Un flujo de trabajo para la evaluación cuantitativa de los microbiomas bacterianos endófitos y epífitos de la corteza de Populus trichocarpa

[Presentador] Un flujo de trabajo para la evaluación cuantitativa de los microbiomas bacterianos endófitos y epitéticos de la corteza de Populus trichocarpa. Aquí diseñamos y probamos un flujo de trabajo detallado para estudiar el microbioma que coloniza los tejidos internos o las superficies de la corteza de Populus trichocarpa. Este flujo de trabajo describe en detalle el muestreo de los microbiomas endófitos y epitéticos de la corteza de Populus trichocarpa, el procesamiento de los materiales recolectados, la extracción de ADN genómico, la amplificación por PCR de las regiones diana, la preparación de bibliotecas de ADN y la secuenciación de los microbiomas bacterianos endófitos e epitéticos a través de la tecnología de secuenciación de próxima generación. También proporcionamos un breve procedimiento analítico para los datos de secuenciación obtenidos. Este flujo de trabajo probado proporcionará un enfoque eficaz para investigar empíricamente las comunidades de microbioma endófito y epitético de la corteza de Populus trichocarpa y otras especies forestales. Cultive árboles jóvenes de Populus trichocarpa de tres meses en una cámara de crecimiento, corte los segmentos del tallo de 10 centímetros de largo de Populus trichocarpa de dos a 12 centímetros por encima de la superficie del suelo esterilizado con una podadora esterilizada. Coloque los segmentos del tallo en una placa de Petri cuadrada esterilizada. Limpie repetidamente la epidermis del tallo en la placa de Petri cuadrada esterilizada con algodón estéril al 0,1%. Preadolescente 20. Almacene cada pieza de algodón que contenga microorganismos, muestras epitéticas en un tubo centrífugo estéril de 1,5 mililitros a menos 80 grados centígrados. Después de limpiar la superficie del tallo, corte la corteza con un bisturí estéril, retire la corteza y colóquela en una placa de Petri cuadrada. Cortar la corteza desprendida del tallo en segmentos de aproximadamente un centímetro con un bisturí estéril. Esterilice las superficies de los segmentos sumergiéndolos en alcohol al 70% durante dos minutos y luego remoje los segmentos en hipoclorito de sodio con 0.1%, Tween 80 durante cinco minutos. Finalmente, esterilice los gajos en alcohol al 70% durante 30 segundos. Luego lave todas las muestras tres veces con agua destilada estéril y colóquelas en un banco limpio para que se sequen al aire. Almacene cada muestra endófita de corteza de tallo esterilizada en un tubo centrífugo estéril de dos mililitros a menos 80 grados centígrados. Coloque las secciones de corteza del tallo en tubos duros estériles de cinco mililitros y agregue tres perlas de acero esterilizadas en cada tubo. Congele los tubos duros que contienen las muestras en nitrógeno líquido durante 10 minutos. Triture las muestras de corteza durante cinco minutos con un batidor de cuentas. Luego congele el tubo duro nuevamente en nitrógeno líquido durante un minuto y repita el paso de batido de perlas durante cinco minutos. Agregue la corteza del tallo triturado de Populus trichocarpa y las comunidades bacterianas epitéticas adheridas al algodón, 0,25 gramos cada una, a cada uno de los tubos de perlas y luego agregue 60 microlitros de solución C1 suministrada por un kit comercial y mezcle suavemente por inversión. A continuación, homogeneice las muestras endófitas e epitéticas con un batidor de perlas en cuatro ejecuciones de un minuto. Después de cada ejecución, coloque las muestras en hielo durante 30 segundos. Centrifugar los tubos a 10.000 veces la gravedad durante un minuto, extraer las muestras endófitas e epitéticas utilizando un kit siguiendo las instrucciones del fabricante, añadir 30 microlitros de solución C6 al centro de la membrana del filtro blanco e incubar a 25 grados centígrados durante cinco minutos. Centrifugar a 10.000 veces la gravedad a temperatura ambiente durante un minuto. Mida las concentraciones del ADN genómico extraído de muestras epíticas y endófitas utilizando un espectrofotómetro de micro volumen. Diluya cada muestra de ADN con ddH2O estéril a dos nanogramos por microlitro para obtener la plantilla de ADN para la amplificación por PCR. Amplifique la región V5 a V7 del gen bacteriano 16S rRNA utilizando el cebador directo 799F y el cebador inverso 1193R. Mientras tanto, amplifique la región V4 del gen bacteriano 16S rRNA utilizando el cebador directo 5115F y el cebador inverso 806R. Mezcle bien cada muestra y centrifugue para eliminar las burbujas. Realice la amplificación de la región V5 a V7 o V4 de los genes bacterianos de ARNr 16S en un termociclador. Cargue cinco litros de microlitros de cada muestra de Amplicon en un gel de Agarosa al 1% y realice la electroforesis a 120 voltios durante 30 minutos. Vea el gel bajo luces UV para validar la amplificación exitosa de PCR. Para cada muestra, mezcle tres réplicas de los productos de amplificación de PCR en un tubo de PCR. Determine la concentración de los productos amplificados utilizando un kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mida la fluorescencia con un lector de microplacas. Traza una curva de ADN estándar y utilízala para calcular las concentraciones de ADN de los productos amplificados. De acuerdo con su concentración medida, mezcle los productos de PCR obtenidos de las muestras endófitas o epífitas de la corteza de Populus trichocarpa en igual concentración para construir la biblioteca de Amplicon. Realice la electroforesis en gel de agarosa utilizando un aparato de electroforesis. Prepare brevemente un gel de agarosa al 1,3%, 1,3 gramos de polvo de agarosa en 100 mililitros de tampón TAE de una sola vez. Retire los peines después de la solidificación del gel y coloque el gel en un tanque de electroforesis con tampón TAE de una vez. A continuación, agregue una unidad de volumen de seis veces el tampón de carga naranja a cinco unidades de volumen de cada producto de PCR con 100 microlitros de la escalera cargada en cada pocillo. Agregue 30 microlitros de la escalera de ADN a un pozo. Después de conectar los cables positivo y negativo, realice una electroforesis de 80 voltios durante 50 minutos. Extirpe los fragmentos de ADN del gel de agarosa con un bisturí limpio y afilado. Pesa la rodaja de gel y transfiérela a un tubo incoloro. Agregue tampón para sumergir la rebanada de gel. Realice la extracción de gel con el kit de extracción de gel siguiendo las instrucciones del fabricante. Determine la concentración de la biblioteca purificada de Amplicon en un fluorímetro utilizando un kit comercial siguiendo el protocolo del fabricante para la secuenciación de perfiles. Lea tubos de ensayo estándar y de muestra con un fluorímetro y confirme la calidad de la biblioteca visualizando una sola banda. Analice y anote las secuencias del gen 16S rRNA utilizando CHAM II. Realice anotaciones taxonómicas utilizando la base de datos Silver de acuerdo con las secuencias de referencia. Visualice estos resultados utilizando el paquete ggplot2 en R. Se obtuvo ADN genómico de alta calidad de los microbiomas bacterianos endófitos y epitéticos de la corteza de Populus trichocarpa. La amplificación por PCR de las 12 muestras produjo bandas fuertes únicas con el tamaño correcto. La biblioteca Amplicon se construyó además con un solo pico que cumplía con los requisitos de presecuenciación. Para los microbiomas endófitos, se obtuvieron lecturas de alta calidad utilizando los pares de cebadores 799F / 1193R y 515F / 806R respectivamente. El par de cebadores 799F / 1193R produjo significativamente menos lecturas de plantas amplificadas. El número de ASV del microbioma epitético de la corteza de Populus trichocarpa fue significativamente mayor cuando se usaron los cebadores 799F / 1193R en comparación con los cebadores 515F / 806R. Se estimó que el índice de Shannon era más bajo en la comunidad bacteriana epífita de la corteza que en la comunidad bacteriana endófita utilizando el par de cebadores 799F / 1193R. Las características taxonómicas de las comunidades bacterianas en las porciones de corteza endófita y epífita de Populus trichocarpa se exploraron más a fondo utilizando el par de cebadores 799F / 1193R. Se construyó un flujo de trabajo confiable y eficiente desde la recolección de muestras hasta el análisis de datos para cuantificar la composición y diversidad de los microbiomas bacterianos endófitos y epitéticos de la corteza de Populus trichocarpa. Nuestro protocolo puede servir como un camino para estudiar el microbioma de la corteza de las especies de plantas leñosas, permitiendo una mejor comprensión de las características de las comunidades bacterianas que habitan en otras plantas leñosas.