Name: Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprende a optimizar la microscopía de fluorescencia para visualizar el transporte axonal de cargas endógenas en Caenorhabditis elegans vivos. Este protocolo mejora la observación de proteínas citosólicas mediante control temporal y ablación.

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<meta charset="utf8"></head><body>Mejora del análisis de transporte axonal en C. elegans vivos utilizando RAB-3 marcado con GFP

<ol><li>Millecamps, S., Julien, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axonal+cytoskeleton%3A+from+organization+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The axonal cytoskeleton: from organization to function.</a> Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).</li>
<li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+unseen%3A+the+hidden+world+of+slow+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport.</a> Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).</li>
<li>Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+proteins+are+selectively+delivered+to+axons+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons.</a> Elife. 12, e82568(2023).</li>
<li>Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap%2C+a+toolkit+for+high-throughput+CRISPR%2FCas9+gene+modification+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).</li>
<li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+to+analyze+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons.</a> J Vis Exp. (128), e56690(2017).</li>
<li>Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cgc.umn.edu/">https://cgc.umn.edu/</a> (2023).</li>
<li>Ghanta, K. S., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melting+dsDNA+donor+molecules+greatly+improves+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).</li>
<li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NATF+%28Native+and+Tissue-Specific+Fluorescence%29%3A+A+strategy+for+bright%2C+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+Project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Taylor, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+topography+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular topography of an entire nervous system.</a> Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Takihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Li, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+kinesin+UNC-104%2FKIF1A+is+a+key+regulator+of+synaptic+aging+and+insulin+signaling-regulated+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory.</a> Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).</li>
<li>Viancour, T. A., Kreiter, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+fast+axonal+transport+rates+in+young+and+old+rat+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons.</a> Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).</li>
<li>Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decrease+in+axonal+transport+measured+by+MR+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo.</a> Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).</li>
<li>Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Lissencephaly-1+levels+augments+mitochondrial+transport+and+has+a+protective+effect+in+adult+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons.</a> J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Hall, D. H., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+posterior+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+serial+reconstruction+of+identified+neurons+and+complete+pattern+of+synaptic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions.</a> J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+ventral+nerve+cord+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-binding+protein+1+promotes+specific+motor-cargo+association+in+the+cell+body+prior+to+axonal+delivery+of+dense+core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles.</a> Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+homology-directed+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-wrmScarlet+and+split-sfGFP%3A+tools+for+faster%2C+easier+fluorescent+labeling+of+endogenous+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 217 (4), (2021).</li>
<li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap+assembly+of+Caenorhabditis+elegans+MosSCI+transgene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors.</a> G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).</li>
<li>Glomb, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-1+adaptor+complex+controls+bimodal+slow+axonal+transport+of+spectrin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (22 mm x 22 mm, Nº 1); Cubierta de vidrio Gold Seal Thomas</td><td>Scientific</td><td>6672A14</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>ChemCruz</td><td>sc-205730</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio: Microscopio invertido Nikon Ti2, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, cámara Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA objetivo de inmersión en aceite, escáner de fotoestimulación Nikon a 488 nm con filtro de emisión ET525/36</td><td></td><td>Microscopio</td> confocal de disco giratorio Nikon <td></td></tr><tr><td>&nbsp; NIS-elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software para el Nikon Ti2&nbsp;</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopía lisos prelimpios</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td></td></tr><tr><td><cepa > nematodo fuerte</fuerte></td><td>Identificador</td><td>Fuente</td><td></td></tr><tr><td>rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)</td><td>Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)</td><td>MTS1161&nbsp;</td><td>Se depositará en CGC (https://cgc.umn.edu/)</td></tr></tbody></table>

optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en caenorhabditis elegans vivos

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Visión general del sistema modelo y del procedimiento de medición Para visualizar el transporte axonal de los precursores de las vesículas sinápticas, rastreamos endógenamente GFP marcado con RAB-3. Aquí hacemos uso de una cepa6 de GFP::Flip-on::RAB-3 recientemente generada, en la que la expresión de la recombinasa Flippasa bajo un promotor específico de la célula (glr-4p) marca RAB-3 endógeno en la neurona motora DA9. DA9 es una neurona motora bipolar, con su cuerpo celular ubicado en la parte posterior del animal en el lado ventral, cerca del ano (Figura 1A). Contiene una dendrita corta que corre hacia delante a lo largo del cordón nervioso ventral y un axón largo que corre hacia atrás, forma una comisura y luego corre hacia delante a lo largo del cordón nervioso dorsal, donde forma sinapsis al paso que inervan el músculo dorsal y la neurona VD22,23,24. Visualizamos el transporte axonal en la región asináptica; la mayoría de los eventos de transporte se pueden capturar con un solo plano focal (Figura 1A). Se implementa un primer paso de fotoblanqueo para reducir el fondo de las vesículas estacionarias en esta área, que a menudo tienden a detenerse en esta región (Figura 1B). Los vídeos time-lapse se graban durante 3 minutos y la señal RAB-3 a lo largo de la región asináptica se traza en un kymograph para extraer los eventos de transporte individuales (Figura 1C).
Ajuste del parámetro de adquisición para optimizar la visualización del transporte axonal Para superar la baja intensidad de la señal de muchas proteínas marcadas con fluorescencia endógena, es necesario optimizar los parámetros de adquisición del microscopio. Para una cuantificación robusta de los eventos de transporte, la intensidad de la señal de los eventos de transporte individuales debe ser lo más brillante posible sobre el fondo citoplasmático o la carga estacionaria en pausa. Los precursores de vesículas sinápticas a menudo se detienen en la región asináptica en distintos grupos de vesículas, lo que interfiere con la detección de nuevas vesículas entrantes y dificulta el seguimiento de sus rastros de transporte7.
Un solo paso inicial de blanqueo de fluorescencia puede reducir en gran medida la señal de fluorescencia derivada de los grupos de vesículas para mejorar la detección de movimiento de nuevas vesículas entrantes (Figura 2A). La etapa de blanqueo solo mejoró ligeramente la señal de movimiento de las vesículas RAB-3 sobre la intensidad de fondo citoplasmática, probablemente porque la fracción citoplasmática de RAB-3 es muy baja (Figura 2D).
El uso de la discretización proporciona una capa adicional para mejorar la señal sobre el fondo de eventos de transporte individuales mediante la combinación de una matriz de píxeles en un solo píxel. Un agrupamiento de 2 x 2 reducirá a la mitad la resolución espacial (en este caso, de 108,33 nm/píxel a 216,7 nm/píxel), que sigue siendo suficiente para rastrear partículas de transporte RAB-3 individuales (Figura 2B), pero mejora considerablemente la intensidad de la señal de las vesículas individuales (Figura 2D). A menos que se requiera una resolución espacial muy alta, el binning también se puede aplicar para visualizar muchas otras cargas axonales.
A continuación, nos preguntamos cómo los cambios en el tiempo de exposición pueden mejorar la intensidad de la señal de eventos de transporte individuales. Incluimos especialmente el tiempo de exposición en el análisis para demostrar también que el tiempo de exposición de hasta 500 ms con 700 ms entre los puntos de tiempo de imagen posteriores aún proporciona una resolución temporal a la que se pueden rastrear los precursores de vesículas sinápticas (Figura 2C, D).
Generación y análisis de kymographs con Fiji Para generar un kymograph y analizar eventos de transporte individuales, siga los pasos de la Figura 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del sistema modelo para visualizar el transporte axonal de RAB-3 fluorescente endógeno. (A) Panel superior: Vista general del nematodo con eje posterior-anterior y ventral-dorsal indicado. La neurona motora DA9 está etiquetada como azul. Panel central: Acérquese a la región en caja que se muestra en el panel superior con la compartimentación DA9 indicada. Las sinapsis al paso se ilustran en verde, * indica el ano. Nótese que el axón continúa en el cordón nervioso dorsal hasta que pasa la vulva. El recuadro rojo indica la región de la zona asináptica. Panel inferior: Imagen de microscopía confocal de GFP endógena marcada con RAB-3 en el axón proximal en un solo plano focal. Nótese que hay sumideros de vesículas de RAB-3 en pausa más larga en la región asináptica, aunque la mayoría de las señales de RAB-3 se agrupan en la región sináptica. La región asináptica está representada en rojo. Escala: 20 μm. (B) Imágenes representativas de una grabación time-lapse para visualizar el transporte axonal. Para mejorar la trazabilidad de las partículas de transporte individuales sobre las partículas estacionarias, la región asináptica se fotoblanquea inicialmente. Los paneles inferiores en la región de cuadro púrpura muestran un ejemplo de un evento de movimiento anterógrado (punta de flecha naranja) y retrógrado (punta de flecha azul). Los paneles de arriba a abajo representan puntos de tiempo consecutivos. (C) El registro de lapso de tiempo en (B) se trazó como un quimógrafo (representación 2D del tiempo sobre la posición). Las líneas diagonales representan eventos de movimiento en los que la pendiente indica la velocidad. Las líneas verticales muestran eventos estacionarios. El cuadro púrpura es un acercamiento del cimógrafo para resaltar los eventos de transporte que también se muestran en (B) y se trazan los eventos de transporte anterógrados (naranja) y retrógrados (azul). Las líneas verticales discontinuas indican los eventos de pausa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig02.jpg"> Figura 2: Optimización de los pasos y parámetros de adquisición para mejorar la visualización de la carga axonal endógena. Las GFP::RAB-3 endógenas se visualizaron en la zona asináptica del axón DA9 tomando imágenes de un solo plano focal en un microscopio de disco giratorio confocal. Se adquirieron cimógrafos para visualizar eventos de transporte individuales en dirección anterógrada (de derecha a izquierda) y retrógrada (de izquierda a derecha) (A-C). (A) Los cismógrafos muestran los eventos de transporte de RAB3 sin (quimógrafos izquierdos) o con un paso de blanqueo integrado. Tenga en cuenta que el paso de blanqueo mejora la visualización de los eventos de pausa (indicados por puntas de flecha amarillas) entre eventos de transporte consecutivos (puntas de flecha naranjas). (B) La implementación de la agrupación 2 x 2 ayuda a mejorar la intensidad de la señal de los eventos de transporte RAB3 débiles. Las imágenes se adquirieron con un tiempo de exposición de 300 ms y, con (C), el aumento incremental del tiempo de exposición (de 100 ms en el extremo izquierdo a 500 ms en el extremo derecho) ayuda a mejorar la intensidad de la señal de los eventos de transporte individuales. Las imágenes se adquirieron en agrupación de 2 x 2 y utilizando un paso inicial de fotoblanqueo. Todos los kymographs muestran una duración total de 3 min y se dibujan a la misma escala, de modo que los kymographs con menos puntos de tiempo de adquisición debido a un lapso de tiempo más largo entre puntos de imagen consecutivos tienen una longitud total más corta del kymograph. (D) Cuantificación de la intensidad de la señal por evento de transporte después de la sustracción de la fluorescencia de fondo de los kymographs en (A-C). Tenga en cuenta que el agrupamiento y el paso de blanqueo fotográfico se adquirieron con un tiempo de exposición de 300 ms. Comparación estadística utilizando n eventos para 100 ms (neventos= 27 en nanimales= 2), 200 ms (neventos= 30 en nanimales= 2), 300 ms (neventos= 88 en nanimales= 6), 500 ms (neventos= 12 en nanimales= 1), 300 ms sin (w.o.) binning (neventos= 31 en nanimales= 3), 300 ms con (w) binning (neventos= 88 en nanimales= 6) y 300 ms, Binning 2 x 2 con blanqueo (neventos= 88 enn animales= 6) y sin blanqueo. Cada punto de datos representa la intensidad de la señal de un evento de transporte RAB-3 individual después de la sustracción de fondo (citoplasma del axón) en un solo punto de tiempo a lo largo de su traza que se eligió al azar. El tiempo de exposición se comparó mediante una prueba de Kruskal-Wallis seguida de una comparación múltiple de Dunn, el binning y el fotoblanqueo se compararon mediante una prueba de Mann-Whitney por pares. Las barras de error indican la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig03.jpg"> Figura 3: Procedimiento paso a paso para generar un quimógrafo y medir eventos de transporte individuales. (A) Después de cargar la grabación de video en Fiji, se utiliza la herramienta de línea segmentada para trazar una línea a lo largo del segmento axonal que se va a analizar. (B) Se genera un kymograph (panel derecho) utilizando el plugin Kymoreslicewide con los parámetros representados en el panel izquierdo. (C) Los eventos de transporte individuales se rastrean con la herramienta de línea lineal y se almacenan en el administrador de ROI. El panel derecho muestra la configuración de medición que se utiliza para generar la tabla de resultados. (D) Los resultados de la tabla se utilizan para calcular el parámetro de transporte. Los cuadros indican parámetros importantes que se describen en la sección de métodos del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos

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El transporte intracelular de cargas, como vesículas u orgánulos, se lleva a cabo mediante proteínas motoras moleculares que se desplazan por microtúbulos polarizados. Este protocolo describe la correlación de la direccionalidad del transporte de las partículas de carga individuales que se mueven dentro de las neuronas, con la cantidad relativa y el tipo de proteínas motoras asociadas.

La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis &quot;Mapeo de carga&quot;

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal e intracelular. Aquí describo un protocolo para el análisis del transporte axonal e intraflagelar en C. elegansy grabación en vivo .

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Este estudio describe las mediciones cuantitativas del tamaño y localización sináptica, la morfología muscular y la forma mitocondrial en C. elegans utilizando herramientas de procesamiento de imágenes disponibles libremente. Este enfoque permite que estudios futuros en C. elegans comparen cuantitativamente la extensión de los cambios estructurales de tejidos y orgásis como resultado de mutaciones genéticas.

Enfoques cuantitativos para el estudio de las estructuras celulares y la morfología de los organélilos en Los cenoheman

Se ha presentado un protocolo para la obtención de imágenes de los microtúbulos dinámicos in vivo utilizando la proteína de unión al extremo etiquetada fluorescentemente. Describimos los métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar los microtúbulos dinámicos en la neurona del microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans

Utilizando ratones fluorescentes transgénicos, se describen protocolos detallados para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias dentro de los axones motores y sensoriales del nervio ciático intacto en animales vivos.

Ampliación del kit de herramientas para imágenes in vivo del transporte axonal

Este protocolo proporciona un enfoque estandarizado para obtener imágenes de la morfología mitocondrial en múltiples tejidos de C. elegans durante el envejecimiento.

Imágenes y cuantificación de la morfología mitocondrial en C. elegans durante el envejecimiento

Aquí proporcionamos instrucciones sobre cómo utilizar eficazmente SegElegans, un sistema de aprendizaje profundo que desarrollamos para la segmentación automatizada de gusanos individuales en imágenes de microscopía de campo amplio, para su uso posterior en software de análisis de imágenes como ImageJ. Proporcionamos formas de utilizar el sistema tanto en línea como fuera de línea.

Análisis automatizado de imágenes de fluorescencia de C. elegans usando SegElegans

Aprende a optimizar la microscopía de fluorescencia para visualizar el transporte axonal de cargas endógenas en Caenorhabditis elegans vivos. Este protocolo mejora la observación de proteínas citosólicas mediante control temporal y ablación.

Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos (Video) | JoVE Journal

Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos

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