciones posteriores a la descongelación de espermatozoides totales, móviles o progresivamente móviles en muestras criopreservadas utilizando una dilución 1:1 con 20% de DMSO o una dilución 1:2 (espermatozoides: criodiluyente) con 30% de DMSO (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66233/66233fig01.jpg"> Figura 1: El flujo de trabajo utilizado para el procesamiento semiautomatizado de esperma de coral para la criopreservación y ejemplos de equipos móviles utilizados en el campo. (A) Los haces de gametos de coral se recolectan en una proporción de 5 mL de haces sobre 5 mL de FSW y se dividen para separar los óvulos y los espermatozoides (i). Los metadatos de la colonia se introducen en la hoja de datos automática (ii) y la muestra de esperma aislada se evalúa mediante análisis de esperma asistido por ordenador (CASA) (iii). Los parámetros de calidad del esperma se añaden a la hoja de datos automática para calcular la adición de 20% o 30% de DMSO en FSW (iv), y la muestra diluida se alícuota en crioviales con código de barras (v). Los crioviales se cargan en el bastidor criogénico y se escanean en la hoja de datos automática (vi), luego se enfrían a una velocidad de -20 °C/min a -80 °C (vii). A continuación, las muestras se enfrían en nitrógeno líquido y se transfieren a transportadores secos para su transporte al Banco de Criodiversidad de Taronga (viii). (B) Ejemplo de las estaciones CASA (izquierda) y criopreservación (derecha) instaladas en un sitio de campo remoto en el aula del Centro de Educación Ambiental de Konomie. (C) Ejemplo de la estación de criopreservación de alta capacidad basada en laboratorio configurada para hacer funcionar múltiples bastidores criogénicos en el Simulador Nacional del Mar del Instituto Australiano de Ciencias Marinas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/66233fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66233/66233fig02.jpg"> Figura 2: Comparación de dos opciones diferentes de portaobjetos de cámara para la medición de la concentración de esperma de coral. (A) Comparación de las mediciones de la concentración total de espermatozoides en Acropora millepora (n = 3 individuos) utilizando la cámara de conteo Makler y portaobjetos de cámara de cubreobjetos fijos disponibles en el mercado. Las columnas muestran la media ± SEM.; los asteriscos indican una diferencia significativa (P = 0,002). (B) Validación de la cámara de recuento Makler utilizando microperlas de látex disponibles comercialmente a una concentración conocida y configuraciones estándar de CASA para esperma de coral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/66233fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66233/66233fig03.jpg"> Figura 3: Concentraciones post-descongelación de espermatozoides totales, móviles o progresivamente móviles en muestras criopreservadas. Comparaciones posteriores a la descongelación de las concentraciones de espermatozoides totales, móviles y progresivamente móviles utilizando 20% o 30% de DMSO en FSW para lograr la concentración final de DMSO del 10% para la criopreservación. Las muestras de n = 3 individuos se dividieron en 2 alícuotas cada uno, con una alícuota criopreservada con una adición 1:1 de 20% de DMSO y la segunda alícuota diluida a &lt;2 × 109/mL utilizando FSW para la criopreservación con una adición 1:2 (espermatozoides: criodiluyente) de 30% de DMSO. Las columnas muestran la media ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/66233fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Fichero complementario 1: Ficha técnica de los biobancos de coral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/Coral%20biobanking%20auto%20datasheets_TEMPLATE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Un flujo de trabajo semiautomatizado para la criopreservación de esperma de coral para apoyar los biobancos y la acuicultura

Coral reefs are facing a crisis as the frequency of bleaching events caused by ocean warming increases, resulting in the death of corals on reefs around ...

a-semi-automated-workflow-for-cryopreservation-coral-sperm-to-support

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Este es un protocolo de esperma de alto rendimiento para la criopreservación de pez cebra. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad en la fertilización in vitro posterior y es estable durante muchos años.

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

Aquí se demuestra que el nuevo desarrollo • Kit de Cryo para la criopreservación de espermatozoides de ratón. Dos células etapa de desarrollo del embrión con esperma congelado-descongelado se ha mejorado consistentemente en cinco cepas de ratón con el uso de este kit. Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones genéticamente modificados fueron archivados por la crioconservación de esperma con el I • Kit de Cryo y más tarde recuperado con éxito por fecundación in vitro.

Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

MicroSecure Vitrification se desarrolló como un sistema de dispositivo de vitrificación cerrado aséptico y no comercial que cumple con las buenas prácticas de fabricación y manipulación de tejidos de la FDA. Debido a la retirada de las pajuelas de embriones hidrofóbicas de la industria, el procedimiento de vitrificación se modificó para incluir un sello interior antes del tapón interno de algodón estándar.

La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

Aquí, presentamos los protocolos que se han utilizado con éxito para delfín espermatozoides recolección, criopreservación y rendimiento de fecundación in vitro heteróloga utilizando ovocitos bovinos.

Tonina Delfín (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolección, criopreservación y fecundación In Vitro heteróloga

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.

Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

El presente Protocolo describe un procedimiento de evaluación del esperma de pescado utilizando el análisis de los espermatozoides asistido por ordenador y equipos de refrigeración. El software ofrece una rápida, precisa y análisis cuantitativo de la calidad del esperma de pescado basada en motilidad de espermatozoides, que puede ser una herramienta útil en la acuicultura para mejorar el éxito de la reproducción.

Evaluación del esperma de pescado utilizando Software y equipos de refrigeración

Protocolos de criopreservación de maduración y esperma de anguila europea han sido mejorados en los últimos años. Este artículo describe el protocolo mejor disponible con gonadotropina coriónica humana (hCG) para inducir la maduración y metanol como crioprotector.

Manejo y tratamiento del hombre europeo anguilas (Anguilla anguilla) de maduración Hormonal y criopreservación de esperma

Los corales crean ecosistemas biodiversos importantes tanto para los seres humanos como para los organismos marinos. Sin embargo, todavía no entendemos todo el potencial y la función de muchas células de coral. Aquí, presentamos un protocolo desarrollado para el aislamiento, etiquetado y separación de poblaciones de células de coral pedregosas.

Clasificación celular activada por fluorescencia para el aislamiento de las poblaciones celulares escleractinianas

Este protocolo describe la configuración y el funcionamiento de un sistema de microrrespirometría que puede emplearse para investigar las características fisiológicas del holobionte de coral.

Caracterización fisiológica del holobionte de coral mediante una nueva herramienta de microrrespirometría

Aquí, presentamos la extracción y preparación de metabolitos polares y semipolares de un holobionte de coral, así como tejido huésped de coral separado y fracciones celulares de Symbiodiniaceae, para el análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas.

Cromatografía de gases-Espectrometría de masas basada en metabolómica dirigida de muestras de coral duro

Aprenda un protocolo semiautomatizado para la criopreservación de esperma de coral que mejora la eficiencia durante los eventos de desove limitados. Este método escalable apoya la conservación de la biodiversidad marina y los programas de restauración de arrecifes.

Un flujo de trabajo semiautomatizado para la criopreservación de esperma de coral para apoyar los biobancos y la acuicultura

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