Name: Interferencia de ARN en el parasitoide del huevo, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Aprende el método de interferencia de ARN en el parasitoide Trichogramma dendrolimi mediante microinyección de dsRNA. Esta técnica permite estudiar la regulación génica en organismos pequeños para el control biológico de plagas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue financiada por los Proyectos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32172476, 32102275), el Programa de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) y los Fondos Centrales que Orientan el Desarrollo Local de la Ciencia y la Tecnología (XZ202301YD0042C).

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos, software y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Recolección y mantenimiento del cultivo de insectos
<ol><li>Adherir un grupo de ~5.000 huevos de Corcyra cephalonica (Stainton) en una tarjeta de 9 cm por 16 cm utilizando una solución 1:5 (v/v) de goma arábiga en polvo y agua25,26. NOTA: Evite colocar demasiados huevos del huésped en la tarjeta, ya que el hacinamiento hace que no sea práctico para los procedimientos posteriores de transferencia y disección.</li>
	<li>Para evitar la eclosión de los huevos del huésped, someta las tarjetas de huevos del huésped a 30 minutos de irradiación ultravioleta (UV) (Figura 1-i). Posteriormente, corte el papel con huevos inactivados en tarjetas de huevo de 1 cm de grosor y 8 cm de diámetro, conteniendo cada una aproximadamente 300-500 huevos (Figura 1-ii)25,26,27.</li>
	<li>Introducir una cohorte de 80-120 avispas T. denrolimi en un tubo de vidrio de 2 cm de diámetro y 8 cm de longitud. Sella el tubo con algodón. NOTA: Mantener las avispas a una temperatura de 25 ± 1 °C, con un ciclo de luz/oscuridad de 16 h de luz y 8 h de oscuridad y mantener una humedad relativa de aproximadamente el 75%.</li>
	<li>Presente una tarjeta de huevo del huésped a las avispas para que las parasiten (Figura 1-ii). Deje que las avispas depositen sus huevos en los huevos del huésped durante 6 h, después de lo cual retire rápidamente las avispas. NOTA: Evite prolongar excesivamente el período de parasitación, ya que esto puede conducir a un hacinamiento de la descendencia de T. denrolimi dentro de un huevo huésped, lo que resulta en un aumento de la mortalidad de la avispa de la descendencia28,29.</li>
</ol>2. Síntesis de dsRNA
<ol><li>Diseñar conjuntos de cebadores que contengan un promotor T7 para la síntesis de ARN bicatenario (dsRNA). Elija un segmento de 300-400 pb del gen objetivo (Ferhch) para la síntesis de dsRNA.</li>
	<li>Adquirir conjuntos de cebadores sintetizados comercialmente para la producción de dsRNA para el gen objetivo y dsGFP para su uso como control negativo.</li>
	<li>Extraer el contenido de ARN de 100 avispas T. denrolimi utilizando el kit de referencia siguiendo el protocolo del fabricante9. Comprobar la calidad del contenido de ARN; si el valor de OD260/OD280 oscila entre 1,8 y 2,09.</li>
	<li>Purifique el contenido de ARN con 2 μL de tampón 5x (1 U/50 μL), 1 μL de ADNasa (1 U/50 μL) y 6,5 μL de ARN (~100 ng/μL), 0,5 μL deH2O a 42 °C durante 2 min.</li>
	<li>Realice la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para generar una plantilla de ADNc con 10 μL de ARN purificado (~100 ng/μL), 4 μL de tampón 5x (1 U/50 μL), 1 μL de mezcla de enzimas I (1 U/50 μL) y 4 μL deH2O. Realice la RT-PCR con los siguientes ajustes: 37 °C durante 15 min, 85 °C durante 5 s. Almacenar el producto de ADNc a -4 °C hasta su uso.</li>
	<li>Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de dsRNA de acuerdo con la mezcla maestra de referencia (10 μL de Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL de cebador directo [0,4 μM], 0,8 μL de cebador inverso [0,4 μM], 0,8 μL de molde de ADN [40 ng/μL] y 7,6 μL deH2O). Realice la PCR con los siguientes ajustes: 94 °C durante 2 min; 35 ciclos con 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s; 72 °C durante 2 min.</li>
	<li>Evaluar la calidad de los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2,0% 5,9 y confirmar la secuencia diana mediante secuenciación Sanger.</li>
	<li>Purifique el producto de PCR con el kit de extracción de gel según las pautas del fabricante 9,23.</li>
	<li>Utilice un sistema de ARNi para sintetizar dsRNA para el gen diana con 10 μL de tampón 2x (0,02 U/μL), 8 μL de molde de ADN (75 ng/μL) y 2 μL de mezcla de enzimas (1 U/50 μL) con los siguientes ajustes: 37 °C durante 30 min, 70 °C durante 10 min, y 25 °C durante 20 min. Eluir el dsRNA sintetizado con 30 μL de agua libre de nucleasas.</li>
	<li>Evaluar la calidad del producto dsRNA visualizándolo en un gel de agarosa al 1,0% 5,9. Diluir el dsRNA a 7.000 ng/μL. Comprobar la calidad del producto dsRNA; si el valor de OD260/OD280 oscila entre 1,8 y 2,09. Almacenar el producto dsRNA a -20 °C hasta su uso.</li>
</ol>3. Trasplante de pupas de T. denrolimi 
<ol><li>Cultive los huevos del huésped parasitado durante aproximadamente 8 días a 25 ± 1 ° C, manteniendo un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad y una humedad relativa de ~ 75%. Los huevos del huésped parasitado se ennegrecerán después de 5 días30 (Figura 1-iv, v).</li>
	<li>Transfiera la tarjeta del huevo huésped a un microscopio de disección. Emplee un par de agujas de tungsteno (Figura 1-vi) para eliminar meticulosamente el corion de los huevos del huésped (Figura 1-vii) y recuperar la pupa del interior (Figura 1-viii)5,17,18. NOTA: La punta de la aguja de disección debe ser inferior a 0,05 mm.</li>
	<li>Prepare una placa limpia para el sustrato. Vierta 10-15 ml de una solución de agar de 15 g/L, dejando que se enfríe naturalmente (Figura 2-i). NOTA: Mezcle la solución de agar con 0,5 g de estreptomicina para inhibir el crecimiento de contaminantes in vitro.</li>
	<li>Emplee un buril desinfectado para grabar varias ranuras que midan 0,2-0,3 mm de profundidad y 0,4-0,8 mm de ancho (Figura 2-ii).</li>
	<li>Use un cepillo pequeño (Figura 2-iii) para trasplantar una pupa del huevo huésped diseccionado a una de las ranuras del sustrato de agar (Figura 2-iv).</li>
	<li>Repita los pasos 3.4 y 3.5, trasplantando 100-300 pupas individualmente en los surcos uno por uno (Figura 2-v).</li>
</ol>4. Microinyección de dsRNA en la pupa de T. denrolimi
<ol><li>Use un extractor de agujas de vidrio para extraer un capilar de vidrio (Figura 3-i, ii). Ajuste el calor a 280, la velocidad a 170, el retardo a 250 y el tirón a 30 en un extractor de agujas (Figura 3-iii). Prepare varias agujas de vidrio capilar para la microinyección (Figura 3-iv, v).</li>
	<li>Biselar la punta de la aguja de vidrio con una placa abrasiva (Figura 3-vi). NOTA: Asegúrese de que la punta de la aguja de inyección permanezca afilada; de lo contrario, puede provocar la mortalidad de la pupa o impedir el flujo de reactivos a través de la aguja (Figura 3-vii).</li>
	<li>Cargue aproximadamente 2 μL de la solución inyectable de dsRNA con 7.000 ng/μL en la aguja de inyección preparada utilizando una bomba de microinyección (Figura 3-vii).</li>
	<li>Transfiera el sustrato de agar que contiene cientos de pupas a la plataforma de un microscopio compuesto (Figura 3-viii).</li>
	<li>Inserte con cuidado la aguja de inyección en el abdomen de una pupa de T. denrolimi en un ángulo de ~30° con respecto al abdomen debajo de la lente (Figura 3-ix).</li>
	<li>Inyecte gradualmente ~ 5 nL de la solución inyectable (paso 4.3) en la pupa de T. denrolimi lo más suavemente posible. NOTA: La pupa de T. denrolimi puede hincharse ligeramente a medida que se inyecta la solución de dsRNA. La inyección de una cantidad excesiva de solución en la pupa o el uso de agujas con aberturas demasiado grandes puede provocar la muerte prematura de la pupa. Cambie las agujas cuando se obstruyan después de inyectar varias o decenas de pupas.</li>
	<li>Repita los pasos 4.5 y 4.6, inyectando dsRNA en 600 pupas una por una. NOTA: Para un análisis confiable de RT-qPCR, el contenido de ARN debe aislarse de al menos 100 pupas. Inyectar al menos 600 pupas para tres réplicas en el tratamiento con dsRNA y tres réplicas en el control negativo de dsGFP 9.</li>
</ol>5. Incubación de pupas de T. denrolimi
<ol><li>Transfiera el sustrato que contiene las pupas inyectadas a una incubadora a 25 ± 1 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 16 h/8 h y ~75% HR.</li>
	<li>Incubar aproximadamente 700 pupas de T. denrolimi por tratamiento durante 24 h o 48 h. Extraer el contenido de ARN de un grupo de 100 pupas por réplica9. NOTA: Retire las pupas encogidas (pupas muertas) de las muestras; de lo contrario, puede dar lugar a errores en la detección de la expresión génica.</li>
	<li>Incubar ~50 pupas de T. denrolimi por tratamiento hasta que emerjan las avispas (Figura 3-x). Registre la tasa de emergencia y la tasa de deformidad.</li>
</ol>6. Detección de la expresión génica diana
<ol><li>Diseñar el conjunto de cebadores para el gen diana y los genes de referencia para RT-qPCR utilizando una herramienta de diseño. NOTA: Asegúrese de que las secuencias de los cebadores RT-qPCR no se superpongan con la región objetivo del dsRNA.</li>
	<li>Emplear el gen forkhead box O (FoxO) como gen de referencia en el análisis de RT-qPCR; los cebadores de FoxO han sido reportados previamente9.</li>
	<li>Obtener juegos de cebadores sintetizados comercialmente. Realice RT-qPCR con 10 μL de Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL de cebador directo (0,4 μM), 0,8 μL de cebador inverso (0,4 μM), 0,8 μL de molde (10 ng/μL) y 7,6 μL deH2O. Realice RT-qPCR con los siguientes ajustes: 95 °C durante 30 s; 35 ciclos con 95 °C durante 5 s, 57 °C durante 30 s, 72 °C durante 30; 95 °C durante 10 s; 60 °C durante 5 s y 95 °C durante 5 s.</li>
	<li>Calcular el valor de expresión del gen diana mediante el método 2-ΔΔCt 9,25.</li>
	<li>Emplear la prueba de Kruskal-Wallis para analizar la expresión del gen diana bajo la influencia de diferentes tratamientos (dsFerhch, dsGFP, no inyección). NOTA: Evite el uso de pruebas paramétricas (p. ej., prueba t) para comparaciones post-hoc, ya que la heterocedasticidad y la no normalidad de los datos pueden llevar a conclusiones erróneas25.</li>
</ol>

Avance de las técnicas de ARNi en Trichogramma dendrolimi para el análisis de la función génica

<ol><li>Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+with+Trichogramma+in+China%3A+History%2C+present+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives.</a> Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+clutch+size+for+quality+control+of+bisexual+and+Wolbachia-infected+thelytokous+lines+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+mass+reared+on+eggs+of+a+substitutive+host%2C+Antheraea+pernyi+Gu%C3%A9rin-M%C3%A9neville+%28Lepidoptera%3A+Saturniidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae).</a> Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).</li>
<li>Li, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+the+biological+control+of+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+by+egg+parasitoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pest+Sci%22%5BJournal%5D)">Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids.</a> J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+superparasitism+on+quality+and+characteristics+of+thelytokous+Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+during+mass+rearing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing.</a> Sci Rep. 9 (1), 18114(2019).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrance+during+Wolbachia-mediated+parthenogenesis+of+Trichogramma+wasps+is+reduced+by+continuous+oviposition%2C+associated+with+exhaustion+of+Wolbachia+titers+in+ovary+and+offspring+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs.</a> Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).</li>
<li>Huang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+and+large-scale+releases+of+Trichogramma+promote+pesticide+decrease+in+maize+in+northeastern+China%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China.</a> Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Trichogramma+japonicum+as+a+vector+of+Beauveria+bassiana+for+parasitizing+eggs+of+rice+striped+stem+borer%2C+Chilo+suppressalis%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis.</a> Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).</li>
<li>Ning, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+expression+pattern+of+the+sex+determination+genes+and+their+sex-specific+variants+in+the+egg+parasitoid+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> Front Physiol. 14, 1243753(2023).</li>
<li>Huo, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+evaluation+of+RT-qPCR+reference+genes+for+expression+analysis+in+the+tiny+egg+parasitoid+wasp%2C+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Asia+Pac+Entomol%22%5BJournal%5D)">Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883(2022).</li>
<li>Leung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biological+control%3A+the+need+for+integrating+genetics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+an+essential+gene+involved+in+infestation+and+digestion+in+grain+aphid+through+plant-mediated+RNA+interference+generates+aphid-resistant+wheat+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants.</a> Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).</li>
<li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> J Vis Exp. 130, e56990(2017).</li>
<li>Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pupal+and+Adult+Injections+for+RNAi+and+CRISPR+Gene+Editing+in+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis.</a> J Vis Exp. 166, e61892(2020).</li>
<li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li>
<li>Zhu, K. Y., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+Applications%2C+and+Challenges+of+Insect+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference.</a> Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).</li>
<li>Colinet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+RNAi+in+a+Drosophila+endoparasitoid+wasp+and+demonstration+of+its+efficiency+in+impairing+venom+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production.</a> J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digestive+tract+expressing+%CE%B1-amylase+influences+the+adult+lifespan+of+Pteromalus+puparum+revealed+through+RNAi+and+rescue+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses.</a> Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+is+outcompeted+by+its+uninfected+counterpart+in+superparasitism+but+does+not+have+developmental+delay%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay.</a> Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+concentration+of+Wolbachia+during+the+early+embryogenesis+of+the+host+dynamically+shapes+the+tissue+tropism+of+Wolbachia+in+host+Trichogramma+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps.</a> Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428(2023).</li>
<li>Lee, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Trichogramma+evanescens+Westw.+and+its+influence+on+the+embryonic+development+of+its+host%2C+Attacus+cynthia+ricini+Boisd%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomol+Sin+Z%22%5BJournal%5D)">The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd.</a> Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).</li>
<li>Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+silencing+of+genes+in+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+affects+survival%2C+growth+and+female+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity.</a> Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).</li>
<li>Wu, S., Yin, S., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+iron+trafficking+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster.</a> Curr Res Insect Sci. 50, 100888(2022).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia-Driven+Memory+Loss+in+a+Parasitic+Wasp+Increases+Superparasitism+to+Enhance+Horizontal+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission.</a> mBio. 13 (6), e0236222(2022).</li>
<li>Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradual%2C+temperature-induced+change+of+secondary+sexual+characteristics+in+Trichogramma+pretiosum+infected+with+parthenogenesis-inducing+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia.</a> PeerJ. 7, e7567(2019).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+Wolbachia+titers+cause+gradual+change+in+masculinization+of+intersex+individuals+of+thelytokous+Trichogramma+dendrolimi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi.</a> Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parasitism%3A+A+promising+approach+to+simultaneously+produce+Trichogramma+chilonis+and+T.+dendrolimi+on+eggs+of+Antheraea+pernyi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi.</a> Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Thelytokous+parthenogenesis-inducing+Wolbachia+on+the+fitness+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+in+superparasitised+and+single-parasitised+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts.</a> Front Ecol Evol. 9, 730664(2021).</li>
<li>Flanders, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notes+on+the+life+history+and+anatomy+of+Trichogramma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Entomol+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Notes on the life history and anatomy of Trichogramma.</a> Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Las avispas Trichogramma son reconocidas como agentes de control biológico eficaces, dirigidos específicamente a una variedad de plagas de lepidópteros en la agricultura y la silvicultura1. Estas diminutas avispas pasan por sus etapas inmaduras dentro del huevo huésped, una característica que presenta desafíos en la realización de experimentos de ARNi 5,18. Este estudio ofrece una guía visual completa para la realización de experi...

Trichogramma spp. es un grupo de parasitoides de huevos que han sido ampliamente utilizados como agentes de control biológico altamente eficientes contra un amplio espectro de plagas de lepidópteros en ecosistemas agrícolas y forestales en todo el mundo 1,2,3,4. La aplicación de Trichogramma criado en masa proporciona un enfoque respetuoso con el medio ambiente para el manejo sostenible de plagas 5,6,7. La comprensión de la biología molecular de las avispas Trichogramma proporciona información valiosa para mejorar la eficiencia de la cría masiva y el rendimiento en el campo de estos agentes de control biológico 8,9 mediante la investigación de la metodología de regulación génica y edición del genoma10.
Desde el descubrimiento de la interferencia genética específica mediada por ARN bicatenario (dsRNA) en Caenorhabditis elegans en 1998, el método de ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en un conjunto de herramientas genéticas vitales para explorar los mecanismos reguladores de los organismos mediante la supresión de la expresión de genes diana11. Los experimentos con ARNi se han convertido en una metodología estándar ampliamente aplicada para estudiar la función génica en numerosas especies de insectos12,13. Sin embargo, la manipulación del ARNi presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides, particularmente entre las pertenecientes a la familia endoparásita Chalcidoidea 14,15,16. El método ARNi ha sido documentado en al menos 13 especies de parasitoides 14,15,16,17,18,19. Entre estos, el enfoque de ARNi se ha llevado a cabo de manera integral en avispas Nasonia y es aplicable a lo largo de las etapas de desarrollo, incluidos embriones, larvas, pupas y adultos 14,15,16. Cabe destacar que las avispas Nasonia son ectoparasitoides, y sus crías se desarrollan en el espacio intersticial entre la pupa huésped y el pupario, lo que permite su cultivo in vitro y las hace tolerar ciertos tratamientos, como la microinyección. A diferencia de las avispas Nasonia, los individuos de Trichogramma experimentan todo su desarrollo embrionario, larval y pupal dentro del huevo huésped. La capa en estadios embrionario y larvario (que puede impedir la permeabilidad del dsRNA), la vulnerabilidad al daño y la dificultad para sobrevivir in vitro presentan obstáculos formidables 20,21,22. Además, el diminuto tamaño de los individuos de Trichogramma, aproximadamente ~0,5 mm de longitud adulta o pupa, los hace extremadamente intrincados para manipular 20,21,22.
En el presente estudio, describimos un procedimiento integral para realizar experimentos de ARN de interferencia (ARNi) en Trichogramma denrolimi Matsumura. Este procedimiento engloba los siguientes procedimientos: (1) el diseño y síntesis de ARN bicatenario (dsRNA), (2) microinyección de pupas de T. denrolimi, (3) el trasplante e incubación in vitro de estas pupas, y (4) la detección de knockdown de genes diana mediante análisis RT-qPCR. El gen diana seleccionado para el experimento de ARNi es la homología de cadena pesada de ferritina (Ferhch). El FerHCH, una proteína de unión al hierro, contiene un centro de ferroxidasa dotado de capacidades antioxidantes, lo que facilita la oxidación de Fe2+ a Fe3+. Desempeña un papel indispensable en el crecimiento y desarrollo de diversos organismos al mantener el equilibrio redox y la homeostasis del hierro. La depleción de FerHCH puede dar lugar a la acumulación excesiva de hierro, lo que conduce a daños irreversibles en los tejidos y, a menudo, culmina en alteraciones fenotípicas significativas, incluidos defectos de crecimiento, deformidades y mortalidad23,24. Este estudio ofrece una guía paso a paso para realizar ARNi en T. denrolimi, que será invaluable para investigar las funciones génicas dentro del contexto más amplio de las avispas Trichogramma.

<table><tbody><tr><td>2x ES Taq MasterMix (Tinte)</td><td>Cowin Biotech, China</td><td>CW0690H</td><td>Para amplificar las secuencias de dsRNA</td></tr><tr><td>20x Tampón PBS, tratado con DEPC (7.2-7.6)</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>B540627-0500</td><td>Para diluir la tira de agar dsRNA</td></tr><tr><td></td><td>Shishi Globe Agar Industries Co., Ltd, China</td><td>n/a</td><td>Para hacer medio de cultivo</td></tr><tr><td>Ampicilina sódica</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A610028</td> Para <td>hacer medio de cultivo</td></tr><tr><td>Bioer Baño de metal a temperatura constante </td><td>BIOER, China</td><td>MB-102</td><td>Para sintetizar dsRNA</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato  </td><td>WPI, EE. UU</td>. <td>1B100-4</td><td>Para tirar de la aguja de vidrio capilar</td></tr><tr><td>Banco limpio </td><td>Airtech, China</td><td>SW-CJ-1FD</td><td>Para extraer ARN</td></tr><tr><td>Agua doblemente destilada</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A500197-0500</td><td>Para diluir</td></tr> la cámara de pruebas ambientales de ADNc<tr><td> </td><td>Panasonic, Japón</td><td>MLR-352H-PC</td><td>Al cultivo T. denrolimi</td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf </td><td>Eppendrof, Alemania</td><td>5418R</td><td>Para almacenar el contenido de ARN</td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 4i</td><td>Eppendrof, Alemania</td><td>FemtoJet 4i</td><td>Para inyectar T. denrolimi</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada Eppendorf </td><td>Eppendrof, Alemania</td><td>5810R</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>Solución de etanol (75%, libre de ARNasa)</td><td>Aladdin, China</td><td>M052131-500ml</td><td>Para extraer ARN</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel</td><td>Omega, EE. UU</td>. <td>D25000-02</td><td>Para extraer ADNc</td></tr><tr><td>GUM Arabic</td><td>Solarbio, China</td><td>CG5991-500g</td><td>Para hacer tarjeta de huevo</td></tr><tr><td>Isopropil alchohol</td><td>Aladdin, China</td><td>80109218</td><td>Para extraer ARN</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas basado en láser </td><td>SUTTER, EE. UU</td>. <td>P-2000</td><td>Para tirar de la aguja de vidrio capilar</td></tr><tr><td>Microloader </td><td>Eppendrof, Alemania</td><td>20 y micro; L</td><td>Para cargar dsRNA</td></tr><tr><td>Triturador de tejido multimuestra  </td><td>LICHEN, China</td><td>LC-TG-24</td><td>Para moler T. denrolimi</td></tr><tr><td>Needle Grinder </td><td>SUTTER, EE. UU.</td><td>BV-10-E</td><td>Para moler aguja de vidrio capilar</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Sangon Biotech, China</td><td></td><td>Para diluir el ARN</td></tr><tr><td>OLYMPUS Microscopio OLYMPUS</td><td>, Japón</td><td>XZX16</td> Para observar la máquina de PCR de <td>T. denrolimi</td></tr><tr><td> </td><td>Bio-rad, EE. UU</td>. <td>S-1000</td><td>para la amplificación del ADN</td></tr><tr><td>PowerPac Basic</td><td>Bio-rad, EE. UU</td>. <td>PowerPacTM Basic</td><td>Para detectar la calidad de dsRNA </td></tr><tr><td>Primer de dsGFP (Forward)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA</td></tr><tr><td>Primer de dsGFP (Reverse)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG</td></tr><tr><td>Primer de Ferhch para qPCR (Forward)</td><td></td><td></td><td>TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT</td></tr><tr><td>Primer de Ferhch para qPCR ( Reverse)</td><td></td><td></td><td>CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT</td></tr><tr><td>Primer de Ferhch para RNAi (Reverso)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC</td></tr><tr><td>Primer de Ferhch para RNAi(Forward)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG</td></tr><tr><td>Primer de FoxO para qPCR (Forward)</td><td></td><td></td><td>CTACGCCGATCTCATAACGC</td></tr><tr><td>Cebador de FoxO para qPCR (inverso)</td><td></td><td></td><td>TGCTGTCGCCCTTGTCCT</td></tr><tr><td>PrimeScript RT Kit de reactivos con borrador de ADNg (perfecto en tiempo real)</td><td>TaKaRa, Japón</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>PCR cuantitativa en tiempo real </td><td>Bio-rad, EE. UU.</td><td>CFX 96 Touch</td><td>Para realizar la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) </td></tr><tr>Herramienta <td></td><td></td><td>de diseño de cebadores y sondas de PCR en tiempo real</td><td>https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/</td></tr> <tr><td>T7 RiBoMAX Express RNAi System</td><td>Promega, EE. UU.</td><td>P1700</td><td>Para sintetizar dsRNA   in vitro  </td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex TaqTM <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/66250/66250eq01.jpg" style="margen: auto; "> (Til RnaseH Plus)</td><td>TaKaRa, Japón</td><td>RR820A</td><td>Para realizar RT-qPCR</td></tr><tr><td>Triclorometano</td><td>KESHI, China</td><td>GB/T682-2002</td><td>Para extraer el</td></tr><tr><td>reactivo de ARN TRIzol</td><td>Ambion, EE. UU</td><td></td>. <td>15596018 Para extraer el contenido total de ARN de las muestras</td></tr><tr><td>Congelador de temperatura ultrabaja </td><td>Thermo, EE. UU.</td><td>Forma 911</td><td></td></tr></tbody></table>

interferencia de arn en el parasitoide del huevo, trichogramma dendrolimi matsumura

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Los parasitoides del huevo, Trichogramma spp, son reconocidos como agentes de control biológico eficientes contra diversas plagas de lepidópteros en la agricultura y los bosques. Las etapas inmaduras de la descendencia de Trichogramma se desarrollan dentro del huevo huésped, exhibiendo una notable diminución (aproximadamente 0,5 mm de longitud adulta). La metodología de ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en una herramienta crucial para dilucidar las funciones de los genes en numerosos organismos. Sin embargo, la manipulación del ARNi en ciertas especies de parasitoides pequeños, como Trichogramma, generalmente ha planteado desafíos significativos. En este estudio, presentamos un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. El procedimiento descrito abarca la adquisición y el aislamiento de muestras individuales de T. dendrolimi a partir de óvulos del huésped, el diseño y la síntesis de ARN bicatenario (dsRNA), el trasplante in vitro y el cultivo de pupas de T. dendrolimi , la microinyección de dsRNA y la posterior evaluación de la eliminación del gen diana mediante el análisis RT-qPCR. Este estudio proporciona un procedimiento completo y visualmente detallado para realizar experimentos de ARNi en T. dendrolimi, lo que permite a los investigadores investigar la regulación génica en esta especie. Además, esta metodología es adaptable para estudios de ARNi o microinyecciones en otras especies de Trichogramma con pequeños ajustes, lo que la convierte en una referencia valiosa para la realización de experimentos de ARNi en otras especies endoparásitas.

La tasa de emergencia de pupas de T. denrolimi inyectadas con dsFerhch fue significativamente menor que la de las inyectadas con dsGFP o las que no lo recibieron (Tabla 1). Entre las avispas emergidas, el 51,85% de las avispas T. denrolimi sometidas a dsFerhch desarrollaron pequeñas alas deformadas. Las avispas deformadas no se observaron en las avispas inyectadas con dsGFP o sin ninguna inyección (Tabla 1). Además, los abdómenes de l...

La manipulación del ARN de interferencia (ARNi) presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides con tamaño diminuto, como las avispas Trichogramma . Este estudio delineó un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. La presente metodología proporciona un modelo robusto para investigar la regulación génica en avispas Trichogramma .

Interferencia de ARN en el parasitoide del huevo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and ...

Las avispas Trichogramma son un grupo de parasitoides de huevos utilizados para controlar plagas de lepidópteros en la agricultura. La bacteria intracelular Wolbachia induce la partenogénesis de thelytokous en algunas avispas Trichogramma. Estamos tratando de responder al mecanismo de Wolbachia y a los sistemas de determinación del sexo en avispas Trichogramma.Hemos desarrollado el método de interferencia de ARN en avispas Trichogramma. Este método es un conjunto de herramientas genéticas vitales para investigar las funciones genéticas de Trichogramma. Las etapas inmaduras de la descendencia de Trichogramma se desarrollan dentro del huevo huésped.El tamaño del cuerpo de Trichogramma es extremadamente pequeño y mide aproximadamente 0,5 milímetros de longitud adulta. La manipulación de herramientas genéticas como la interferencia de ARN y la edición del genoma presenta un desafío formidable para estas diminutas avispas parasitoides. Durante décadas, las funciones de los genes dentro de todo el género Trichogramma han sido raramente exploradas.La presente metodología proporciona un modelo robusto para investigar la regulación génica durante el desarrollo y las actividades fisiológicas

rna-interference-egg-parasitoid-trichogramma-dendrolimi

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

ARN de interferencia (RNAi) basados ​​en técnicas de genes desmontables son el núcleo de la investigación Tribolium. Aquí, ofrecemos una visión general de nuestra técnica de RNAi larval en Tribolium castaneum. Larval RNAi es una técnica sencilla, pero de gran alcance que proporciona un acceso rápido a los fenotipos de pérdida de función, lo que permite a los investigadores estudiar las funciones de genes en diversos contextos.

La interferencia de ARN de las larvas en la Red Escarabajo de Harina, Tribolium castaneum

Este protocolo proporciona pautas para el funcionamiento de huevo experimentos de rechazo: esquema técnicas de pintura experimental huevo modelos para emular los colores naturales de huevos del pájaro, realizando trabajo de campo y análisis de los datos recogidos. Este protocolo proporciona un método uniforme para realizar experimentos de rechazo de huevos comparables.

Sondeando los límites del reconocimiento de huevo usando experimentos de rechazo de huevos a lo largo de gradientes fenotípicos

En este protocolo, se describen métodos para la realización de cruzamientos de consanguinidad y para evaluar el éxito de esas cruces, de la hormiga Vollenhovia emeryi. Estos protocolos son importantes para experimentos para entender la base genética de los sistemas de determinación de sexo en himenópteros.

Inducción y evaluación de cruces de consanguinidad con la hormiga, Vollenhovia Emeryi

Presentamos una sencilla técnica citogenética 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar la tasa de fertilización y primaria cociente del sexo de la plaga invasora del haplodiploid Bemisia tabaci.

Determinar la tasa de fertilización de huevos de Bemisia tabaci mediante una técnica citogenética

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Proporcionamos un protocolo detallado para la interferencia de ARN mediado por electroporación en insectos de la orden Odonata (libélulas y damiselas) utilizando la presa de cola azul (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) y la libélula pied skimmer libélula (Pseudothe zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Método de interferencia de ARN mediado por electroporación en Odonata

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

El presente protocolo describe el método de cría de insectos plaga tortricidas en los laboratorios. Los procedimientos para distinguir el sexo de los insectos y extraer ácidos nucleicos para la secuenciación de alto rendimiento se establecen utilizando dos plagas tortricidas.

Cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae

Este protocolo describe un ensayo de interferencia de ARN y ChIP para estudiar la herencia epigenética del silenciamiento inducido por ARNi y las modificaciones asociadas a la cromatina en C. elegans.

Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Aquí, presentamos un protocolo para extraer veneno de Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial creado con una película de polietileno y una solución de aminoácidos.

Extracción de veneno de la avispa parasitoide Trichogramma dendrolimi utilizando un huésped artificial

Aquí se presenta un protocolo para la administración de nanopartículas de quitosano/dsRNA en larvas de gusano de seda Bombyx mori para inducir el silenciamiento génico a través de la ingestión.

Interferencia de ARN larvario en el gusano de seda Bombyx mori a través de la entrega de nanopartículas de quitosano/dsRNA

Aprende el método de interferencia de ARN en el parasitoide Trichogramma dendrolimi mediante microinyección de dsRNA. Esta técnica permite estudiar la regulación génica en organismos pequeños para el control biológico de plagas.

Interferencia de ARN en el parasitoide del huevo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Explorar más videos