Name: Fabricación de los canales de microfluidos termoplástico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-03T23:56:00.000+00:00
Duration: 16 min
Description: Aprende a fabricar dispositivos microfluídicos termoplásticos mediante embutido en caliente y unión térmica. Este método permite aislar ácidos nucleicos mediante extracción en fase sólida para aplicaciones diagnósticas.

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Los canales de microfluidos son fabricados en una poliolefina cíclica (Zeonex ® 690R, Zeon Chemical Inc., Louisville, KY). Zeonex tiene una temperatura de transición vítrea (Tg) de 136 ° C y UV es transparente, lo cual es esencial para la química de la luz dirigida utilizado en la formación monolito porosa. Los microcanales son fabricados por micro-estampado en caliente con una NiCo electroformada maestro de molde, que tiene la negativa (inversa) características de la plataforma de microfluidos. El estampado en caliente se realiza de la siguiente manera: <ol><li> El molde y el sustrato de polímero se colocan entre dos placas metálicas paralelas. </li><li> Los platos se calientan hasta la temperatura de estampación (166 ° C), que es de 30 º C por encima de la Tg de Zeonex. </li><li> Los platos se prensan junto durante unos 5 min y la presión se mantiene a 250 psi. </li><li> El molde y el sustrato se retiran de las placas se calienta, se deja enfriar durante 1-2 minutos, y luego manualmente separados unos de otros. </li><li> Pozos de diámetro de 1,5 mm son perforados en los extremos de los canales para la introducción de la muestra y recolección. </li><li> El sustrato de plástico en relieve es entonces adherido térmicamente con otro pedazo de Zeonex formulario adjunto a los canales de microfluidos. El sustrato en relieve y la pieza de la cubierta se puede UV-ozono o plasma tratado antes de la unión térmica para mejorar la eficiencia de sellado y garantizar la fidelidad de la estructura del canal cerrado (Bhattacharyya y Klapperich, 2007). </li></ol> Fabricación de extracción en fase sólida (SPE) de columna dentro de los canales de microfluidos de plástico La fabricación de la fase sólida es un proceso de dos pasos. Al principio, los microcanales son fabricados superficie modificada con el fin de mejorar la adherencia de la columna de la SPE en el dispositivo de plástico. Injerto a través de fotopolimerización superficie se utiliza para funcionalizar las paredes de los microcanales poliméricos. El procedimiento de injerto es el siguiente: <ol><li> Los microcanales se llena con una mezcla de 1:1 de diacrilato de etileno (EDA) y metacrilato de metilo (MMA) con 3% de benzofenona, que es un fotoiniciador de hidrógeno abstracción. La EDA, MMA y benzofenona son adquiridos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. </li><li> El chip es entonces irradiados con UV durante 10 minutos a 254 nm de longitud de onda UV y 200 mJ / cm 2 de la energía en un instrumento de la exposición ultravioleta (CL-1000 Crosslinker UV, UPV Inc., Upland, CA). El injerto se produce a través de la polimerización abstracción de H y los resultados de las cadenas de polímero anclada en la superficie, que se incorporan en la mezcla de polimerización utilizada para la preparación del monolito en el segundo paso. </li><li> El monómero se elimina el exceso de los canales de lavado con 15 l de metanol con aspiración al vacío. </li></ol> Después del proceso de photografting, un polímero microporoso monolito se forma dentro de los microcanales que atrapan las partículas de sílice para la extracción de ADN. El monolito porosa se ​​prepara in situ de la siguiente manera: <ol><li> Los canales de superficie modificada se llena con una mezcla de precursores monolito compuesto de Buma (15% en peso), EDMA (10% en peso), 1-dodecanol (52,5% en peso), ciclohexanol (22,5% en peso), DMPAP (en peso del 1% con respecto a los monómeros) y 0,7 micras partículas de sílice (15% con respecto al volumen total de la mezcla de pre-polímero). El microesferas de sílice fueron adquiridos de Polysciences, Inc. (Warrington, PA) y los monómeros y disolventes porogenic son adquiridos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. </li><li> El chip se irradia con luz UV en el reticulador UV a 200 mJ / cm 2 de 1.1 minutos para iniciar la polimerización, el monómero y se elimina el exceso de los canales de lavado con 15 l de metanol con aspiración al vacío. </li><li> Las conexiones de fluidos (NanoPorts conexiones TM, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) se unen después de la introducción y pozos de captación de los canales de microfluidos. </li><li> El monolito porosa se lava de nuevo con metanol durante un mínimo de 30 minutos utilizando la bomba de jeringa con un caudal de 100mL/hour. </li></ol> Fabricación de CNT lisis monolito dentro de los canales de microfluidos de plástico La fabricación de la lisis CNT monolito (nanotubos de carbono) es un proceso de dos pasos. En primer lugar, los microcanales son fabricados superficie modificada (injertados) en la misma forma que para las columnas de SPE en el dispositivo de plástico. Después del proceso de photografting, un polímero microporoso monolito se forma dentro del microcanal que está impregnado con nanotubos de carbono de pared múltiple. El monolito porosa se ​​prepara in situ de la siguiente manera: <ol><li> Multi-nanotubos se resuspenden en ciclohexanol a una concentración de 2.27m. Esta es la resuspensión ultrasonicated durante 30 minutos a 50% de la amplitud y el 50% ciclo de trabajo con una célula Sonifier disruptor (Sonifier S-250D, fabricado por ultrasonidos Branson, Danbury, CT). Los ultrasonidos proporcionan una suspensión de 0,5 eficaz y estable de la CNT. Los nanotubos de carbono fueron adquiridos de Nanolabs (Brighton, MA). </li><li> Los canales de superficie modificada se llena con una mezcla de precursores similares monolito sólo que ahora la solución de ciclohexanol + CNT se utiliza. La mezcla consiste monolito de Buma (15% en peso), EDMA (10% en peso), 1-dodecanol (52,5% en peso), y ciclohexanol + CNT (22,5% en peso). A esta solución la DMPAP fotoiniciador se añade (1,13% en peso con respecto a los monómeros). Los monómeros, disolventes y porogenic DMPAPA son adquiridos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. </li><li> El chip se irradia con luz UV en el reticulador UV a 120 mJ / cm 2 para 0,9 minutos para iniciar la polimerización. El dispositivo se voltea 180 grados en la crossliker e irradiado por otros 0,9 minutos a 120 mJ / cm 2. El monómero se elimina el exceso de los canales de lavado con 50 l de metanol con aspiración al vacío. </li><li> Las conexiones de fluidos (NanoPorts conexiones TM, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) se unen después de la introducción y pozos de captación de los canales de microfluidos. </li></ol> Preparación de muestras de bacterias para su uso con CNT lisis monolito La preparación de la muestra para una muestra bacteriana consiste en tomar una medida de la densidad óptica a 600 nm para asegurar que la muestra no es muy concentrada con el fin de evitar la obstrucción del canal. <ol><li> Tome una lectura de DO a 600 nm con la bacteria en los medios de comunicación, esto se hace con un BioPhotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY). Diluir la muestra hasta que las lecturas de OD dentro del rango 0.18-0.25 A. </li><li> Centrifugar la muestra a 6500 rpm durante 5 minutos y decantar el sobrenadante. </li></ol> Lisis <ol><li> Resuspender las bacterias en GuSCN * + 0.01% SDS + 4% proteinasa K (0.8mg/ml). Agitar brevemente (1 ml de bacterias en los medios de comunicación deben ser resuspendido en 1 ml GuSCN). Proteinasa K fue agregado a la solución para ayudar con la desnaturalización de las proteínas que se unen al ADN bacteriano y para inhibir la DNAases y RNAases. Un beneficio adicional de la proteinasa K es que también ayuda a romper las proteínas de la pared celular, lo que es deseable, ya que tanto bacterias gram-positivas y gram-negativos paredes celulares de las bacterias contienen grandes cantidades de proteínas (aunque bacterias gram-negativas suelen tener más proteínas ). El buffer caotrópico además ayuda a la proteinasa K con desnaturalización proteínas, mientras que el detergente rompe la pared celular. Proteinasa K y tiocianato de guanidinio (GuSCN) fueron adquiridos de Qiagen Inc. (Valencia, CA). SDS (dodecil sulfato de sodio) fue adquirido de Pierce (Rockford, IL). </li><li> Inmediatamente la carga de la muestra en una jeringa conectada a un tubo PEEK. Aspirar la jeringa para que no haya aire en el sistema. Conecte el tubo a la NanoPort y el canal. </li></ol> Una bomba de jeringa KDS100 (fabricado por KD Scientific, Holliston, MA) fue utilizado para los experimentos y el caudal utilizado es de 450 l / h para todos los pasos. El flujo del canal de la lisis de la muestra en 450ul/hr. <ol><li> Recoger la muestra y proceder a la extracción de ADN a través de la SPE (véase el protocolo de extracción de ADN). NOTA: Esta muestra bacteriana no tendrá que seguir el paso de carga 2, ya que la suspensión es GuSCN *. </li></ol> Protocolo de extracción de ADN El procedimiento de extracción consiste en tres pasos: <ol><li> De carga. </li><li> Washington </li><li> Eluir. </li></ol> Bomba de jeringa KDS100 (fabricado por KD Scientific, Holliston, MA) fue utilizado para los experimentos y la velocidad de flujo usada fue de 300 l / h para todos los pasos. Carga <ol><li> La condición del canal con buffer caotrópico (GuSCN *, tiocianato de guanidinio) durante 1-2 minutos antes de comenzar el experimento. </li><li> Mezclar la muestra con tampón caotrópico en proporción de 1:1. </li><li> El flujo de mezcla de la muestra a través del canal durante 3 min. </li></ol> Lavar <ol><li> Lavar el canal con el 70% de etanol durante 2 min. </li><li> Lavar el canal con etanol al 100% durante 2 min. </li></ol> Eluir <ol><li> Eluir el ADN extraído en agua Millipore durante 3 min. Recoge 15 l de agua purificada, lista para PCR de ADN. </li></ol> * El GuSCN del kit de Qiagen (Buffer RLT) se utilizó.

<ol><li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+chemical+analysis+of+plasma+and+ultraviolet-ozone+surface+treatments+for+thermal+bonding+of+polymeric+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7, 876-882 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

fabricación de los canales de microfluidos termoplástico

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

En nuestro laboratorio, hemos logrado ácidos nucleicos aislados directamente de los volúmenes de microlitro y submicroliter de la sangre humana orina y las heces con polímero / nanopartículas compuestas lisis micro y sólidas columnas de extracción en fase. Las muestras recuperadas son muestras de concentrado, pequeño volumen que se PCRable, sin ningún tipo de limpieza adicional. En este sentido, se muestra cómo fabricar chips de microfluidos con termoplástico estampado en caliente y sellado por calor. Luego, se demuestra cómo utilizar la luz en la superficie in situ dirigidos injerto y la polimerización a través del chip sellado para formar las columnas compuestas en fase sólida. Demostramos injerto y la polimerización de un nanotubo de carbono / polímero columna compuesta para la lisis celular de las bacterias. A continuación, muestran el proceso de lisis seguido de la extracción en fase sólida de los ácidos nucleicos de la muestra en el chip con un contenido de sílice / columna de compuesto de polímero. Los protocolos adjuntos contienen instrucciones detalladas sobre cómo hacer que tanto la lisis y la extracción en fase sólida columnas.

Aquí se demuestra cómo fabricar chips de microfluidos con termoplástico estampado en caliente y sellado por calor. Luego se muestra cómo utilizar la luz en la superficie in situ dirigidos injerto y la polimerización a través del chip sellado para formar las columnas compuestas en fase sólida.

Fabricación de los canales de microfluidos termoplástico

En nuestro laboratorio, hemos aislado con éxito ácidos nucleicos directamente de volúmenes de microlitros y submicrolitros de sangre, orina y heces humanas utilizando...

Hola, mi nombre es Aida Pria y acabo de finalizar mi doctorado en el laboratorio de la Dra. Katherine KLAS aquí en bu. Hoy voy a demostrar la fabricación de un dispositivo microfluídico termoplástico mediante embossing térmico micro y unión térmica. Luego, demostraré el aislamiento de ácidos nucleicos utilizando una fase sólida que contiene partículas de sílice, cuyos ácidos nucleicos extraídos pueden posteriormente utilizarse para la detección por amplificación mediante PCR o cualquier otro módulo diagnóstico.Hola, mi nombre es Dominika Kalinski y soy estudiante de posgrado en el Laboratorio de Microdispositivos y Microentornos Biomédicos de la Universidad de Boston. Hablaré sobre la formación de un monolito de lisis de nanotubos de carbono en un dispositivo microfluídico, y sobre la formación de un monolito para extracción en fase sólida destinado a la extracción de ADN en un dispositivo microfluídico. Hoy vamos a demostrar un experimento sobre la producción y aplicación de columnas de lisis a microescala y columnas de extracción en fase sólida dentro de canales microfluídicos de termoplástico.Estas columnas pueden utilizarse para la lisis de células bacterianas y el aislamiento de ácidos nucleicos a partir del lisado celular. El primer paso en el proceso es la fabricación de los dispositivos microfluídicos. En poliolefina cíclica, utilizamos un polímero, que bajo el nombre comercial xx XX six 90 R tiene una temperatura de transición vítrea de 136 grados Celsius y es transparente a la luz UV.La transparencia UV es muy esencial para la química dirigida por luz utilizada en la fabricación del monolito poroso dentro de los canales microfluídicos. Esta plataforma microfluídica se fabrica utilizando embossing térmico micro y unión térmica. Primero, voy a demostrar el proceso de embossing térmico micro.Entonces comenzamos con un molde maestro, que es un molde electroformado de níquel-cobalto, y presenta las características negativas o inversas de lo necesario en la plataforma microfluídica. Colocamos las paletas Zion Nex sobre las características que requerimos en el sustrato plástico. Luego, el molde se coloca en una prensa caliente, que se calienta hasta 30 grados por encima de la temperatura de transición vítrea del polímero.A continuación, esto se cubre con otra placa metálica y se prensa a una presión entre 50 y 500 PSI, lo cual es adecuado. Después de cinco minutos, podemos liberar la presión y retirar los PLA. Se deja enfriar un poco y luego las dos placas se separan manualmente, liberando así el molde del sustrato.Así es como se ve el sustrato. Después de liberarlo del molde, perforamos orificios de 1,5 milímetros en los extremos del canal para utilizarlos como pozos de introducción y recolección. Luego, este sustrato grabado se une térmicamente con otra pieza de plástico lisa para formar y sellar las características microfluídicas.Ambas piezas se pegan en la placa calefactora de esta manera. La temperatura se reduce a la temperatura de transición vítrea del polímero, que es de 136 grados Celsius. Para el proceso de soldadura térmica, nuevamente, las placas metálicas se colocan en la prensa caliente, que se calienta hasta la temperatura de transición vítrea, es decir, 136 grados Celsius, y se presionan juntas a 250 PSI durante dos minutos.En la temperatura de transición vítrea, el polímero comienza a fundirse y fusionarse, y así es como obtenemos características microfluídicas encapsuladas. Después de dos minutos, se libera la presión. Así es como se ve el dispositivo microfluídico final con los canales encapsulados y los puertos de acceso para la introducción y recopilación de la muestra. Ahora vamos a preparar los microcanales para la formación del monolito polimérico poroso.El primer paso de este proceso es un procedimiento de injerto. Modificamos la química superficial de los microcanales y de la plataforma Xan X six 90 R. Esto es necesario para poder lograr la fijación covalente del monolito polimérico poroso dentro del microcanal.Esta modificación superficial es un proceso de injerto, que implica una relación uno a uno de EDA con MMA y un iniciador fotoquímico benzo pheno. Lo que estoy haciendo aquí es preparar una concentración equimolar de MMA y EDA en la solución. Añado 3 % de benza pheno para poder reticular este monolito dentro del canal. Una vez que se ha mezclado la solución de injerto, se introduce en el microcanal y, debido a la acción capilar, se llena el canal. Una vez que el canal está lleno, se coloca en un cruzador UV y se realizará la reticulación durante 10 minutos con un nivel de energía de 200 milijulios por centímetro cuadrado. Después de los 10 minutos de exposición a la luz UV, se enjuaga la solución de injerto y el microcanal con metanol, utilizando aspiración al vacío.Lo que haré aquí es colocar metanol en un extremo del canal utilizando un vacío para enjuagar el canal con metanol. Esto se hace para eliminar cualquier solución excesiva que no se haya polimerizado. Esta es una comparación de ciclo, etanol y ciclina, todos con nanotubos de carbono a una concentración de 2,27 molar.El Cyclin todo con nanotubos de carbono será agitado para lograr una dispersión uniforme de los nanotubos de carbono dentro de la solución. Después del proceso de injerto, la química de la superficie ha sido modificada y ahora está lista para una fijación firme del monolito dentro del microcanal. Ahora describiré la formación del monolito de nanotubos de carbono VICIS.Esto está compuesto por genes, disolventes y monómeros. Los cuatro elementos implicados en este proceso son al a ecol, metacrilato de butilo y EDMA. Además, añadimos un iniciador fotoquímico para poder formar el monolito in situ mediante una polimerización por UV.Voy a preparar una muestra de cien microlitros. Pipetearé 52,5 microlitros de ecol. Esto debe hacerse lentamente, ya que ecol es viscoso.Después del ecol, agregaremos los nanotubos de carbono con cyclo anol. Es necesario vortexear enérgicamente durante unos minutos para asegurar una dispersión adecuada. Nuevamente, debemos pipetear lentamente el cyclo andal y los nanotubos de carbono porque esta es una solución Abicus.Luego agregamos 15 microlitros de butyl meth Aly. Y finalmente, agregamos 10 microlitros de EDMA. Vortexeamos brevemente, añadimos nuestro iniciador fotoquímico y luego sonicamos.El iniciador fotoquímico que agregamos es DM PAP al monolito de lisis. Se añade a una concentración de 1,13 en todo el volumen de esta solución de cien microlitros. Después de su adición, dado que se trata de un iniciador fotoquímico, debemos cubrir la solución del monolito de lisis para garantizar que no haya exposición mientras sometemos esta solución a sonicación.Esto se someterá a 30 minutos a una amplitud del 50 % con un ciclo de trabajo del 50 %. Este ciclo de trabajo del 50 % tiene como objetivo evitar el sobrecalentamiento de la solución. Es extremadamente importante tomar la solución tras la sonicación y trabajar rápidamente.Esto se debe a que queremos asegurar una dispersión uniforme de los nanotubos de carbono en la solución, ya que vamos a pipetear la solución dentro del microcanal. Aquí tenemos la solución de lisis. Inmediatamente después de la sonicación y trabajando muy rápidamente, pipeteamos el volumen dentro del microcanal utilizando la acción capilar; la solución fluye hacia el interior del canal.Colocamos esto en el entrecruzador durante 0,9 minutos a un nivel de energía de 120 milies por centímetro cuadrado. Después de estos 0,9 minutos, invertimos el dispositivo. Esta inversión tiene como finalidad permitir una polimerización más uniforme y una distribución más homogénea de los nanotubos de carbono en el canal.Una vez que el monolito se ha polimerizado y se ha enjuagado con metanol, la solución del monómero, el monolito en el interior ya no será transparente, sino blanco intenso; habrá pequeñas partículas negras, que serán los nanotubos de carbono en el monolito. El monolito para extracción en fase sólida se fabrica de manera similar al monolito de nanotubos de carbono y lisis. Esta es la bacteria y el cultivo líquido, y aquí tenemos una muestra de nuestro medio.Una vez que hayamos diluido la muestra, la pipetearémos hacia un vial y la centrifugaremos. Luego, decantaremos el medio asegurándonos de no perturbar el pellet bacteriano en la pared del tubo eppendorf. A continuación, las bacterias se resuspenden en una solución con gudo, dium, thio, SDS y proteasa K. La guanidina tiocianato que se pipetea tiene el mismo volumen en el que se suspendieron las bacterias.Aquí, las bacterias se suspendieron en un mil, por lo tanto volveré a suspender las bacterias en un mil de tiocianato de gguumm respecto al tiocianato de gu. Añadiré proteinasa K. Estoy agregando 45 microlitros y ARN. La última solución que añado es SDS.Después de esto, se agita la solución en vórtex. Tras la agitación, pipetearé la muestra bacteriana hacia una jeringa desechable. Aquí estamos utilizando una jeringa desechable Excel de tres mil.Esto tiene un adaptador de conexión que se une al tubo capilar y que conectaremos a nuestro dispositivo mediante puertos nano. Así que pipetearé la solución dentro de la jeringa desechable. Debemos aspirar para asegurarnos de que no haya aire en el sistema.Debe hacer esto hasta obtener una o dos gotas saliendo por el otro extremo. Ahora que tenemos nuestra solución lista para conectar al dispositivo, colocaremos nuestra jeringa desechable en la bomba de jeringa KDS y conectaremos el extremo de nuestro adaptador al dispositivo de licencia, que tiene puertos nano a los que hemos conectado epoxi en cada extremo. Esto permite una conexión firme al dispositivo.Estas son conexiones roscadas, y normalmente nos gusta fijar el dispositivo con cinta para asegurarnos de que no se vuelque. Aquí ajustaremos el caudal a cuatro o cinco microlitros por hora. Esta es una bomba de desplazamiento que forzará la solución a través de la jeringa, por el tubo, hasta esta conexión y a través del canal.Y recopilaremos la muestra a través de este puerto nano de salida. Podemos recoger el contaminante utilizando una pipeta, y este contaminante pasará a la siguiente fase, el proceso de extracción en fase sólida, para aislar el ADN bacteriano para el aislamiento de los ácidos nucleicos. La fase sólida que contiene las partículas de sílice se acondiciona con guanidina tiosulfato que incluye tampón de lisis.Esto se realiza llenando una jeringa con el tampón de lisis y conectándola a la bomba de jeringa, haciendo fluir el tampón a través del canal a un caudal de 300 microlitros por hora. A continuación, se procede a la carga de la muestra. La muestra aquí es el lisado celular bacteriano que obtuvimos en el paso previo de lisis.Nuevamente, la carga, esta muestra se carga durante tres minutos a un caudal de 300 microlitros por hora. Después de esto, el canal se lava con etanol al 70 %, nuevamente a un caudal de 300 microlitros por hora. Este paso de lavado elimina todas las proteínas absorbidas y los contaminantes, y los residuos se recogen del recipiente de recolección.Bien, se utiliza una pipeta después del paso de lavado, que elimina todos los contaminantes. El ADN que se encontraba unido a la sílica se eluye entonces en agua. Esto es una jeringa que contiene agua destilada.Está unido al chip y, nuevamente, se hace fluir el agua a un caudal de 300 microlitros por hora, y recolectamos la muestra en el otro extremo. Esto se realiza durante tres minutos, y recolectamos 15 microlitros de ient, que es simplemente ADN puro en agua, y está listo para PCR para la fabricación del dispositivo termoplástico. El mayor desafío es el aspecto de unión térmica, porque la unión se realiza a una temperatura muy alta, en o cerca de la temperatura de transición vítrea del polímero, y la aplicación de cierta presión, o una ligera variación de la presión o la temperatura, puede destruir completamente el canal o crear un sello deficiente entre las dos piezas de plástico.Por lo tanto, mantener la temperatura y la presión óptimas es muy importante y puede ser un poco complicado. Los elementos clave que representan un desafío en este proceso son lograr una distribución uniforme de nanotubos de carbono en la solución de monómero que se polimeriza in situ mediante UV. Este también es un desafío similar al de obtener una dispersión uniforme de partículas de sílice en el monolito polimérico poroso para la extracción en fase sólida.

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