Name: Cuantificación de Acanthamoeba spp. Motilidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprende a cuantificar la motilidad de Acanthamoeba spp. mediante microscopía y análisis de imágenes de alto contenido. Este método computacional permite modelar infecciones y mejorar las prácticas de higiene en lentes de contacto.

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1. Preparación de Acanthamoeba 
NOTA:Este protocolo ha sido verificado para ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 y PRA-411. Este es un patógeno BSL2 y debe trabajarse dentro de una campana y un laboratorio BSL2.
<ol><li>Cree un cultivo maestro a partir de un vial de muestra o un tapón20 preparado llenando un matraz T75 con 30 mL de medio AC6 y añadíle asépticamente un tapón o el contenido de un vial de muestra. Incubar el matraz durante 3-5 días a 26-30 °C hasta que el matraz tenga una confluente del 50% al 80%.</li>
	<li>Pasan las células el día antes de que se necesiten para crear una población homogénea de trofozoítos.<ol><li>De acuerdo con las necesidades de la cepa, agite y / o golpee enérgicamente el cultivo maestro 2 veces para desalojar los trofozoítos adheridos.</li>
		<li>Llene un matraz T75 con 30 mL de medio AC6. Agregue 2 mL del cultivo maestro al pasaje. Incubar el matraz durante 18-24 h a 26-30 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Antes de la cosecha, inspeccione visualmente la población de trofozoítos con un aumento de 4x en el microscopio. Asegúrese de que los trofozoítos sean adherentes y uniformes.</li>
	<li>Golpee enérgicamente el matraz 2 veces para desalojar los trofozoítos adheridos. Vierta el contenido en un tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Gire el tubo a 500 x g durante 5 min en una centrífuga equilibrada para pellet la ameba. Vierta o pipetee el medio sobrenadante y deséchelo. Diluir el pellet en 2-10 mL de 1/4 de solución de Ringer.</li>
	<li>Vórtice la muestra. Añadir 10 μL de muestra a un hemocitómetro desechable y contar las UFC/mL de la Acanthamoeba.</li>
	<li>Según el recuento del hemocitómetro, diluya el pellet de ameba a una concentración de 7,5 x 103 células/ml en 1/4 de solución de Ringer.</li>
	<li>Siembre la ameba en una superficie, que puede ser de vidrio, plástico o agar sin nutrientes, y una variedad de formas de pocillos según las necesidades experimentales como se describe a continuación.<ol><li>Placa de 96 pocillos: Siembre cada pocillo con 200 μL de suspensión de Acanthamoeba y encierre la placa con la tapa.</li>
		<li>Plato de 48 pocillos: Siembre cada pocillo con 1 ml de suspensión de Acanthamoeba y encierre el plato con la tapa.</li>
		<li>Celda de flujo: Agregue lentamente 4 mL de suspensión de Acanthamoeba a través de los puertos estériles de una celda de flujo de aluminio estéril, evitando burbujas en la cámara. Cierre los puertos después de haber agregado la suspensión.</li>
	</ol></li>
	<li>Antes de la toma de imágenes, espere que la ameba se adhiera a la superficie durante al menos 30 minutos antes de iniciar el registro microscópico.</li>
</ol>2. Visualización y grabación de Acanthamoeba
<ol><li>Visualiza la ameba con un aumento de 4x en campo claro. El fondo debe aparecer de color gris claro y la ameba debe ser negra. Ajuste la luz y el enfoque para que las amebas sean ojeras sólidas en lugar de translúcidas (es decir, ligeramente desenfocadas, Figura 1). NOTA: El aumento óptimo es de 4x para el seguimiento por varias razones: Las amebas que salen o entran en el campo de visión durante el seguimiento no deben incluirse en el análisis de datos, por lo que el aumento más bajo es el mejor para el número máximo de amebas incluidas en el análisis en un período de tiempo. Las amebas deben aparecer como círculos negros sólidos en campo claro para convertirlos en binarios para el análisis de seguimiento. Esto es más fácil de lograr con un aumento más bajo, ya que los aumentos más altos revelan fácilmente la naturaleza translúcida y las estructuras internas de la ameba. En general, se pueden capturar más amebas en un solo campo de visión con un aumento más bajo, lo que permite un análisis de datos más sólido.</li>
	<li>Configure los programas de grabación en el software de imágenes para grabar una imagen a intervalos regulares para rastrear a la ameba. El tiempo más largo entre imágenes que permitirá un seguimiento preciso es de 30 s, el tiempo óptimo para el tamaño del archivo y el detalle de seguimiento se sugiere en 12 s o 24 s.</li>
	<li>Las amebas se pueden rastrear durante varios días a la vez, pero tenga en cuenta el tamaño del archivo que creará este tipo de grabación y la dificultad inherente de manipular archivos extremadamente grandes. Para evitar esto, registre las amebas por secciones de tiempo en ciertos intervalos. Por ejemplo, grabe durante 1 h cada 12 h durante 5 días.</li>
	<li>Si el microscopio y el programa lo permiten, registre varios pocillos en una sola sesión utilizando las coordenadas XY de los pocillos de placa o varias ubicaciones de una celda de flujo. Si es necesario, una varias secciones de un pozo o celda de flujo para crear un campo de visión más grande con un aumento de 4x. NOTA: La única restricción sobre el número de ubicaciones que se pueden registrar es la rapidez con la que la platina del microscopio puede moverse entre ubicaciones dentro del intervalo de tiempo de la imagen (por ejemplo, tomar una imagen cada 12 s, 24 s, etc.). Sin embargo, esto no es necesario, y el seguimiento de vídeos realizados desde una única ubicación puede tener un número suficiente de pistas para un análisis estadístico sólido. En este estudio se utilizó un microscopio Nikon Eclipse Ti-U, y se utilizó la platina móvil automatizada para registrar imágenes en varios pocillos a la vez. Sin embargo, cualquier microscopio con capacidad de registro programable funcionará. El microscopio debe conectarse a una computadora y ser capaz de registrar imágenes en un programa o disco duro.</li>
</ol>3. Análisis del tamaño de las amebas
<ol><li>Abra el archivo del microscopio en el software de imágenes. Se abrirán las opciones de importación de bioformatos. En el cuadro de diálogo, asegúrese de que se cumplan las siguientes condiciones: Visualización de pilas; Ver con: Selection-Hyperstack; Administración de memoria: marque Usar pila virtual; Modo de color: Predeterminado.</li>
	<li>Asegúrese de que ninguno de los otros menús desplegables o casillas de verificación esté activado. Haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Opciones de series de bioformatos abiertos. Elija la serie que se necesita. Si solo se registra una ubicación a la vez, es probable que solo haya una opción aquí. Haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Elija Imagen &gt; Duplicar para duplicar el único pocillo con el que se está trabajando a la vez eligiendo solo un canal C y solo un canal Z.</li>
	<li>A partir de aquí, solo trabaje con la imagen duplicada para su manipulación y análisis, no con la original. Elija Imagen &gt; Escriba &gt; 8 bits. Elija Proceso &gt; Restar fondo.</li>
	<li>Establezca la bola rodante en 10.0. Compruebe el fondo claro. Compruebe el paraboloide deslizante.</li>
	<li>Elija Proceso &gt; Mejorar el contraste. Establezca los píxeles saturados en 0,1 % para los trofozoítos o en 0,3 % para un grupo de células y agregados.</li>
	<li>Seleccione Imagen &gt; Ajustar &gt; umbral (por defecto &gt; blanco y negro). Se abrirá el proceso Make Binary. Seleccione Predeterminado y marque Fondo negro (de máscaras binarias).</li>
	<li>Seleccione el umbral de manera agresiva para que la mayoría de las manchas de fondo no sean visibles, pero sí una parte de cada ameba.</li>
	<li>Si el software de imagen invirtió la imagen y el fondo es blanco y la ameba es negra, vaya a Editar &gt; Invertir para fijarla en un fondo negro y una ameba blanca.</li>
	<li>Elija Proceso&gt; Binario &gt; Cerrar, en caso de que las células tengan un ligero espacio en la membrana externa debido a estar fuera de foco o a la motilidad de la célula.</li>
	<li>Elija Procesar &gt; binario &gt; Llenar agujeros. Elimine los artefactos que no sean de ameba utilizando las herramientas de dibujo de formas y Editar &gt; Relleno. Si, en este punto, el fondo es blanco y la ameba es negra, elija Editar &gt; Invertir. En este punto, la imagen debe representar las imágenes binarias de la Figura 2.</li>
	<li>Para registrar el tamaño de cada ameba, elija Analizar &gt; Analizar partículas. Tamaño del conjunto: 10-infinito, circularidad: 0-1, mostrar: nada. Marque Mostrar solo resultados y resumir.</li>
	<li>Guarde los archivos CSV que aparecen. Elija Archivo &gt; Guardar como &gt; Tiff y edite el nombre según la especificación deseada.</li>
</ol>4. Preparación de archivos de microscopio para seguimiento (análisis de motilidad)
<ol><li>Abra el archivo del microscopio en el software de imágenes. Se abrirán las opciones de importación de bioformatos.</li>
	<li>En el cuadro de diálogo, asegúrese de que se cumplan las siguientes condiciones: Visualización de pilas; Ver con: Selección-Hyperstack. Para la administración de memoria, marque Usar pila virtual. Haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Se abrirán las opciones de la serie Bio-Formats. Elija la serie que se necesita. Si solo se registra una ubicación a la vez, es probable que solo haya una opción aquí. Haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Elija Imagen &gt; duplicar. A partir de aquí, solo trabaje en la sección duplicada del video en lugar de trabajar en el archivo original. NOTA: Duplique la sección del video que se está rastreando en ese momento. Para ello, es necesario conocer los fotogramas que corresponden a los minutos necesarios para el experimento. Por ejemplo, si se quiere realizar un seguimiento de la1ª hora y se toman imágenes cada 24 s, debe haber 150 fotogramas en la1ª hora. Por lo tanto, la1ª hora será los fotogramas 1-150, la2ª hora será 151-300, y así sucesivamente.</li>
	<li>Elija Imagen &gt; Tipo &gt; 8 bits. Elija Proceso &gt; Restar fondo. Establezca la bola rodante en 10.0.</li>
	<li>Compruebe el fondo claro. Compruebe el paraboloide deslizante. Elija Proceso &gt; Mejorar contraste y establézcalo en 0.1%.</li>
	<li>Marque Todos los x# sectores (por ejemplo, los 150 sectores). Desmarque Normalizar. Elija Imagen &gt; ajustar &gt; umbral (por defecto &gt; blanco y negro).</li>
	<li>Se abrirá el proceso Make Binary. Seleccione Predeterminado. Compruebe el fondo negro (de las máscaras binarias).</li>
	<li>Umbral agresivo, por lo que la mayoría de las manchas de fondo no son visibles, pero algunas partes de la ameba son visibles. En este paso, si el fondo es blanco y la ameba es negra, elija Editar &gt; Invertir. El fondo debe ser negro y la ameba debe ser blanca.</li>
	<li>Elija Procesar &gt; binario &gt; cerrar. Elija Procesar &gt; binario &gt; Llenar agujeros. Elija Archivo &gt; Guardar como &gt; Tiff y edite el nombre según la especificación deseada. El archivo ya está listo para el seguimiento.</li>
</ol>5. Análisis de la motilidad a través del seguimiento
<ol><li>Desde el software de imagen con el archivo tiff que se necesita para rastrear abierto, vaya a Plugins &gt; Seguimiento &gt; Trackmate. Se abrirá la versión de Trackmate.</li>
	<li>Elija Next (Siguiente). Seleccione el detector LoG en el menú desplegable del detector. Establezca el diámetro estimado de la mancha: 35,0 micras, umbral 1,0. Desmarque Usar filtro de mediana y Realizar localización de subpíxeles.</li>
	<li>Haga clic en Vista previa en el primer sector, el medio y el final. Asegúrese de que todas las amebas sean capturadas por un círculo púrpura y que no se incluyan defectos o artefactos de fondo.</li>
	<li>Elija Next (Siguiente). Comenzará a procesarse y este paso puede tardar unos minutos en realizarse. Una barra de detección en la parte superior de la pantalla indicará qué parte del proceso se ha completado.</li>
	<li>Elija Next (Siguiente ) cuando se le solicite. En el umbral inicial, elija Siguiente de nuevo sin seleccionar nada. Seleccione Hyperstack Displayer al seleccionar una vista. Elija Next (Siguiente).</li>
	<li>Establezca el filtro en puntos y elija Siguiente sin seleccionar nada. Selecciona un rastreador; para hacerlo, seleccione LAP Tracker (en lugar de Simple LAP Tracker). Elija Next (Siguiente).</li>
	<li>En la vinculación fotograma a fotograma, establezca la distancia máxima en 40 μm. Cierre de brecha en el segmento de la pista: marque Permitir cierre de la brecha. Establezca la distancia máxima para esto en 100 μm y el espacio máximo entre fotogramas en 4. No seleccione nada para División de segmentos de pista o Fusión de segmentos de pista.</li>
	<li>Elija Next (Siguiente). El seguimiento puede tardar mucho tiempo en ejecutarse. Cuando se complete, la ventana debe decir: Seguimiento realizado en x s en la parte inferior. Elija Next (Siguiente).</li>
	<li>Elija Next de nuevo cuando se complete el seguimiento. Establecer filtros en pistas: selecciona el signo + en la parte inferior izquierda para agregar un filtro para el número de puntos en las pistas. Establezca el filtro en Arriba para al menos el 93% de los fotogramas (por ejemplo, 150 fotogramas necesitarían un mínimo de 140 puntos). NOTA: Algunas versiones de este software requerirán seleccionar el equivalente opuesto, como Por debajo de al menos el 7%, lo que se puede hacer arrastrando una línea hacia la izquierda o hacia la derecha para alcanzar el número deseado.</li>
	<li>Elija Next (Siguiente). Aparecerán las opciones de visualización. Asegúrese de que las pistas de cada fotograma no estén deformadas o sean extrañas en la forma en que se mueve la ameba antes de guardar el archivo XML de Trackmate o el archivo CSV de Tracks.</li>
	<li>Si es necesario eliminar una pista, haga clic en TrackScheme. TrackScheme mostrará todas las pistas y puntos de contacto de la ameba en todos los fotogramas. NOTA: Las posibles razones para eliminar una pista son que una ameba ha caminado dentro o fuera del campo de visión durante la grabación, una pista tiene una forma inapropiada en comparación con la trayectoria real de la ameba, o por alguna razón, la pista o la ameba es un valor atípico en los datos de acuerdo con los parámetros experimentales, etc.</li>
	<li>Haga clic en la ameba para resaltar el punto verde en la pantalla y en Trackscheme el lugar tendrá un cuadrado verde a su alrededor. Esto indicará qué pista o lugar debe eliminarse.</li>
	<li>Haga clic con el botón derecho en la pista que debe eliminarse y seleccione Pista completa. Presione el botón Eliminar .</li>
	<li>Después de revisar todas las pistas, guarde el archivo de seguimiento haciendo clic en Guardar en la parte inferior izquierda de la ventana emergente del software de seguimiento. Guarde el archivo XML con el nombre del vídeo. Haga clic en Reanudar para volver a la ventana emergente del software de seguimiento.</li>
	<li>Haz clic en Pistas y selecciona Pistas a la izquierda. Haga clic en Exportar a CSV y guarde el archivo CSV.</li>
	<li>Si la hoja de cálculo no reconoce el CSV resultante, ejecute los siguientes pasos.<ol><li>Abra el archivo CSV guardado en el Bloc de notas. Haga clic en Control + A y Control + C para copiar todo el contenido.</li>
		<li>Abre la hoja de cálculo y haz clic en Control + V para pegarla en la hoja de cálculo. Todos los datos estarán en una celda.</li>
		<li>Con las celdas con datos aún seleccionadas, vaya a Datos &gt; texto a columnas. Elija Delimitado &gt; Siguiente. Elija Coma &gt; siguiente &gt; finalizar. Guarde este archivo como el nuevo CSV.</li>
	</ol></li>
	<li>El CSV de seguimiento tendrá muchos parámetros disponibles para el análisis (Figura 3). Copie y pegue los parámetros deseados en un nuevo archivo CSV (Figura 4) para analizar. A continuación se describen los parámetros utilizados.<ol><li>Distancia total recorrida: distancia total recorrida por una ameba en μm.</li>
		<li>Distancia máxima recorrida: la distancia máxima en el camino de una ameba desde su punto de inicio, que puede no ser necesariamente el punto final. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66268/66268eq01.jpg" style="margin: auto;"> Donde dij es la distancia a cualquier punto I a cualquier punto j de la pista.</li>
		<li>Tasa de confinamiento: La tasa de confinamiento indica qué tan eficiente fue una ameba para alejarse de su punto de partida: ¿viajó en línea recta lejos de su punto de partida (un valor cercano a 1), o se mantuvo relativamente cerca de su punto de inicio (un valor cercano a 0). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66268/66268eq02.jpg" style="margin: auto;"></li>
		<li>Velocidad media de la pista: Velocidad media de la ameba sobre la distancia total recorrida en micras por segundo. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66268/66268eq03.jpg" style="margin: auto;"></li>
		<li>Desplazamiento de la pista: La distancia entre el punto de inicio de una ameba y el punto final en micras. NOTA: Todos los parámetros de análisis del software de imágenes y sus definiciones se pueden encontrar aquí: https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/. Recuerda que cada archivo guardado es un resumen de los tracks analizados en ese momento. Para producir un análisis de datos robusto, será necesario combinar adecuadamente los resultados de múltiples réplicas, horas, etc., según sea adecuado para los datos (Figura 5 y Figura 6).</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Seguimiento y cuantificación a largo plazo de la motilidad de las especies de Acanthamoeba

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<li>Szentmary, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis+-+Clinical+signs%2C+differential+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Curr+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis - Clinical signs, differential diagnosis and treatment.</a> J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).</li>
<li>Carnt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis%3A+confirmation+of+the+UK+outbreak+and+a+prospective+case-control+study+identifying+contributing+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors.</a> Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).</li>
<li>Verani, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+outbreak+of+Acanthamoeba+keratitis+associated+with+use+of+a+contact+lens+solution%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States.</a> Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).</li>
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<li>imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started">https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started</a> (2024).</li>
<li>Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Gaussianity%2C+population+heterogeneity%2C+and+transient+superdiffusion+in+the+spreading+dynamics+of+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells.</a> Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>y frac14; Campanero' s solución</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BR0052G</td><td>Oxoid Ringers Solución Tabletas. Siga las instrucciones para hacer un cuarto de fuerza en lugar de Ringers de fuerza completa.</td></tr><tr><td>10 y micro; L pipeta</td><td>Eppendorf Research</td><td>3123000039</td><td>2 &micro; L-20 y micro; L monocanal</td></tr><tr><td>10 y micro; L puntas de pipeta</td><td>Neptune Scientific, San Diego, CA, EE. UU</td><td>. BT10.N</td><td>10 &micro; L Punta de barrera universal Placa</td></tr> de <tr><td>48 pocillos</td><td>Millipore Sigma,&nbsp;</td><td>CLS3548</td><td>Placa de pocillos múltiples tratada con TC Corning Costar: placa de poliestireno, pocillos de fondo plano, estériles, con tapa</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL (1 para cada muestra, 1 para cada paso de 2 muestras)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Falcon 352098</td><td>Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos de alta claridad, placa de polipropileno</td></tr><tr><td>de 96 pocillos</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA, EE. UU</td>. <td>CLS3596</td><td>Placa de pocillos múltiples tratada con TC de Corning Costar: placa de poliestireno, pocillos de fondo plano, estéril, con tapa</td></tr><tr><td>Acanthamoeba&nbsp; </td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU</td>. <td>ATCC 30461</td><td>Este protocolo ha sido verificado para ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 y PRA-411</td></tr><tr><td>Medios de cultivo axénicos (AC6)</td><td>Hecho en casa</td><td>n/a</td><td>Contiene 20 g de peptona de biosato, 5 g de glucosa, 0,3 g de KH2PO4, 10 y micro; g de vitamina B12 y 1 vaso de 5 mg&nbsp; L-metionina por litro de agua destilada desionizada. Ajuste el pH a 6.6-6.95 con 1 M de NaOH y autoclave a 121 &deg; C durante 20 minutos, almacene a temperatura ambiente hasta por 3 meses.</td></tr><tr><td>Centrífuga y rotor adecuado</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>Sorvall ST 40R</td><td>Cualquier centrífuga y rotor equivalentes son aceptables siempre que puedan girar tubos cónicos de 50 mL a 500 x g durante 5 min</td></tr><tr>Herramienta <td></td><td></td> de<td>quimiotaxis y migración</td><td>Software gratuito basado en ImageJ, disponible en https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td> <td>desechableBulldog Bio, Portsmouth, NH, EE. UU</td>. <td>DHC-N01</td><td>Neubauer Hemocitómetro desechable mejorado de 2 chips, empaquetado individualmente,</td></tr><tr><td>software ImageJ no pirogénico con complemento Trackmate (este protocolo escrito con Trackmate versión 6.0.2.)</td><td></td><td></td><td>Software libre desarrollado por los Institutos Nacionales de Salud, disponible en imagej.net. Complemento Trackmate disponible en https://imagej.net/plugins/trackmate/</td></tr> <tr><td>Microscope, preferiblemente con platina móvil automatizada</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td></td><td>En este estudio se utilizó un microscopio Nikon Eclipse Ti-U y se utilizó la platina móvil automatizada para poder registrar imágenes en varios pocillos a la vez.</td></tr><tr><td>Software NIS-Elements</td><td>Pipeta</td> serológica Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific, Hampton, NH, EE. UU.</td><td>BrandTech 26331</td><td>BrandTech accu-jet pro Pipeta Puntas</td>de</tr><tr><td>pipeta serológicas</td><td>VWR</td><td>5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088</td><td>Pipeta serológica VWR,</td></tr><tr><td>celda de flujo de transmisión de aluminio estéril no pirogénico</td><td>Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, EE. UU</td>. <td>Célula de flujo de transmisión monocanal de aluminio anodizado 81-AL</td><td>con huella de placa de 96 pocillos para usar con un microscopio invertido</td></tr><tr><td>Matraces T75</td><td>VWR, Radnor, PA, EE. UU</td><td>. 734-2316</td><td>Matraz de cultivo de tejidos VWR, 182,5 cm, Superficie tratada, Tapón de sellado, Estéril</td></tr></tbody></table>

cuantificación de acanthamoeba spp. motilidad

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Para lograr el éxito con este método, hay varias piezas generales cruciales a considerar. El primero es la configuración física de la ameba y el microscopio, el segundo es la utilización adecuada del software de imágenes y el tercero es exportar y analizar los datos de imágenes de una manera significativa.
Antes de que comience el registro microscópico, es fundamental asegurarse de que la ameba esté correctamente enfocada en la etapa del microscopio (Figura 1). En lugar de centrarse en la ameba en el plano Z más óptimo para los detalles individuales, aquí es ideal verlas muy ligeramente desenfocadas para que se conviertan en puntos negros sólidos en lugar de su estado translúcido cuando se ven en detalle. Verlos de esta manera permitirá que el software de imágenes y el software de seguimiento encuentren cada ameba individual mucho más fácilmente cuando el archivo se convierta a binario (Figura 2). Saber cuál es el objetivo en el software de imágenes, es decir, que cada ameba aparezca como un círculo blanco bien definido, puede ayudar al lector a encontrar el enfoque adecuado al tomar las imágenes originales en campo claro. Luego, con cada círculo claramente definido, el software de seguimiento podrá rastrear adecuadamente la motilidad y recopilar las métricas de motilidad individuales para cada ameba.
Después de seguir las instrucciones paso a paso en el protocolo enumerado anteriormente para el software de imágenes y el software de seguimiento y consultar el video asociado para ayudar en los primeros pasos cruciales del uso del software de imágenes, es hora de exportar los datos del software de imágenes para la cuantificación y el análisis de datos. La salida bruta del software de seguimiento será similar a la que se ve en la Figura 3. Aquí, es importante verificar que el número de puntos en las pistas que se exportaron sea correcto para lo esperado (por ejemplo, si se pide que el 93% de los fotogramas estén presentes en cada pista y se tienen 100 fotogramas en total en el vídeo, cada pista exportada debe tener más o menos de 93 puntos). Si los puntos no coinciden con los requisitos, es posible que deba volver a los pasos del software de seguimiento para asegurarse de que los parámetros requeridos se configuraron correctamente.
A partir de la exportación sin procesar, comience a crear la hoja de análisis de datos (Figura 4). Es importante recordar que cada pista representa una ameba singular dentro de una réplica singular. Por lo tanto, como se ve en la Figura 4, la Figura 5 y la Figura 6, todas las pistas de un conjunto de fotogramas o punto de tiempo deben promediarse (Figura 4), y este proceso debe realizarse para cada conjunto de fotogramas o punto de tiempo en una serie completa (es decir, si se toman un total de 3 h de video y los puntos de datos se dividen por hora, luego habrá tres conjuntos de fotogramas/horas para analizar por réplica, Figura 5). Por último, a partir de esta combinación de promedios en cada conjunto de fotogramas en cada réplica, los datos promediados deben combinarse de cada réplica en un espacio para que los datos de varias réplicas se puedan analizar para determinar el promedio real y la desviación estándar por punto de tiempo (Figura 6).
Los promedios de cada réplica se utilizarán para el análisis de datos, y el promedio combinado y la desviación estándar o el error estándar de todas las réplicas se utilizarán para la representación gráfica (como se ve en un ejemplo en la Figura 7). Si se analizan datos como lo hemos hecho aquí, que son múltiples muestras que se siguen en múltiples puntos de tiempo, lo más apropiado es analizarlos utilizando un ANOVA de medida de repetición de 2 vías con una prueba de Tukey post hoc. Esto nos permite determinar las diferencias entre las muestras en cada punto de tiempo y también determinar las diferencias dentro de cada muestra a lo largo del tiempo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig01.jpg"> Figura 1: Las amebas aparecen como formas oscuras opacas en la microscopía de campo claro. Imagen representativa ampliada de la ameba con un aumento de 4x, ligeramente desenfocada para que parezca una ojera sólida. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig02.jpg"> Figura 2: Ameba fotografiada en microscopía de campo claro convertida a binaria y rastreada. Amoeba con un aumento de 4x, en campo claro (izquierda), se convirtió a binario con los artefactos eliminados (centro) y, después del seguimiento, con las pistas seleccionadas (derecha). Fila superior: un pozo entero fotografiado uniendo 4 imágenes, barra de escala = 1000 μm. Fila inferior: el tamaño de una sola imagen antes de coser, barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig03.jpg"> Figura 3: La salida inmediata del análisis de datos del software de imágenes y seguimiento contiene una amplia variedad de tipos de datos. La salida representativa del seguimiento se muestra en la Figura 2, que es un vídeo singular. Tenga en cuenta que los números de pista (flecha roja) omiten números, lo que indica que el software de seguimiento eliminó correctamente las pistas que no se alineaban con los parámetros. En este ejemplo, solo 71 de las 5385 pistas identificadas se alinearon con los parámetros. Esta proporción es normal, dadas pautas tan estrictas. Este número de huellas también está en línea con el número de amebas utilizadas en este protocolo (por ejemplo, si una placa de 96 pocillos se siembra con 200 μL de 7,5 x 103 UFC/mL por pocillo, entonces se debe esperar alrededor de 1.500 amebas en el pocillo y aproximadamente esa cantidad visible en un campo de visión de 4 puntos. Es probable que haya muchas más huellas que amebas, ya que las amebas caminan dentro y fuera del campo de visión, generando nuevas huellas). Este número de pista vuelve a ser evidente en la Figura 2, donde solo unas pocas pistas son visibles en comparación con un gran número de puntos. Compruebe siempre el número de puntos en la pista (cuadro rojo) para asegurarse de que solo se incluyen las longitudes de pista correctas. Por ejemplo, aquí, incluimos más del 93% de los fotogramas, y había 127 fotogramas en esta sección, por lo que todos los números de puntos deben estar por encima de 118. Resaltadas en amarillo están las medidas que se mencionaron en el protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig04.jpg"> Figura 4: Datos reorganizados según sea necesario después de la salida de datos inicial. Organización de los datos deseados después de la exportación. (A) Las mediciones pertinentes elegidas para cuantificar se copiaron de la exportación del software de seguimiento (Figura 3) y se pegaron en una nueva hoja de cálculo. (B) Después de que las mediciones deseadas se hayan organizado en la nueva hoja de cálculo, se debe calcular el promedio de cada pista. Por lo tanto, en este ejemplo representativo, la distancia total, la distancia máxima, el confinamiento, la velocidad media y el desplazamiento de cada pista utilizable en este video singular se han promediado a un número singular para cada medición. Nótese de nuevo aquí que un total de 71 pistas cumplían los parámetros de los fotogramas 1-127. Es probable que haya un número diferente de pistas adecuadas de cada vídeo o conjunto de fotogramas analizado, como se evidencia en la Figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig05.jpg"> Figura 5: Fotogramas secuenciales establecidos para el análisis de una serie completa de imágenes o vídeo. Esta es una imagen representativa de la adición de videos secuenciales al análisis de datos. Suponiendo que los fotogramas 1-127 constituyen la Hora 1 del vídeo (aquí, 1 h se compone de tomar una imagen una vez cada 28 s). Los fotogramas 128 a 254 serán la hora 2 de vídeo y los fotogramas 255 a 381 serán la hora 3 de vídeo. Combine los datos exportados (como se exportó en la Figura 3) de todas las horas en una hoja para trabajar con todos a la vez. Como se hizo en la Figura 4, se promediarán los datos de todas las pistas utilizables para cada conjunto de fotogramas/h. Todo lo que se muestra en la Figura 5 son los datos de una réplica o una muestra. Si hay 3 réplicas, habrá 3 pestañas de hoja de cálculo separadas dispuestas de manera idéntica, y los datos de estas se introducirán en una nueva pestaña, como se muestra en la figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig06.jpg"> Figura 6: Datos compuestos de todas las amebas de cada conjunto de fotogramas utilizados para representar una sola réplica. (A) Todos los promedios de cada cuadro establecido en la Figura 5 deben recopilarse en una ubicación central para que se pueda completar el análisis final de los datos. En esta imagen representativa, se muestran los promedios de distancia total de los tres primeros conjuntos de fotogramas (u horas). Esto se debe repetir para cada muestra/condición/réplica que se esté ejecutando. A continuación, se deben promediar los promedios de cada muestra de cada conjunto de fotogramas (cuadro amarillo). Este es el punto de datos final a partir del cual se pueden calcular la desviación estándar y el error estándar. Los promedios individuales de cada muestra (aquí, los números en B3, B4 y B5 para la muestra de distancia total 1; C3, C4 y C5 para la muestra de distancia total 2, etc.) se utilizará para ejecutar el análisis estadístico. Este proceso se repetirá para todas las mediciones requeridas (distancia máxima, confinamiento, velocidad media, desplazamiento, etc.) (B) Para hacer una representación gráfica de la cuantificación, use los números en el cuadro amarillo como puntos de datos para usar en el gráfico final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig07.jpg"> Figura 7: Datos brutos de motilidad para ATCC 30461 y ATCC 50370. Los datos brutos (representados aquí como media ± SE por hora) fueron recolectados previamente y no publicados para estudios previos18,19. Esta cuantificación de la motilidad demuestra que estas dos amebas son similares en sus primeras 6 h de motilidad (medida por la distancia total en micras recorrida en esa hora) en la solución de 1/4 de Ringer sobre una superficie de vidrio. Cada punto de tiempo representa tres réplicas separadas, cada una compuesta por 20-200 pistas de ameba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Cuantificación de Acanthamoeba spp. Motilidad

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential ...

quantification-of-acanthamoeba-spp-motility

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El ensayo de motilidad phagokinetic track es un método usado para evaluar el movimiento de las células. Específicamente, el ensayo mide la quimiocinesis (motilidad celular aleatoria) en el tiempo de una manera cuantitativa. El ensayo se aprovecha de la capacidad de las células para crear una pista medible de su movimiento en coloidales de oro revestido con cubreobjetos.

Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic

Fuente: Morales-Soto, N. et. al., Preparación, obtención de imágenes y cuantificación de ensayos de motilidad de la superficie bacteriana. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra un ensayo de enjambre utilizando bacterias que expresan proteína verde fluorescente para observar la motilidad de la superficie en agar blando. Las imágenes de lapso de tiempo capturan la expansión coordinada y la formación de zarcillos, destacando la motilidad de la superficie bacteriana.

Ensayo de enjambre para visualizar la motilidad de la superficie bacteriana

Este video muestra un ensayo para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM). Las células macrófagas están infectadas con los estadios invasivos móviles y no móviles de Leishmania, promastigotes metacíclicos y amastigotes, respectivamente. Los parásitos invaden los macrófagos, se internalizan en una vacuola parasitófora y se multiplican en su interior. El crecimiento intracelular del parásito se cuantifica utilizando un microscopio tras...

Un ensayo in vitro para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos

La motilidad del enjambre está influenciada por factores físicos y ambientales. Describimos un protocolo de dos fases y pautas para sortear los desafíos comúnmente asociados con la preparación de ensayos de enjambre y la recopilación de datos. Se emplea una técnica de imagen macroscópica para obtener información detallada sobre el comportamiento del enjambre que no proporciona las técnicas de análisis actuales.

Preparación, Imaging, y cuantificación de la superficie bacteriana Motilidad ensayos

Muchas bacterias utilizan la motilidad provocada por flagelos para navegar por su entorno y colonizar entornos favorables tanto individualmente como colectivamente. Aquí se demuestra el uso de tres métodos establecidos que explotan la motilidad como una herramienta de selección para identificar componentes / vías que contribuyen a la natación y la motilidad de enjambre.

Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie

Este protocolo describe dos ensayos sensibles para discriminar entre deterioro motor leve, moderado y grave en modelos de esclerosis lateral amiotrófica de C. elegans , con utilidad general para cepas de C. elegans , con motilidad alterada.

Evaluación del deterioro motor en modelos de C. elegans de esclerosis lateral amiotrófica

Aquí, describimos el uso de placas de gradiente inductoras para evaluar la motilidad del enjambre bacteriano y, al mismo tiempo, obtener múltiples respuestas de concentración.

Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras

La kinesina-5 Cin8 mitótica bidireccional se acumula en grupos que se dividen y fusionan durante su motilidad. La acumulación en grupos también cambia la velocidad y direccionalidad de Cin8. Aquí, se describe un protocolo para ensayos de motilidad con Cin8-GFP purificado y análisis de propiedades móviles de moléculas individuales y grupos de Cin8.

Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

Este protocolo describe cómo producir cometas de actina en las superficies de las perlas utilizando ingredientes proteicos disponibles comercialmente. Tales sistemas imitan las estructuras protrusivas que se encuentran en las células, y se pueden utilizar para examinar los mecanismos fisiológicos de la producción de fuerza de una manera simplificada.

Reconstitución de la motilidad basada en actina con proteínas disponibles comercialmente

Este protocolo presenta un método rápido y eficiente para identificar los factores genéticos involucrados en varios tipos de motilidades en Pseudomonas aeruginosa.

Método de alto rendimiento para observar fenotipos de motilidad en Pseudomonas aeruginosa

Aprende a cuantificar la motilidad de Acanthamoeba spp. mediante microscopía y análisis de imágenes de alto contenido. Este método computacional permite modelar infecciones y mejorar las prácticas de higiene en lentes de contacto.

Cuantificación de Acanthamoeba spp. Motilidad

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