Name: Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprende a monitorizar oscilaciones circadianas en organoides intestinales humanos mediante ensayo de bioluminiscencia. Este método revela diferencias en la ritmicidad según el estado de diferenciación celular.

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Los enteroides intestinales humanos se obtuvieron del laboratorio del Dr. Michael Helmrath en el Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC). Este trabajo contó con el apoyo de R01 DK11005 (CIH) y la financiación piloto del Centro Oncológico de la Universidad de Cincinnati. Estamos agradecidos por el apoyo de imágenes del Centro de Microscopía Viva de la Universidad de Cincinnati (NIH S10OD030402).

Todos los experimentos que utilizaron tejidos humanos para la generación de HIEs fueron aprobados por un IRB en CCHMC (IRB # 2014-0427). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales utilizados en este protocolo.
NOTA: Para ilustrar el procedimiento descrito en este protocolo, utilizamos enteroides intestinales humanos (HIE) Bmal1-luc . Estos enteroides se sometieron a una transducción lentiviral estable22 con el plásmido reportero pABpuro-BluF, que contiene el promotor Bmal1 fusionado con luciferasa, mostrando la actividad del promotor Bmal1 21.
1. Transducción lentiviral
<ol><li>Llevar a cabo la transducción lentiviral22 en condiciones enriquecidas con células madre para HIEs. Específicamente, asegure la formación de esferoides en los HIE dentro de los 3-4 días posteriores al paso en el medio de crecimiento intestinal, lo que crea condiciones enriquecidas con células madre.</li>
	<li>Después de la transducción lentiviral22, realizar la selección de antibióticos con 2 μg/mL de puromicina, recuperar los HIEs resistentes a la puromicina y pasarlos con una densidad relativamente alta (es decir, 1 pozo a 2 pocillos) durante 2-3 veces. Si la tasa de crecimiento de los HIE es lenta, agregue 10 μM de inhibidores de ROCK (Y-27632) y 10 μM de inhibidor de GSK-3 (CHIR-99021) al medio de crecimiento de organoides intestinales.</li>
</ol>2. Preparación de organoides para el ensayo de bioluminiscencia
<ol><li>Día 1: Paso de los HIE a platos redondos de 35 mm.<ol><li>Brevemente, para la expansión de los HIE, mezcle los HIE con una matriz de cultivo 3D reducida por factor de crecimiento (GFR) y siembrórelos en placas de 24 pocillos con tres gotas de 10 μL de matriz de cultivo 3D por pocillo. Agregue 350 μL del medio de crecimiento HIE y cámbielo cada dos días. NOTA: La densidad de HIE en la matriz de cultivo 3D es crítica para el crecimiento de enteroides. Aproximadamente, el número de esferoides debe superar más de 50 en cada gota. Si el número es bajo, la tasa de crecimiento del HIE se ve afectada negativamente.</li>
		<li>Cuando los HIE crezcan lo suficiente (aproximadamente 7 días después del post-paso), recoja los HIE de cuatro pocillos en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Lave los HIE con el PBS frío utilizando una minicentrífuga de sobremesa (2.000 × g) durante un centrifugado rápido de 40 s para eliminar los residuos y el exceso de matriz de cultivo 3D con pipeta.</li>
		<li>Agregue 0,5 mL de PBS frío en el pellet y aplique turbulencia física mediante una jeringa de hasta 10 mL con una jeringa de insulina de 1 mL para disociar los HIE.</li>
		<li>Gire los HIE disociados con una mini centrífuga de sobremesa como en el paso 2.1.3 y retire suavemente el sobrenadante con una pipeta. Luego, coloque el tubo de microcentrífuga con el pellet HIE en hielo para que se enfríe durante aproximadamente 3 minutos.</li>
		<li>Añada la matriz de cultivo GFR 3D al tubo de microcentrífuga y mézclela con el pellet HIE. NOTA: Calcule la cantidad de la matriz de cultivo 3D en función del número de platos redondos de 35 mm que se utilizarán para el experimento. Por lo general, sembramos 30 μL de gotas de matriz de cultivo 3D por plato redondo.</li>
		<li>Siembre la mezcla de HIEs y la matriz de cultivo 3D en el centro del plato redondo de 35 mm e incube el plato a 37 °C durante 20 min para solidificar la matriz de cultivo 3D. NOTA: La densidad de los HIE de siembra debe determinarse experimentalmente. En función de la intensidad de la bioluminiscencia, se puede determinar el número de HIE durante este proceso.</li>
		<li>Agregue 2 mL de medio de crecimiento de organoides intestinales precalentado a cada placa e incube las placas en una incubadora deCO2 hasta el siguiente paso.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 3: Inicio de la diferenciación<ol><li>Para iniciar la diferenciación de los HIE, retire el medio de crecimiento y agregue 2 mL de medio de diferenciación precalentado. NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver las recetas del medio de diferenciación HIE23.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 4: No se requiere ningún proceso adicional.</li>
	<li>Día 5: Reemplace el medio de los enteroides con 2 mL de medio de diferenciación precalentado.</li>
	<li>Día 6: Sincronización del reloj y registro de la bioluminiscencia<ol><li>Para sincronizar el reloj molecular de los enteroides, agregue 2 μL de dexametasona (Dex) de 100 μM para hacer la concentración final de 100 nM en cada placa y luego incube las placas en una incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2) durante 1 h24.</li>
		<li>Durante el restablecimiento de Dex, prepare el luminómetro de incubación. Compruebe elCO2 y la temperatura del luminómetro de incubación y ajústelo al 5% y a 37 °C, respectivamente. NOTA: Se sugiere limpiar el interior del luminómetro de incubación con alcohol al 70% antes y después de cada uso de la máquina para mantenerlo estéril.</li>
		<li>Después de la sincronización del reloj, reponga los enteroides con 3 mL de medio de diferenciación precalentado que contenga 200 μM de D-luciferina. NOTA: Como la luciferina es sensible a la luz, el medio que contiene luciferina debe envolverse con papel de aluminio y precalentarse en un baño de calor a 37 °C antes de aplicarlo al plato.</li>
		<li>Coloque los platos en una mesa de 8 pocillos del luminómetro de incubación y cubra la mesa de platos de muestra con su tapa. Coloque dos cámaras humidificadoras con pañuelo húmedo o esponja en la parte superior de la mesa de platos de muestra. Este es un proceso de una sola vez. NOTA: Una vez iniciado el experimento, la tapa del luminómetro de incubación debe mantenerse cerrada hasta que finalice el experimento. Asegúrate de mojar los pañuelos/esponjas lo suficiente.</li>
		<li>Cierre la tapa de la máquina e inicie el programa para medir la bioluminiscencia durante el número de días y la resolución deseados.<ol><li>En el software, seleccione la configuración de condiciones haciendo clic en la pestaña Condición y ajuste la configuración en este panel: número de platos, tiempo de medición, procesamiento en segundo plano y tipo de filtro. NOTA: Para esta demostración, seleccionamos todos los platos de la A a la H; tiempo de medición predeterminado, que es determinado por el software en función del número de platos; tiempo de espera para el procesamiento en segundo plano y el tipo de filtro F0. Dado que hay tres opciones de filtro, se pueden medir tres colores luminiscentes simultáneamente.</li>
			<li>Después de introducir todos los ajustes adecuados basados en el experimento, guarde los ajustes haciendo clic en Aceptar.</li>
			<li>Para iniciar la ejecución del experimento, haga clic en la pestaña Ejecutar | Botón de inicio (icono de triángulo verde). Observe los datos sin procesar, filtrados por ruido o sin tendencia realizando las selecciones adecuadas en la parte superior de la pantalla del software mientras ejecuta experimentos. Haga clic en las pestañas Sin procesar, Filtrado de ruido o Sin tendencia para observar los datos seleccionados.</li>
			<li>Observe las señales durante un máximo de 5 días. NOTA: Después de 5 días de monitoreo en un luminómetro de incubación, los enteroides pueden comenzar a morir debido al agotamiento del medio. Para evitar cualquier posible interrupción circadiana durante el experimento, no realizamos cambios de medios durante la duración del experimento.</li>
			<li>Al final del experimento, detenga la ejecución haciendo clic en el botón Detener (icono cuadrado azul), vaya a la pestaña Archivo y haga clic en Guardar como. Guarde los datos en el formato Kronos; exporte los datos a una hoja de cálculo en la sección Archivo haciendo clic en la opción Archivo y, a continuación, seleccionando Exportar como formato de Excel en el Archivo para un análisis más detallado.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Optimización de los enteroides intestinales humanos para los estudios del ritmo circadiano

<ol><li>Cox, K. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clock+genes+and+the+transcriptional+architecture+of+the+clock+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism.</a> J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).</li>
<li>Ayyar, V. S., Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms%3A+Influence+on+physiology%2C+pharmacology%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacokinet+Pharmacodyn%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions.</a> J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).</li>
<li>Reppert, S., Weaver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).</li>
<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).</li>
<li>Wolff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+age-dependent+and+tissue-specific+circadian+transcriptome+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice.</a> Cell Rep. 42 (1), 111982(2023).</li>
<li>Ruben, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+tissue-specific+rhythmically+expressed+human+genes+has+potential+applications+in+circadian+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Trans+Med%22%5BJournal%5D)">A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine.</a> Science Trans Med. 10 (458), 8806(2018).</li>
<li>Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+real-time+monitoring+of+circadian+oscillations+in+adult+mouse+brain+slices+to+study+communications+between+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions.</a> STAR Protoc. 2 (2), 100416(2021).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).</li>
<li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).</li>
<li>Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+destabilized+firefly+luciferase+enzyme+for+measurement+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression.</a> Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).</li>
<li>Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell-autonomous+circadian+clock+rhythms+of+gene+expression+using+luciferase+bioluminescence+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters.</a> J Vis Exp. (67), e4234(2012).</li>
<li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li>
<li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent%2C+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li>
<li>Lee, S., Hong, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+model+systems+to+investigate+circadian+clock-related+diseases+and+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments.</a> Front Genet. 13, 874288(2022).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2Fcolonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Rosselot, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+function+of+the+circadian+clock+in+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids.</a> EMBO J. 41 (2), 106973(2021).</li>
<li>Corrò, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A brief history of organoids.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).</li>
<li>Brown, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+period+length+of+fibroblast+circadian+gene+expression+varies+widely+among+human+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Biol%22%5BJournal%5D)">The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals.</a> PLos Biol. 3 (10), e338(2005).</li>
<li>Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+lentiviral+transduction+and+downstream+analysis+of+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids.</a> J Vis Exp. (98), e52531(2015).</li>
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<li>Hara-Miyauchi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+system+for+dynamic+imaging+of+cell+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior.</a> Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).</li>
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<li>Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+enhances+epithelial+barrier+function+in+intestinal+organoids+derived+from+patients+with+Chron%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease.</a> J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

El ensayo de bioluminiscencia ofrece varias ventajas para la investigación de los ritmos circadianos, que requiere la recopilación de datos de experimentos a largo plazo en el tiempo. En primer lugar, permite a los investigadores controlar la expresión génica o la proteína de interés a medida que las células se mueven y proliferan. Sin realizar ajustes innecesarios ni interrumpir las funciones de las células, los eventos celulares interesados o la expresión génica se pueden registrar mediante la lectura de bioluminiscencia, que proporciona datos fiables en tiempo real. Es importante destacar que el ensayo de bioluminiscencia genera un ruido de fondo mínimo en comparación con los ensayos de fluorescencia porque se realiza en oscuridad constante25. Además, el ensayo de bioluminiscencia es preferible para el monitoreo a largo plazo porque la excitación continua para el ensayo de fluorescencia durante varios días puede causar alta fototoxicidad y fotoblanqueo. Sin embargo, debido a la ausencia de excitación de la luz, el ensayo de bioluminiscencia proporciona una señal más tenue que las proteínas de fluorescencia26. La corta vida media de la luciferasa la hace preferible para los estudios circadianos, y puede acortarse aún más añadiendo secuencias desestabilizadoras adicionales12.
A pesar de ofrecer varias ventajas para la monitorización de células vivas, los ensayos de bioluminiscencia tienen algunas limitaciones. Aunque el ensayo de bioluminiscencia proporciona una lectura sólida para la expresión génica temporal o el monitoreo de proteínas de una población de células, su resolución espacial es limitada, lo que lo hace menos factible para los experimentos que recopilan datos de localización de proteínas de células individuales. Teniendo en cuenta sus ventajas y desventajas, el ensayo de bioluminiscencia es superior a otros métodos, especialmente para estudios circadianos; Ofrece menos toxicidad y alta sensibilidad, lo que lo hace ideal para el monitoreo a largo plazo.
Hay que tener en cuenta varios factores críticos durante la fase de preparación experimental. En primer lugar, es fundamental la implementación de una estrategia de selección adecuada para la transducción lentiviral; en nuestro caso, realizamos una selección de 2 μg/mL de puromicina durante 2 semanas. La ejecución inadecuada de la selección puede resultar en un número insuficiente de enteroides que albergan el plásmido reportero, lo que produce niveles de expresión de luciferasa inconsistentes. La densidad óptima de siembra es igualmente importante; Una densidad excesiva puede inducir un agotamiento prematuro de los nutrientes durante el experimento, ya que no hay un reemplazo del medio después del inicio del registro de la bioluminiscencia. Por el contrario, la baja densidad de HIE puede resultar en una reducción de la salida de bioluminiscencia, lo que influye en la robustez de la lectura. Garantizar un entorno adecuado para los enteroides durante el seguimiento es fundamental para la fiabilidad de los resultados experimentales. Mantener las condiciones óptimas, incluidos los niveles deCO2, temperatura y humedad, es fundamental para el mantenimiento de los HIE, lo que promueve la robustez de los procesos celulares dentro de los enteroides. Las desviaciones de la temperatura óptima y los niveles óptimos deCO2 pueden afectar el metabolismo celular y las vías de señalización, lo que puede influir en los ritmos circadianos. Los niveles adecuados de humedad son igualmente importantes, ya que evitan la desecación y mantienen la integridad estructural de los enteroides. Por lo tanto, la atención meticulosa a las condiciones ambientales es fundamental para la precisión del modelo experimental y los estudios circadianos que involucran enteroides.
La sincronización del reloj es esencial para los estudios circadianos, ya que alinea el reloj circadiano interno de las células individuales, asegurando que estén en un estado unificado y coordinado. Esta sincronización es necesaria para la observación y el análisis precisos de la ritmicidad circadiana a nivel de toda una cultura. En este protocolo, realizamos la sincronización del reloj con dexametasona (Dex) de 100 nM. Puede haber algunas preocupaciones sobre el efecto de Dex en la estructura o función de la célula. Investigaciones anteriores sugieren que los corticosteroides mejoran la función de barrera epitelial en los enteroides27. Sin embargo, es importante destacar que este fenotipo se observa después de tratar enteroides con 10 μM de prednisolona durante 12 h. Esperamos que un tratamiento corto de 1 h con dexametasona no induzca cambios significativos con respecto a la estructura y función de las células dentro de los enteroides.
El monitoreo de la actividad de bioluminiscencia del cultivo de organoides en lugar del cultivo unicelular homólogo posee fortalezas únicas. En primer lugar, varios tipos de células interactúan entre sí en un cultivo de organoides como en el tejido in vivo , mientras que un cultivo celular 2D típico monitorea la expresión génica interesada en una especie de entorno aislado que consta de un solo tipo de célula. El cultivo de organoides proporciona resultados más realistas con interacciones multicelulares y vías de señalización. La interacción célula a célula es crítica, especialmente para los estudios de diferenciación y vías intercelulares, que requieren un cultivo celular heterogéneo28. Nuestros resultados indican que los HIE en la condición diferenciada muestran oscilaciones circadianas robustas, pero ritmos circadianos alterados en la condición enriquecida con células madre. Estos datos sugieren una posible remodelación de la maquinaria del reloj circadiano de células madre adultas a células diferenciadas. En resumen, los organoides con un indicador bioluminiscente circadiano permiten investigar los ritmos circadianos en un sistema multicelular in vitro , descubriendo las funciones de los ritmos circadianos de una manera fisiológicamente más relevante.

Reloj circadiano Todos los organismos, desde las bacterias hasta los mamíferos, tienen una relación compleja y dinámica con su entorno. Dentro de esta relación, la adaptación a los cambios ambientales es fundamental para la supervivencia de los organismos. La mayoría de los organismos poseen ritmos circadianos que les permiten adaptarse y optimizar sus funciones a ciclos diurnos de aproximadamente 24 h. El reloj circadiano es una red jerárquica de relojes centrales y periféricos que trabajan en cooperación para mantener la homeostasis fisiológica y mantener a los organismos sincronizados con los cambios diarios 1,2. En los mamíferos, el reloj central o maestro ubicado en el núcleo supraquiasmático (SCN) recibe señales externas, como la luz, y transmite la información a los relojes periféricos a través de una interacción avanzada de vías de señalización neuronal y humoral3. Además del reloj central, los tejidos periféricos poseen su propio mecanismo de reloj circadiano autónomo de las células, mantenido por un bucle de retroalimentación negativa transcripcional-traduccional (TTFL) que regula los genes controlados por reloj específicos de tejido (CCG)4,5. Esta maquinaria molecular produce aproximadamente 24 horas de ritmicidad en eventos celulares y fisiológicos, como expresiones génicas, vías de señalización, respuestas inmunes y digestión. El reloj circadiano está presente en casi todas las células de mamíferos, y se ha demostrado que hasta el 50% de los patrones de expresión de los genes exhiben ritmicidad circadiana6. Teniendo en cuenta la abundancia de CCG, la interrupción de este mecanismo de reloj puede dar lugar a problemas fisiológicos críticos. Por lo tanto, las investigaciones sobre los ritmos circadianos son necesarias para dilucidar los mecanismos biológicos esenciales y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.
Sistema reportero de luciferasa En los estudios circadianos, el monitoreo en tiempo real es fundamental para una mejor comprensión de los comportamientos y respuestas celulares, ya que permite rastrear los cambios temporales en la expresión génica y/o los niveles de proteínas, proporcionando información sobre los mecanismos moleculares regulados por el reloj circadiano. Además, el monitoreo en tiempo real permite a los investigadores estudiar los efectos de los cambios ambientales en los mecanismos moleculares 7,8. Existen numerosas técnicas para los estudios de monitorización en tiempo real, incluido el ensayo de bioluminiscencia, que se utiliza ampliamente para rastrear la expresión génica o los niveles de proteínas a lo largo del tiempo. El ensayo de bioluminiscencia es un método para detectar procesos biológicos utilizando la producción de luz como lectura. En este ensayo, una enzima oxidativa que produce bioluminiscencia (por ejemplo, luciferasa) se transfecta de manera transitoria o estable en las células de interés, y la lectura de bioluminiscencia se mide en presencia de un sustrato (por ejemplo, luciferina) a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la enzima luciferasa produce bioluminiscencia oxidando el sustrato luciferina en presencia de ATP9. Debido a su corta vida media, 3-4 h10, la luciferasa de luciérnaga es una poderosa herramienta para los estudios circadianos en términos de proporcionar monitoreo dinámico en tiempo real con un ruido de fondo mínimo 11,12,13. Para la inserción de ADN con un promotor marcado con luciferasa o un marco de lectura abierto (ORF), el sistema de administración de genes lentivirales es un método confiable que proporciona una alta eficacia de transducción, una integración estable y una baja inmunogenicidad. La transducción estable de un reportero bioluminiscente proporciona una expresión robusta en células en división y no división, generando datos consistentes para estudios circadianos14.
Organoide como modelo Las líneas celulares bidimensionales inmortalizadas tradicionales han sido fundamentales en estudios biológicos que van desde el descubrimiento de los mecanismos moleculares fundamentales de los ritmos circadianos hasta la detección de fármacos. A pesar de la conveniencia de utilizar líneas celulares homogeneizadas, carecen de estructuras multicelulares e interacciones intercelulares. Por el contrario, los organoides son estructuras multicelulares "similares a órganos" en 3D in vitro que imitan la estructura del órgano en una placa al mostrar similitud con la arquitectura de tejido in vivo y la multicelularidad, incluidos los tipos de células madre, progenitoras y diferenciadas15,16. Poseer características de autoorganización, multicelularidad y funcionalidad hacen de los organoides un notable modelo in vitro que representa los procesos celulares y fisiológicos que ocurren en los tejidos reales17. Se pueden derivar diferentes tipos de organoides a partir de células madre pluripotentes a través de la diferenciación dirigida o células madre adultas recolectadas de varios órganos, incluidos el intestino delgado, el cerebro, el hígado, el pulmón y el riñón18,19. Dado que las estructuras organoides poseen una arquitectura y función reales similares a las de los tejidos, con multicelularidad e interacción dinámica de célula a célula, son superiores a las líneas celulares homogeneizadas para comprender los eventos celulares que ocurren en los tejidos in vivo. Los organoides también son fácilmente manipulables y pueden cultivarse en condiciones controladas, lo que los hace útiles para los estudios circadianos20.
El objetivo principal de este trabajo es presentar un método de monitorización en tiempo real utilizando un ensayo de bioluminiscencia específicamente diseñado para el estudio de los ritmos circadianos en organoides 3D multicelulares. El monitoreo en tiempo real de eventos celulares utilizando una técnica de ensayo de bioluminiscencia se ha realizado ampliamente para cultivos celulares que carecen de la complejidad multicelular y las comunicaciones intercelulares que existen en los tejidos reales. Los organoides 3D presentan oportunidades únicas para investigar las funciones de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares in vitro. Por ejemplo, se podrían investigar los ritmos circadianos en los organoides con composiciones celulares alteradas u organoides derivados de los tejidos enfermos de los pacientes. Este protocolo permite la utilización de un ensayo de bioluminiscencia para investigar diferentes aspectos de los ritmos circadianos en un modelo in vitro más relevante fisiológicamente , los organoides, que nos ayudará a comprender mejor el papel de los ritmos circadianos en los órganos periféricos.

<table><tbody><tr><td>35 x 10 Placas de cultivo de tejidos Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>Sigma Aldrich SML0788</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringas de insulina intravenosa microfinas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1Bb</td><td>Mfrn: BD 329424</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td>Inhibidor de GSK-3</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902-500MG</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina (sal de potasio)</td><td>Cayman Chemical</td><td>14681</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin I Human</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9020</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento reducido (GFR) Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Medio de crecimiento de organoides (humano)</td><td>Las tecnologías de células madre</td><td>06010</td><td>consisten en medio basal humano IntestiCult OGM, 50 mL y suplemento de organoide, 50 mL. Mezcle ambos en una proporción de 1:1 para usar como medio de crecimiento de organoides intestinales</td></tr><tr><td>Máquina luminométrica Kronos Dio</td><td>ATTO Corporation</td><td>AB-2550</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>pABpuro-BluF plásmido reportero</td><td>Addgene</td><td>46824</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Calcio y Magnesio</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Murina recombinante EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254/10</td><td>Inhibidor de ROCK</td></tr></tbody></table>

monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

La mayoría de los organismos vivos poseen ritmos circadianos, que son procesos biológicos que ocurren en un período de aproximadamente 24 horas y regulan un repertorio diverso de procesos celulares y fisiológicos que van desde los ciclos de sueño-vigilia hasta el metabolismo. Este mecanismo de reloj arrastra al organismo en función de los cambios ambientales y coordina la regulación temporal de los eventos moleculares y fisiológicos. Anteriormente, se demostró que los ritmos circadianos autónomos se mantienen incluso a nivel de una sola célula utilizando líneas celulares como los fibroblastos NIH3T3, que fueron fundamentales para descubrir los mecanismos de los ritmos circadianos. Sin embargo, estas líneas celulares son cultivos homogéneos que carecen de multicelularidad y de comunicaciones intercelulares robustas. En la última década, se ha realizado un extenso trabajo en el desarrollo, caracterización y aplicación de organoides 3D, que son sistemas multicelulares in vitro que se asemejan a estructuras y funciones morfológicas in vivo . En este trabajo se describe un protocolo para la detección de ritmos circadianos utilizando un reportero bioluminiscente en enteroides, que permite la investigación de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares in vitro.

El registro de la bioluminiscencia se llevó a cabo para evaluar la ritmicidad circadiana de los enteroides intestinales humanos (HIE) en dos condiciones distintas: condiciones enriquecidas con células madre utilizando un medio de crecimiento de organoides intestinales (Figura 3) frente a condiciones inductoras de diferenciación, que se lograron reemplazando el medio de crecimiento del organoide intestinal por un medio de diferenciación. El día del experimento, sincronizamos los relojes circadianos realizando un tratamiento de 1 h con dexametasona 100 nM. Posteriormente, reemplazamos el medio con 3 mL de medio de crecimiento de organoides intestinales o medio de diferenciación suplementado con 200 μM de D-luciferina e iniciamos el monitoreo de la actividad de bioluminiscencia. Después de un período de registro de 4-5 días, realizamos un análisis de transformada rápida de Fourier (FFT) para determinar el período de los ritmos circadianos observados. La Figura 3 muestra la dinámica temporal de la actividad del promotor Bmal1 en las condiciones antes mencionadas. En condiciones diferenciadoras, la bioluminiscencia de Bmal1-luc exhibió oscilaciones circadianas robustas con una periodicidad media de 22,92 h. Por el contrario, los HIE demostraron ritmos circadianos alterados en condiciones enriquecidas con células madre (Figura 3). Estos datos muestran que los HIE en condiciones enriquecidas con células madre no muestran oscilaciones circadianas robustas. En otras palabras, sería necesario evaluar el impacto de las condiciones de crecimiento con respecto a los ritmos circadianos antes de investigar las funciones dependientes del reloj circadiano en los organoides.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66381/66381fig01.jpg"> Figura 1: Dibujo esquemático del protocolo. Los HIE se introducen en placas de 35 mm el día 1 y se cultivan con 2 mL de medio de crecimiento hasta el día 3. Al tercer día después del paso, el medio se reemplaza con 2 mL de medio de diferenciación precalentado para iniciar la diferenciación de los enteroides. El cambio de medio se repite con 2 mL de medio precalentado el día 5 para prevenir el agotamiento de la nutrición. En el día 6, los enteroides se tratan con dexametasona 100 nM durante 1 h para la sincronización del reloj circadiano. Después de una hora, el medio se reemplaza con 3 mL de 200 μM de medio que contiene D-luciferina, y las placas se instalan en el luminómetro de incubación. Después de registrar la expresión de bioluminiscencia durante 4-5 días, el experimento finaliza y los datos generados se exportan como hojas de cálculo para su posterior análisis. Abreviatura: HIE = enteroide intestinal humano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66381/66381fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66381/66381fig02.jpg"> Figura 2: Una imagen representativa de los HIEs bajo el medio de crecimiento. La imagen fue tomada por un microscopio de campo amplio con un objetivo de 25x. Barra de escala = 1 mm. Abreviatura: HIE = enteroide intestinal humano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66381/66381fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66381/66381fig03.jpg"> Figura 3: Registros de bioluminiscencia de HIEs en condiciones de enriquecimiento y diferenciación con células madre. (A) Datos de registro de bioluminiscencia sin tendencia y (B) sin tendencia de HIEs Bmal1-luc en condiciones de enriquecimiento con células madre (rojo) y diferenciación (negro). (C) Período de oscilaciones Bmal1-luc en HIEs bajo condiciones de diferenciación. El período se calcula con análisis FFT; n = 3 para las HIEs Bmal1-luc en condición de enriquecimiento con células madre y n = 4 para las HIEs Bmal1-luc en condición de diferenciación. Las barras de error indican SD. Abreviaturas: HIE = enteroide intestinal humano; FFT = Transformada rápida de Fourier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66381/66381fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Recetas de medios de diferenciación</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Nombre del reactivo</td>
			<td>Compañía</td>
			<td>Número de catálogo</td>
			<td>Concentración final</td>
			<td>Comentarios</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 avanzado</td>
			<td>Tecnologías para la vida</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
			<td>Agregar como último componente. Si prepara medios de 50 mL, después de agregar todos los demás componentes, llene el resto hasta 50 mL con Advanced DMEM/F12 al final.</td>
		</tr><tr><td>Un 83-01</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td>500 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Suplemento B-27 (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1 vez</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Gastrina I Humano</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9020</td>
			<td>10 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1 vez</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Suplemento N-2 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1 vez</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>1 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>NOGGIN Medio Acondicionado</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
			<td>Hecho en el laboratorio</td>
		</tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 U/mL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF murino recombinante</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>50 ng/mL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Medio acondicionado R-SPONDIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10%</td>
			<td>Hecho en el laboratorio</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición de los medios de diferenciación HIE23.

Los ritmos circadianos, que existen en la mayoría de los organismos, regulan la organización temporal de los procesos biológicos. Los organoides 3D han surgido recientemente como un modelo in vitro fisiológicamente relevante. Este protocolo describe el uso de reporteros bioluminiscentes para observar los ritmos circadianos en organoides, lo que permite investigaciones in vitro de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares.

Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

Nuestro ámbito de investigación actual es investigar el papel de los ritmos circadianos en la proliferación y diferenciación de las células epiteliales intestinales. Estamos tratando de determinar si el reloj circadiano regula la proliferación y diferenciación celular de las células madre intestinales. Este protocolo presenta un método de monitorización en tiempo real para estudios circadianos en organoides tridimensionales utilizando un ensayo de bioluminiscencia.A diferencia de la realización de ensayos de bioluminiscencia en un cultivo celular bidimensional convencional, este enfoque nos permite investigar los ritmos circadianos y sus funciones en un modelo de organoide más relevante fisiológicamente. Nuestros hallazgos muestran ritmos circadianos alterados en condiciones enriquecidas con células madre, al tiempo que demuestran oscilaciones circadianas robustas en organoides intestinales humanos diferenciados, lo que sugiere una remodelación de la maquinaria del reloj circadiano de células madre a células diferenciadas. Los usos de organoides derivados de pacientes con reporteros bioluminiscentes circadianos nos ayudarán a avanzar en nuestra comprensión de los ritmos circadianos en órganos periféricos y diferentes estados de enfermedad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

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Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

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Aprende a monitorizar oscilaciones circadianas en organoides intestinales humanos mediante ensayo de bioluminiscencia. Este método revela diferencias en la ritmicidad según el estado de diferenciación celular.

Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

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