Predicción computacional de las preferencias de aminoácidos de dominios de unión a péptidos potencialmente multiespecíficos implicados en las interacciones proteína-proteína

Proponemos un protocolo para la predicción computacional de preferencias de aminoácidos en interacciones proteína-proteína más específicas. Este protocolo puede ser considerado como un primer paso en el diseño de mediadores de estas interacciones. Estamos interesados en utilizar estos mediadores como potenciales inhibidores de interacciones específicas, en inmunología tecnóloga.

Nuestro implementador utilizado para caracterizar las preferencias de aminoácidos entre los sitios de unión específicos es costoso y engorroso. Nuestro protocolo es una tecnología bio-respaldada basada en la eficiencia y las operaciones en serie. Esta estrategia tiene el potencial de procesar un gran número de secuencias de líneas, proporcionando una diferencia completa y consistente de preferencias de aminoácidos.

Nuestro protocolo ofrece un profesional rentable mediante el procesamiento de un gran número de secuencias de ADN preferidas sobre un más completo del número típicamente limitado de secuencias, procesos en enfoques de laboratorio web. Además del desarrollo de inhibidores de productos inmunológicos, nos gustaría comparar el rendimiento de esta metodología con otras familias de productos. Esto nos permitirá comprender mejor las bases estructurales de la multiespecificidad, no solo en el contexto inmunológico, sino también en otras funciones celulares, como la señalización y la comunicación.

Comience por descargar la estructura del complejo proteína-proteína. Para ello, vaya a la página de inicio del banco de datos de proteínas e introduzca el ID de PDB en el cuadro de búsqueda principal. En la página principal de la estructura, haga clic en Descargar archivos y, a continuación, en Ensamblaje biológico 1 para descargar los archivos en formato PDB gz.

Abra la estructura descargada en UCSF Chimera. Vaya a Herramientas, luego a Edición de estructura y haga clic en Cambiar ID de cadena. Cambie el nombre de la segunda cadena inicialmente etiquetada como A, a B.Luego, haga clic en Favoritos, seguido de Panel de modelo.

Seleccione el modelo con las dos cadenas y haga clic en el botón agrupar/desagrupar para separar cada cadena en un modelo diferente. A continuación, seleccione los dos modelos y haga clic en el botón copiar/combinar. Introduzca un nuevo nombre para el modelo combinado.

Marque Cerrar modelos de origen y haga clic en Aceptar. Haga clic en Seleccionar, luego en Cadena y confirme que las cadenas del dímero ahora se identifican como A y B.Haga clic en Archivo y guarde PDB para guardar la estructura editada como un nuevo archivo PDB. Para identificar el segmento objetivo en la proteína ligando, navegue hasta el servidor de escaneo de alanina BUDE. Haga clic en el botón Elegir archivo en Carga de estructura y cargue el archivo PDB guardado.

En la página siguiente, compruebe que la estructura se ha cargado correctamente y escriba un nombre para el trabajo en el servidor. Establezca las cadenas A como receptor y B como ligando, y haga clic en el botón Iniciar escaneo para enviar el trabajo. Una vez finalizado el trabajo, haga clic en Mostrar resultados para abrir la página de Resultados.

En la lista de residuos, seleccione el tramo de residuos que se prevé que interactúe mejor con la superficie de unión de destino. Utilizando este protocolo se predijo el uso de un segmento de aminoácidos que interactúa con la superficie de unión de IRF5. Utilizando mutagénesis computacional de barrido de alanina, se predijo un segmento de 13 aminoácidos desde las posiciones 424 a 436, con el motivo p L x IS a partir de la arginina 432.

Para comenzar, prepare la interfaz peptídica de la proteína para la diversificación de secuencias. Abra el archivo PDB en Chimera y asegúrese de que la estructura de las subunidades objetivo esté intacta y que no falten átomos o enlaces. Para eliminar todas las moléculas no esenciales de la estructura, haga clic en Seleccionar, luego en Residuos y, a continuación, seleccione todas las moléculas que no sean aminoácidos estándar.

A continuación, haga clic en Acciones seguidas de Adams/Bonds y elimine. A continuación, haga clic en Favoritos, en Secuencia, y luego haga clic en la cadena considerada como el ligando. Recorte la cadena de ligandos al segmento interactivo identificado eliminando todos los residuos excepto los que se encuentran entre las posiciones seleccionadas.

Haga clic en Archivo y guardar PDB para guardar la estructura editada en un archivo PDB diferente. Copie este archivo en una ubicación de Linux a la que puedan acceder las aplicaciones de Rosetta. Utilice la aplicación fixedbb de Rosetta para realizar un reempaquetado de todas las cadenas laterales de aminoácidos de la estructura base antes de la diversificación de la secuencia, ejecutando este comando.

A continuación, cambie el nombre del archivo PDB de reempaquetado con un sufijo _ repack mediante el siguiente comando. A continuación, ejecute pepspec en modo de diseño para realizar la diversificación de secuencias mediante este comando. A continuación, genere un pwm utilizando el gen pepspec pwm.

py script incluido en la suite Rosetta. Para ejecutar este script, utilice el siguiente comando. Para crear un logotipo de secuencia, abra el archivo con las secuencias de péptidos generadas en el paso anterior con un editor de texto preferido y copie todas las secuencias.

Vaya al servidor WebLogo y pegue las secuencias en el cuadro de texto Alineación de secuencia múltiple. Elija el formato y el tamaño deseados del logotipo de acuerdo con la longitud de entrada y haga clic en Crear logotipo. Utilizando este protocolo, se predijeron las preferencias de aminoácidos para el motivo p L x IS conservado en la superficie de unión de IRF5.

La posición, la matriz de peso y el logotipo de la secuencia generados tras la diversificación de la secuencia mostraron una preferencia por el glutamato en la posición 432, y por la leucina y la isoleucina en las posiciones 433 y 435. Las posiciones 427, 429 y 436, típicamente ocupadas por serina, mostraron una mayor preferencia por el aspartato y el glutamato, destacando el papel de la fosforilación y la dimerización de IRF5. La posición 425 mostró una alta preferencia por la serina, lo que sugiere su participación en la interacción proteína-proteína en su forma no fosforilada.