Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Las células de Muller son las principales células gliales de la retina. Desempeñan un papel muy importante para mantener las neuronas de la retina altamente activas metabólicamente. Nuestro laboratorio estableció una técnica para aislar células de Muller de ojos de ratón. Esta técnica permitirá estudiar el papel de las células de Muller en diferentes enfermedades de la retina, comprender la patogénesis de las enfermedades y también desarrollar dianas terapéuticas.

[Narrador] Sacrificar éticamente al ratón de acuerdo con los métodos aprobados por su institución. Enuclee los ojos presionando una pinza estilo 5/45 en el área orbitaria para inducir la proptosis, seguido de la extracción del ojo colocando los brazos de las pinzas en la parte posterior del ojo, seguido de tirar suavemente del área orbitaria. Coloque los ojos en 10 ml de la solución ocular de células Muller y déjelos reposar durante la noche o durante aproximadamente 18 horas a temperatura ambiente. Después de 18 horas, decantar la solución ocular vertiéndolo fuera del tubo para desecharlo. Lávese los ojos con solución salina tamponada con fosfato caliente o PBS. Decanta el PBS nuevamente vertiéndolo fuera del tubo para desecharlo. Luego coloque los ojos en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga 10 ml de la solución de tripsina. Coloque el plato en una incubadora e incube durante 1,5 a 2 horas a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Después de la incubación, transfiera los ojos a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga aproximadamente cinco ml de medios de crecimiento de células primarias de Muller completas. Vale la pena señalar que el video se grabó fuera del capó para una mejor visibilidad y una demostración clara. Para experimentos reales, deben realizarse en una campana de flujo laminar como se muestra. Coloque los ojos bajo un microscopio de disección y comience a diseccionar. Use pinzas estilo M5S y tijeras Vannas para eliminar el tejido conectivo, los músculos extraoculares y el nervio óptico. Aquí, el nervio óptico se corta con tijeras Vannas. Sujete el ojo con pinzas estilo M5S y haga una incisión en la sección de la ora serrata con unas tijeras Vannas o la aguja de una jeringa. Sujete la incisión con dos pinzas estilo M5S y comience a tirar o rasgar la córnea de la parte posterior del ojo. Tire en pequeños incrementos para asegurarse de que la integridad de la retina permanezca intacta. Aquí hay una demostración sobre cómo quitar la córnea de la parte posterior de la copa ocular. Una vez que el cristalino y la retina neural estén expuestos, retire la capa pigmentada del ojo, que probablemente tenga el iris adherido. Luego retire la retina neural del cristalino. Elimine cualquier tejido pigmentado de la retina neural para mejorar la pureza del aislamiento. Dada la naturaleza pegajosa de la retina neural, es poco probable que elimine todo el tejido pigmentado. Recoge todas las retinas neurales y córtalas en pedazos más pequeños. Coloque las retinas neurales en un matraz T25 que contenga cuatro ml de medios de crecimiento de células primarias de Muller completas. Finalmente, coloque el matraz en una incubadora e incube a 37 grados centígrados y 5% de CO2. El panel A muestra un cultivo celular de Muller sano en el pasaje cero y el pasaje uno. La falta de pigmento indica la ausencia de células del EPR, que es el principal contaminante en el aislamiento. Esto se refuerza en el panel B con RP65, un marcador específico de RP.