Name: Adaptación en los Extremos de la Vida: Evolución Experimental con el Arqueón Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Descubre cómo estudiar la evolución de microbios termófilos mediante experimentos controlados con Sulfolobus acidocaldarius. Este protocolo de alto rendimiento utiliza termomezcladores para analizar la adaptación en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo experimental de evolución para la adaptación de termófilos mediante termomezcladores de bajo coste

<ol><li>Nisbet, E. G., Sleep, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+habitat+and+nature+of+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The habitat and nature of early life.</a> Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).</li>
<li>Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Beagle+in+a+bottle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Beagle in a bottle.</a> Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).</li>
<li>Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+and+the+dynamics+of+adaptation+and+genome+evolution+in+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations.</a> ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).</li>
<li>McDonald, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+experimental+evolution+-+a+proving+ground+for+evolutionary+theory+and+a+tool+for+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Microbial experimental evolution - a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery.</a> EMBO Rep. 20 (8), e46992(2019).</li>
<li>Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+design%2C+population+dynamics%2C+and+diversity+in+microbial+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).</li>
<li>McCarthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+limits+of+thermoacidophily+in+the+archaeon+Sulfolobus+solfataricus+by+adaptive+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution.</a> Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+question+of+DNA+repair+in+hyperthermophilic+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea.</a> Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).</li>
<li>Whitaker, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+through+the+lens+of+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Mineral+Geochem%22%5BJournal%5D)">Population dynamics through the lens of extreme environments.</a> Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).</li>
<li>Peeters, E., Thia-Toong, T. -L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ss-LrpB%2C+a+novel+Lrp-like+regulator+of+Sulfolobus+solfataricus+P2%2C+binds+cooperatively+to+three+conserved+targets+in+its+own+control+region%3A+Ss-LrpB-operator+interactions+for+autoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation.</a> Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).</li>
<li>Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -V., Siebers, B., Spadiut, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfolobus+-+A+potential+key+organism+in+future+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sulfolobus - A potential key organism in future biotechnology.</a> Front Microbiol. 8, 2474(2017).</li>
<li>Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+edge%3A+Bioprospecting+extremophiles+for+astrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Indian+Inst+Sci%22%5BJournal%5D)">Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology.</a> J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Sulfolobus+acidocaldarius%2C+a+model+organism+of+the+Crenarchaeota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota.</a> J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).</li>
<li>Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+characterization+of+Sulfolobus+acidocaldarius+in+a+controlled+bioreactor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment.</a> Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532(2021).</li>
<li>Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+heat+shock+response+for+the+thermoacidophilic+model+crenarchaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophiles+and+the+problem+of+DNA+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophiles and the problem of DNA instability.</a> Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+DNA+repair+in+hyperthermophilic+archaea%3A+Persistent+gaps+and+other+reasons+to+focus+on+the+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork.</a> Archaea. 2015, 942605(2015).</li>
<li>Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+dangerous+missense%3A+Thermophiles+display+especially+low+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates.</a> PLoS Genet. 5 (6), e1000520(2009).</li>
<li>Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fidelity+under+harsh+conditions%3A+Analysis+of+spontaneous+mutation+in+the+thermoacidophilic+archaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).</li>
<li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+genetic+tool+box+for+the+Crenarchaeote+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius.</a> Front Microbiol. 3, 214(2012).</li>
<li>Suzuki, S., Kurosawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+gene+encoding+restriction+endonuclease+SuaI+and+development+of+a+host-vector+system+for+the+thermoacidophilic+archaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).</li>
<li>Baes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+translational+dynamics+underlying+heat+shock+response+in+the+thermophilic+crenarchaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> mBio. 14 (5), e0359322(2023).</li>
<li>González, A. G., Pérez Y Terrón, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+extremophilic+microorganisms+in+biogeochemical+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22GSC+Adv+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles.</a> GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).</li>
<li>Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfolobus%3A+A+new+genus+of+sulfur-oxidizing+bacteria+living+at+low+pH+and+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Mikrobiol%22%5BJournal%5D)">Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature.</a> Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).</li>
<li>Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+experimental+evolution+in+Escherichia+coli.+I.+Adaptation+and+divergence+during+2%2C000+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Nat%22%5BJournal%5D)">Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations.</a> Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).</li>
<li>Baes, R. Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master's Thesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms">https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms</a> (2018).</li>
<li>Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+impact+of+population+bottlenecks+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution.</a> Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).</li>
<li>Bernander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+of+Sulfolobus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cell cycle of Sulfolobus.</a> Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).</li>
<li>Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+and+the+fate+of+beneficial+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations.</a> Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).</li>
<li>Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+sfGFP+variants+with+improved+and+reliable+functionality+in+industrially+important+thermophilic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria.</a> Biotechnol Biofuels. 11, 8(2018).</li>
<li>Visone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+protein+imaging+in+thermophilic+archaea+by+exploiting+a+novel+protein+tag%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag.</a> PLoS One. 12 (10), e0185791(2017).</li>
<li>Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+stable+fluorescent+proteins+for+advanced+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy.</a> Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 y mu; m filtros de membrana accionados por jeringa</td><td>StarLab</td><td>E4780-1226</td><td>Para componentes de medios de esterilización filtrantes que no se pueden esterilizar en autoclave.</td></tr><tr><td>1 y mu; Asas de inoculación L</td><td>Greiner</td><td>731161, 731165 o 731101</td><td>Para la inoculación de cultivos. Se pueden utilizar otros bucles.</td></tr><tr><td>1000 &mu; L puntas de pipeta</td><td>StarLab</td><td>S1111-6811</td><td>Se pueden utilizar otras puntas de pipeta.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2 mL StarLab</td><td></td><td>S1620-2700</td><td>Para el cultivo de S. acidocaldarius en termomezcladores.</td></tr><tr><td>200 &mu; L puntas de pipeta</td><td>StarLab</td><td>S1111-0816</td><td>Se pueden utilizar otras puntas de pipeta.</td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de 50 mL con fondo cónico</td><td>Corning</td><td>430828 o 430829</td> Se <td>pueden utilizar otros tubos. Verifique el rendimiento a 75 &deg;C. Es posible que los tubos con tapas de sello de tapón no permitan una aireación suficiente; Compruébelo antes de usar.</td></tr><tr><td>Jeringa de 50 ml</td><td>BD plastipak</td><td>300865</td><td>Para usar con filtros accionados por jeringa.</td></tr><tr><td>Placas de microtitulación de 96 pocillos (sin tratar, fondo plano)</td><td>Nunc</td><td>260860</td><td>Para medir OD a 600 nm en espectrofotómetro.</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal de ancho ajustable</td><td>Pipet-Lite</td><td>LA8-300XLS</td><td>Opcional, pero ahorra tiempo al transferir entre la microcentrífuga y las placas de 96 pocillos.</td></tr><tr><td>Sulfato de amonio ((NH4)2SO4)</td><td>Millipore</td><td>168355</td><td>para solución madre Brock I.</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Priorclave</td><td>B60-SMART o SV100-BASE</td><td>También se pueden utilizar otros autoclaves.</td></tr><tr><td>Membrana de sellado permeable al gas Breathe-EASY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763624-100EA</td><td>Cortado a medida para usar en tubos de microcentrífuga perforados. Si sustituye otros memrbanes permeables al gas, asegúrese de que el rendimiento sea adecuado a 75 &deg; C</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Para solución madre Brock I.</td></tr><tr><td>CELLSTAR Placas de seis pocillos (suspensión/sin tratar)</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>Es probable que se puedan sustituir las placas de seis pocillos de otros fabricantes. Compruebe el rendimiento a altas temperaturas.</td></tr><tr><td>Sulfato de cobalto (II) heptahidratado (CoSO4&middot; 7H2O)</td><td>Supelco</td><td>1025560100</td><td>para solución madre de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Cloruro de cobre (II) dihidratado (CuCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td>para solución madre de oligoelementos.</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa anhidra (C6H12O6)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11462858</td><td>También se pueden utilizar otros azúcares pentosa y hexosa (por ejemplo, D-xilosa, D-arabinosa). La glucosa no es una fuente de carbono preferida para S. acidocaldarius (SV Albers, comunicación personal)</td></tr><tr><td>Agua bidestilada (ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1101.1000</td><td>La gelrita (goma gellan) se utiliza en lugar de agar para hacer medios sólidos debido a su mayor punto de fusión.</td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidrio de 100 mm</td><td>Marca</td><td>BR455742</td><td>Las placas de Petri de vidrio se utilizan porque la mayoría de las placas de Petri de poliestireno estándar de 90 mm se deforman a 75 & grados; C (depende de la marca). Alternativamente, se pueden usar placas de seis pocillos, ya que no se deforman a altas temperaturas.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>New Brunswick</td><td>Innnova 42R</td><td>También se pueden utilizar otras incubadoras. Verifique la temperatura de funcionamiento del equipo antes de comprarlo/usarlo, ya que muchas incubadoras no pueden alcanzar temperaturas superiores a 65 °C.</td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (III) hexahidratado (FeCl3&middot; 6H2O)</td><td>Supelco</td><td>103943</td><td>para solución madre de Fe</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado (sal de Epsom) (MgSO4&middot; 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Para solución madre Brock I.</td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado (MnCl2&middot; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIALM5005-100G</td><td>para solución madre de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Mini toma Wi-Fi inteligente, monitoreo de energía</td><td>Tapo Tapo</td><td>P110</td><td>Para monitorear el consumo de energía&nbsp;</td></tr><tr><td>N-Z-Amine A - Hidrolizado enzimático de caseína&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0626-500G</td><td>N-Z-Amine-A se utiliza como fuente de aminoácidos.</td></tr><tr><td>Clip (u otro alambre resistente)</td><td>ninguno</td><td>ninguno</td><td>Para perforar tubos de microcentrífuga de 2 ml.</td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno de potasio (fosfato monopotásico) (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Para solución madre Brock I.</td></tr><tr><td>Promega Wizard Kit de purificación de ADN genómico</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Opcional, para extraer ADN genómico en el laboratorio</td></tr><tr><td>Molibdato de sodio dihidratado (Na2MoO4&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651-100G</td><td>para solución madre de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Tetraborato de sodio decahidratado (bórax) (Na2B4O7&middot; 10H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>para solución madre de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>BMG</td><td>SPECTROstar OMEGA</td><td>Para medir OD a 600 nm. Se pueden utilizar otros espectrofotómetros que pueden leer OD a 600 nm.</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (diluido en una proporción de 1:1 con agua) (H2SO4)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11337588</td><td>Se utiliza para ajustar el pH de la solución madre Brock II/III a un pH final de 2/3.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>DLab</td><td>HM100-Pro</td><td>También se pueden utilizar otros termomezcladores; La consideración clave es la capacidad de mantener 65&ndash; 75 &deg; Temperaturas C y 400 RPM</td></tr><tr><td>Uracilo (C4H4N2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>La deleción de pyrE es un marcador genético común utilizado en S. acidocaldarius. Las cepas de deleción deben complementarse con uracilo para el crecimiento. La suplementación no es estrictamente necesaria para la cepa de tipo salvaje DSM639, pero se incluye aquí ya que los experimentos futuros pueden incluir cepas de deleción.</td></tr><tr><td>Sulfato de vanadilo dihidratado (VOSO4&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204862</td><td>para solución madre de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4&middot; 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td>para solución madre de oligoelementos.</td></tr></tbody></table>

adaptación en los extremos de la vida: evolución experimental con el arqueón extremófilo sulfolobus acidocaldarius

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Mediciones de la curva de crecimiento Las curvas de crecimiento para S. acidocaldarius DSM639 se muestran en la Figura 3A. Se encontró que el crecimiento fue similar al comparar la incubación con termomezcladores con la de las incubadoras convencionales. Los parámetros de la tasa de crecimiento promedio se estimaron ajustando una curva logística a cada curva de crecimiento replicada y calculando la media y el error estándar. Los tiempos hasta la fase exponencial media en la termomezcladora y la incubadora fueron de 27,2 h ± 1,1 h y de 31,1 h ± 1,9 h, respectivamente. Los tiempos de duplicación inicial estimados para el termomezclador y la incubadora a 75 °C fueron de 4,29 h ± 0,28 h y 4,19 h ± 0,44 h, respectivamente, lo que concuerda con los valores publicados anteriormente24. La relación entre log10 (OD600nm) y log10(CFU) fue bien caracterizada por un modelo lineal (ajustado R2 = 0.82, F(1,22) = 104, p &lt; 0.00001, pendiente = 1.73 ± 0.17, intersección = 9.73 ± 0.14). Por lo tanto, la relación entre OD600 nm y CFU viene dada por la fórmula UFC = 10 (1,73 × log10 (OD600 nm) + 9,73). Por lo tanto, un diámetro exterior de600 nm de 0,3 corresponde aproximadamente a 6,7 × 108 UFC/ml (Figura 3B).
Experimento de evolución de la temperatura Se iniciaron tres condiciones de temperatura, constante 75 °C, constante 65 °C y caída de temperatura (75-65 °C, disminuyendo en 1 °C cada dos transferencias), utilizando siete linajes independientes derivados de S. acidocaldarius DSM639. Se tomaron mediciones de600 nm de diámetro exterior después de cada transferencia durante los 45 días del experimento (aproximadamente 150 generaciones a 75 °C) y se muestran en la Figura 4. Las mediciones deOD 600 nm tomadas a lo largo de los días son inherentemente ruidosas, ya que pueden estar sujetas a diferencias sutiles en, por ejemplo, el período de crecimiento, la temperatura, etc. Sin embargo, las mediciones realizadas a lo largo de los días pueden ser útiles para evaluar la viabilidad de la población, así como para dar una indicación de si la condición física está mejorando con el tiempo. Los linajes de la condición constante de 75 °C aumentaron enDO 600 nm de un rango inicial de 0,125-0,3 a un rango de 0,248-0,471 al final del experimento. Esto sugiere que la condición física ha mejorado con este tratamiento. Por el contrario, los linajes del tratamiento constante de 65 °C mostraron una caída en el diámetro exterior de600 nm, desde un rango inicial de 0,018-0,087 a 0,008-0,04 en el punto de tiempo final. Esto sugiere que las poblaciones no fueron capaces de adaptarse a la temperatura constante de 65 °C, aunque el hecho de que los organismos viables pudieran recuperarse muestra que las poblaciones no fueron eliminadas a través de diluciones sucesivas, lo que sugiere cierto grado de adaptación. Finalmente, las poblaciones en el tratamiento de descenso de temperatura aumentaron desde el rango inicial deDO 600nm de 0.099-0.279 a 0.3-0.39 en Tx6 (correspondiente a 288 h y 73 °C en este tratamiento), seguido de una disminución constante a un rango de 0.003-0.024 en el punto de tiempo final.
Ensayos de crecimiento/aptitud física Se realizaron ensayos de aptitud para cada población descendiente siguiendo los experimentos de evolución. Se ensayó un diámetro exterior de600 nm después de 48 h de crecimiento para los siete linajes independientes, seguido de un ajuste de modelos lineales en R para cada temperatura de ensayo, con "entorno de selección" como efecto principal y "replicación/termomezclador" como efecto de bloque. El crecimiento de la cepa ancestral se utilizó como nivel de referencia para los contrastes de tratamiento. Los datos se muestran en la Figura 5.
Cuando se ensayó a 75 °C, hubo en promedio aumentos significativos en la aptitud sobre la cepa ancestral para los linajes de los tratamientos constantes de 75 °C (prueba t: t210 = 3.64, p = 0.0003) y constantes de 65 °C (prueba t: t210 = 2.8, p = 0.005), pero no del tratamiento de caída de temperatura (prueba t: t210 = −0.87, p=0,38). Cuando se ensayaron a 65 °C, en promedio, los linajes de todos los tratamientos mostraron un aumento en la aptitud (linajes constantes de 75 °C; prueba t: t210 = 4.68, p&lt;0.0001, linajes constantes de 65 °C; Prueba T: t210, = 4.24, p&lt;0.0001, linajes de caída de temperatura; Prueba t: t210 = 3,15, p = 0,002). Sin embargo, para ambas temperaturas de ensayo, hubo diferencias considerables entre los linajes en su aptitud (Figura 5). Algunos linajes no diferían considerablemente de la cepa ancestral o habían disminuido su aptitud; Esto fue particularmente evidente para los linajes del tratamiento de caída de temperatura.
Vale la pena señalar que la relación entre OD600nm y CFU/mL podría haber cambiado durante el experimento de evolución. Esto se puede evaluar determinando los parámetros de crecimiento de los linajes evolucionados (siguiendo los pasos 3.1-3.10).
Resultados de la secuenciación del genoma completo El análisis del genoma completo se llevó a cabo utilizando breseq (versión 0.38.1)25 en los siete linajes de la condición constante de 75 °C utilizando el genoma de referencia de S. acidocaldarius DSM639 (acceso RefSeq NC_007181.1). Se reveló una variedad de mutaciones que involucran inserciones, deleciones y polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en los genomas de todos los linajes descendientes (Tabla 2). Las mutaciones de inserción múltiple y no sinónimas se produjeron en genes codificadores de proteínas, así como en regiones intergénicas que pueden influir en la expresión génica debido a cambios de marco en las regiones promotoras de los genes. Algunas de las mutaciones fueron consistentes en múltiples linajes descendientes en genes involucrados en diversas funciones como la biosíntesis de la pared celular, la transcripción, el metabolismo, el transporte celular y la actividad catalítica (Tabla 2). Entre estas mutaciones había una gran deleción de 54.667 pares de bases en cinco de los siete linajes; Esto fue confirmado por un diagrama de evidencia de cobertura faltante para cada población (frecuencia que osciló entre el 93,2% y el 100%). La región delecionada equivale a una pérdida de 53 genes; El papel de estos genes en la adaptación se investigará en futuros estudios. Se observaron algunas diferencias entre el aislado utilizado del DSM639 y la secuencia de referencia publicada (que se muestra en la Tabla Suplementaria 1).
Consumo de energía de la incubadora de agitación frente a la termomezcladora El consumo de energía de una incubadora vibratoria se comparó con el de una termomezcladora que utiliza un enchufe inteligente de monitoreo de energía disponible en el mercado en un rango de temperaturas de incubación comunes y la temperatura de 75 °C utilizada aquí. A 75 °C, el termomezclador consumió aproximadamente 1/40de la energía de una incubadora de agitación tradicional (Figura 6), lo que sugiere que los termomezcladores son un medio potencial para reducir la huella de carbono asociada con la evolución experimental.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig01v2.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo que ilustra el protocolo del experimento de evolución a través de tres tratamientos de temperatura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig02v2.jpg"> Figura 2: Diagrama de flujo que ilustra los pasos del protocolo de ensayo de crecimiento/aptitud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig03.jpg"> Figura 3: Determinación de los parámetros clave de crecimiento y comparación de los dispositivos de incubación para S. acidocaldarius DSM639. Se cultivaron tres cultivos replicados a 75 °C en 7 tubos separados. Se utilizó un muestreo destructivo para medir (A) OD600 nm (medias ± error estándar de n = 3 réplicas técnicas; algunas barras de error son más pequeñas que los símbolos de trazado); las curvas representan modelos de crecimiento logístico ajustados y (B) unidades formadoras de colonias (UFC); Las líneas representan modelos de regresión lineal log-log ajustados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos de las densidades ópticas (OD600nm) obtenidas durante los experimentos de evolución. Densidades ópticas de linajes independientes medidas durante los experimentos de evolución bajo tres tratamientos de temperatura (constante 65 °C, constante 75 °C, caída 75 °C-65 °C) realizados durante aproximadamente 150 generaciones. Las curvas representan los suavizados de Loess a lo largo del tiempo para cada linaje independiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig05.jpg"> Figura 5: Resultados representativos de los ensayos de crecimiento. Ensayos de crecimiento para linajes independientes derivados de S. acidocaldarius DSM639 siguiendo experimentos de evolución de la temperatura (constante 65 °C, constante 75 °C, caída 75 °C-65 °C) en comparación con la cepa antecesora. Para todos los linajes, el crecimiento se ensayó a 65 °C y 75 °C. Los puntos coloreados muestran la media ± el error estándar de las réplicas técnicas (se muestran en gris, n = 12 para el ancestro y n = 3 para cada linaje evolucionado). La barra gris denota la media ± el error estándar de la aptitud ancestral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig06.jpg"> Figura 6: Consumo de energía de la incubadora tradicional frente a los dispositivos termomezcladores. El consumo de energía se registró utilizando un enchufe inteligente de monitoreo de energía disponible en el mercado durante 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>
Tabla 1: Recetas de medios y soluciones madre necesarias para cultivar S. acidocaldarius. Todos los medios y soluciones madre deben elaborarse con H2O (ddH2O) de doble destilación y luego esterilizarse mediante autoclave o esterilización por filtro a través de un filtro de 0,22 μm, como se indica. Consulte la sección 1 del protocolo para obtener una descripción detallada de cómo preparar todas las soluciones de medios y existencias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Resultados representativos de la secuenciación del genoma completo de los linajes descendientes.Mutaciones encontradas en linajes descendientes de S. acidocaldarius DSM639 a partir de un tratamiento constante a 75 °C. Las mutaciones indican cambios en relación con el ancestro directo del linaje, que posee varios cambios en relación con la secuencia de referencia para S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; las mutaciones en el ancestro se muestran en la Tabla Suplementaria 1). n indica el número de linajes en los que se encontró una mutación. → gen en el 'marco de lectura hacia adelante'; ← gen en el 'marco de lectura inverso'. †Estos cambios son relativos a un desplazamiento de marco (A)10→11 presente en el aislado de S. acidocaldarius DSM639 (Tabla suplementaria 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla suplementaria 1: Mutaciones presentes en el aislado de S. acidocaldarius DSM639 en relación con la secuencia de referencia (acceso RefSeq NC_007181.1). → gen en el 'marco de lectura hacia adelante'; ← gen en el 'marco de lectura inverso'. ‡SACI_RS04020 se anota como un pseudogen en NC_007181.1, pero la mutación Δ1 bp frameshift observada aquí supuestamente restaura su función, ya que con la mutación, codifica una proteína con un 100% de identidad con el gen de la girasa inversa rgy (acceso RefSeq WP_176586667.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Supplementary%20Table-1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Adaptación en los Extremos de la Vida: Evolución Experimental con el Arqueón Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures ...

adaptation-at-extremes-life-experimental-evolution-with-extremophile

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A continuación, se presenta un protocolo para obtener la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos bajo condiciones de cultivo utilizando quimiostato. Además, se discute el análisis genómico de la cepa evolucionado.

Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato

El aislamiento de microbios resistentes a metales pesados de las fuentes geotérmicas es un tema candente para el desarrollo de biosistemas de biorremediación y monitoreo ambiental. Este estudio proporciona un enfoque metodológico para aislar e identificar bacterias tolerantes a metales pesados de aguas termales.

Bioprospección de microorganismos extremófilos para hacer frente a la contaminación ambiental

Este video muestra las técnicas para el etiquetado de las células madre embrionarias y células madre mesenquimales con tintes fluorescentes. Esta técnica se puede utilizar para un seguimiento in vivo de las células madre trasplantadas con técnicas de imagen óptico y de las correlaciones histopatológico con microscopía de fluorescencia.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Aquí se presenta la generación de Tre recombinasa a través de las instrucciones, la evolución molecular. Tre recombinasa reconoce una secuencia de destino predefinido dentro de las secuencias LTR del provirus VIH-1, dando lugar a la escisión y la erradicación de la provirus de las células humanas infectadas. Aunque todavía en sus inicios, la evolución molecular dirigida a permitir la creación de enzimas personalizados que servirán de instrumentos de cirugía molecular y la medicina molecular.

Evolución molecular de la recombinasa Tre

En este protocolo se presenta un método para...

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Células epiteliales nasales, obtenidas mediante biopsia raspadura superficial de voluntarios humanos, se expanden y se transfieren a insertos de cultivo de tejidos. Al llegar a la confluencia, las células se cultivan en la interfase aire-líquido, produciendo cultivos de células ciliadas y no ciliadas. Cultivos de células epiteliales nasales diferenciados proporcionan modelos experimentales viables para el estudio de la mucosa respiratoria.

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

Se describe una técnica para el análisis de la síntesis del ARN mundial en la hipoxia utilizando imágenes. Click-química etiquetado de ARN previamente no se ha realizado en condiciones de hipoxia y permite la visualización de los cambios globales en el nivel de ARN de una sola célula. Este enfoque complementa las técnicas de ARN promediados existentes, lo que permite la visualización directa de célula a célula de los cambios en la síntesis de ARN mundial.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Fluoróforos individuales pueden ser localizados con precisión nanométrica utilizando FIONA. Aquí se reporta un resumen de la técnica de FIONA, y la forma de llevar a cabo experimentos de FIONA se describe.

Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

La luz de xenón no coherente se hizo pasar a través de filtros de interferencia de banda estrecha y densidad neutra para entregar luz de longitud de onda e intensidad variables a las células cultivadas. Este protocolo se utilizó para evaluar los efectos de la terapia con luz roja/infrarrojo cercano sobre la producción de especies reactivas in vitro: no se observaron efectos utilizando los parámetros probados.

Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo In Vitro

Los mecanismos moleculares de la descondensación de la cromatina mitótica altamente compactada están mal definidos. Presentamos un ensayo libre de células basado en clústeres de cromatina mitótica aislados de células HeLa y extracto de huevo de Xenopus laevis que reconstituye fielmente el proceso de descondensación in vitro.

Una célula de ensayo libre para el Estudio de la cromatina descondensación en la final de la mitosis

Descubre cómo estudiar la evolución de microbios termófilos mediante experimentos controlados con Sulfolobus acidocaldarius. Este protocolo de alto rendimiento utiliza termomezcladores para analizar la adaptación en tiempo real.

Adaptación en los Extremos de la Vida: Evolución Experimental con el Arqueón Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

Explorar más videos