Name: Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 40 s
Description: Aprende a realizar inyección intrafemoral de células madre hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos. Este método mejora el injerto celular y permite estudiar la hematopoyesis humana en desarrollo y enfermedad.

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<meta charset="utf8"></head><body>Inyección de HSPC humanas en el fémur de ratones irradiados subletalmente

<ol><li>Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics in man.</a> J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).</li>
<li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).</li>
<li>Laurenti, E., Göttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li>
<li>Cosgrove, J., Hustin, L. S. P., de Boer, R. J., Perié, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis+in+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis in numbers.</a> Trends Immunol. 42 (12), 1100-1112 (2021).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9 (7), 959-963 (2003).</li>
<li>McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+short-term+repopulating+stem+cells+are+efficiently+detected+following+intrafemoral+transplantation+into+NOD%2FSCID+recipients+depleted+of+CD122%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells.</a> Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. 333 (6039), 218-221 (2011).</li>
<li>Belluschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelo-lymphoid+lineage+restriction+occurs+in+the+human+haematopoietic+stem+cell+compartment+before+lymphoid-primed+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Myelo-lymphoid lineage restriction occurs in the human haematopoietic stem cell compartment before lymphoid-primed multipotent progenitors.</a> Nat Commun. 9 (1), 4100(2018).</li>
<li>McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+cord+blood+engraftment+between+immunocompromised+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains.</a> Blood. 116 (2), 193-200 (2010).</li>
<li>Billerbeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+human+CD4%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells+in+human+stem+cell+factor-%2C+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-%2C+and+interleukin-3-expressing+NOD-SCID+IL2R%CE%B3%28null%29+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγ(null) humanized mice.</a> Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 364-372 (2014).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3%E2%88%92%2F%E2%88%92+KitW41%2FW41+%28NBSGW%29+Mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ−/− KitW41/W41 (NBSGW) Mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Notta, F., Doulatov, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+hematopoietic+stem+cells+is+more+efficient+in+female+NOD%2FSCID%2FIL-2Rgc-null+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human hematopoietic stem cells is more efficient in female NOD/SCID/IL-2Rgc-null recipients.</a> Blood. 115 (18), 3704-3707 (2010).</li>
<li>Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+bone+marrow+HSC+transplantation+enhances+local+engraftment+at+the+expense+of+systemic+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice.</a> Sci Rep. 6, 23886(2016).</li>
<li>Mende, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+molecular+and+functional+features+of+extramedullary+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+reservoirs+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Unique molecular and functional features of extramedullary hematopoietic stem and progenitor cell reservoirs in humans.</a> Blood. 139 (23), 3387-3401 (2022).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Eppert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+gene+expression+programs+influence+clinical+outcome+in+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia.</a> Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).</li>
<li>Sanchez, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+xenotransplantation+model+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).</li>
<li>Li, J., Chen, H., Zhao, S., Wen, D., Bi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+intrafemoral+orthotopic+xenografts+of+peripheral+blood+or+bone+marrow+from+acute+myeloid+and+acute+lymphoblastic+leukemia+patients%3A+clinical+characterization%2C+methodology%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-derived intrafemoral orthotopic xenografts of peripheral blood or bone marrow from acute myeloid and acute lymphoblastic leukemia patients: clinical characterization, methodology, and validation.</a> Clin Exp Med. 23 (4), 1293-1306 (2023).</li>
<li>Dobson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse-fated+latent+diagnosis+subclones+in+acute+B+lineage+leukemia+are+drug+tolerant+and+possess+distinct+metabolic+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Relapse-fated latent diagnosis subclones in acute B lineage leukemia are drug tolerant and possess distinct metabolic programs.</a> Cancer Discov. 10 (4), 568-587 (2020).</li>
<li>Marktel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrabone+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+for+adult+and+pediatric+patients+affected+by+transfusion-dependent+%C3%9F-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Intrabone hematopoietic stem cell gene therapy for adult and pediatric patients affected by transfusion-dependent ß-thalassemia.</a> Nat Med. 25 (2), 234-241 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Jeringa de insulina de 0,5 mL con aguja BD de 29 G x 12,7 mm</td><td></td><td>324892</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina de 1 mL con aguja de 29 g x 0,5"</td><td>BD</td><td>324827</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 1,5 mL</td><td>Jeringa</td> de 3 mL <td>509-GRD-PFB</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>HENKE SASS WOLF GMBH</td><td>4020.000V0</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón de filtro de celdas 12 x 75 mm</td><td>Tubo Falcon</td><td>352235</td><td>FACS</td></tr><tr><td>5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón a presión 12 x 75 mm</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>tubo FACS</td></tr><tr><td>27 G Aguja de 1/2"</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>300635</tr><tr><td>40 y micro; Filtro de células m para tubo de 50 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 50 mL</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>placa de fondo redondo de 96 pocillos&nbsp;</td>Hisopo <td>de alcohol 351177</td><td></td> <td>Falcon</td></tr><tr><td></td><td>VITREX MEDICAL A/S</td><td></td><td></td></tr> 520213 <tr><td>BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer&nbsp;</td><td></td><td>Citómetro de</td><td>flujo</td>BD</tr><tr><td>Buphrenorphine</td><td>Animalcare</td><td>XVD190</td><td></td></tr><tr><td>CD14/PECy7 (Clon M5E2)</td><td>biolegend</td><td>301814</td><td>Usado a 1 en 1000</td></tr><tr><td>CD19/Alexa 700 (Clon HIB19)</td><td>biolegend</td><td>302226</td><td>Usado a 1 en 300</td></tr><tr><td>CD19/FITC (Clon HIB19)</td><td>biolegend</td><td>302206</td><td>Usado en 1 en 200</td></tr><tr><td>CD3/APCCy7&nbsp;( clon HIT3a)</td><td>biolegend</td><td>300318</td><td>utilizado a 1 de cada 100</td></tr><tr><td>CD33/APC (clon P67.6)</td><td>BD</td><td>345800</td><td>utilizado a 1 de cada 200</td></tr><tr><td>CD45/BV510 (clon HI30)</td><td>biolegend</td><td>304036</td><td>utilizado a 1 de cada 500</td></tr><tr><td>CD45/PECy5 (clon 2D1)</td><td>biolegend</td><td>368526</td><td>utilizado a 1 de cada 300</td></tr><tr><td>compBeads Anti-Mouse Ig, &kappa;/Conjunto de partículas de compensación de control negativo</td><td>BD</td><td></td><td></td>552843</tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Glicoforina A (GlyA)/PE (clon GA-R2)</td><td>BD</td><td>340947</td><td>utilizado a 1 de cada 1000</td></tr><tr><td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-20250</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo 100% w/w Vapor de inhalación, líquido)</td><td>Zoetis</td><td>115095</td><td></td></tr><tr><td>Microvette&nbsp; 300 Heparina de litio LH, 300 y micro; L</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>20.1309</td><td>Tubo de extracción de sangre de ratón</td></tr><tr><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratones&nbsp;</td><td>Río Charles&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pancoll humano, Densidad: 1.077 g/mL</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190169</td><td></td></tr></tbody></table>

inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos 

Intrafemoral Injection of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells into Immunocompromised Mice

El injerto de las células inyectadas intrafemoralmente puede evaluarse en cualquier momento a partir de las 24 h en función del diseño experimental. En el punto de tiempo final, se pueden recolectar IF, BM, PB y bazos. Estos se pueden procesar y evaluar el nivel de injerto mediante citometría de flujo. Para denominar de forma robusta al injerto humano incluso a niveles bajos, teñimos con dos anticuerpos distintos contra CD45 humano (clon HI30 y clon 2D1). Solo las células positivas para ambos anticuerpos (CD45++</su...

Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos 

Hematopoietic stem cells (HSCs) are defined by their lifelong ability to produce all blood cell types. This is operationally tested by transplanting cell ...

intrafemoral-injection-human-hematopoietic-stem-progenitor-cells-into

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Este video muestra una técnica para generar ratones del sistema inmunológico humano (HIS). Las células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+ se aíslan de las células de la capa leucitaria de la sangre del cordón umbilical humano mediante perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Las HSC CD34+ se expanden en un medio de crecimiento enriquecido con citocinas y criopreservado. Finalmente, las HSC descongeladas se inyectan en una cría de ratón inmunodeficiente para establecer el modelo de ratón HIS.

Aislamiento de células madre hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical para generar ratones del sistema inmunitario humano

Este protocolo describe un procedimiento para la toma de muestras en serie de médula ósea femoral (BM) sin requerir el sacrificio de ratones. Este procedimiento facilita los estudios longitudinales de la composición de la BM de los ratones a lo largo del tiempo y proporciona acceso en serie a las células dentro de la BM para estudios ex vivo y de trasplante.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Describimos una célula mononuclear de sangre periférica humana (PBMC), modelo de ratón xenoinjerto humanizado basado para la investigación traslacional de inmunooncología. Este protocolo podría servir como una guía general para establecer y caracterizar modelos similares para la evaluación de la terapia I-O.

Un modelo de xenoinjerto humanizado de sangre periférica humana (PBMC) para la investigación de inmunooncología traslacional (I-O)

Aquí se describen tres enfoques experimentales para estudiar la dinámica de la infección por VIH en ratones humanizados. El primero permite el estudio de eventos de infección crónica, mientras que los dos últimos permiten el estudio de eventos agudos después de una infección primaria o reactivación viral.

Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados

Este protocolo describe la inyección intrafemoral de unas pocas células madre hematopoyéticas o leucémicas, incluidas las células editadas genéticamente, en modelos de xenoinjertos murinos, lo que no solo permitirá el trasplante rápido y seguro de células, sino también análisis seriados de la médula ósea.

Las inyecciones intrafemorales simplificadas con ratones vivos permiten un análisis continuo de la médula ósea

Aquí, establecimos osteoorganoides in vivo activados por andamios de gelatina cargados con proteína morfogenética ósea 2 para recolectar células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas para la reconstrucción de un sistema hematopoyético e inmunológico dañado. En general, este enfoque puede proporcionar una fuente celular prometedora para las terapias celulares.

Enfoque osteo-organoide in vivo para la recolección de células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas

Aprende a realizar inyección intrafemoral de células madre hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos. Este método mejora el injerto celular y permite estudiar la hematopoyesis humana en desarrollo y enfermedad.

Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos

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