Name: Método fluorescente sin células, cuantificable y económico, para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Aprende a desarrollar un ensayo fluorescente económico y cuantificable para confirmar la capacidad de quelación de hierro en nuevos compuestos usando la sonda Calcein. Este método facilita la investigación en tratamientos contra el cáncer.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ensayo fluorescente para la detección de nuevos quelantes de hierro

<ol><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%3A+An+essential+element+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Iron: An essential element of cancer metabolism.</a> Cells. 9 (12), 2591(2020).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+More+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: More ore to be mined.</a> Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+and+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).</li>
<li>Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer.</a> Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).</li>
<li>Welch, D. R., Hurst, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+hallmarks+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the hallmarks of metastasis.</a> Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).</li>
<li>Lehmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+defects+of+hepatocellular+carcinoma+are+already+found+in+non-neoplastic+liver+cells+from+patients+with+hereditary+haemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis.</a> Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).</li>
<li>Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer+risk--a+systematic+review+and+meta-analysis+of+the+epidemiological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).</li>
<li>Abdelaal, G., Veuger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+oncogenic+transformation+with+iron+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reversing oncogenic transformation with iron chelation.</a> Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+and+impact+in+cancer+biology%2C+metastasis%2C+and+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology.</a> Front Oncol. 10, 476(2020).</li>
<li>Menyhárt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).</li>
<li>Basu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+and+diverse+iron-chelators+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovering novel and diverse iron-chelators in silico.</a> J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).</li>
<li>Prus, E., Fibach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+measurement+of+the+labile+iron+pool+in+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells.</a> Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harb. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphate-buffered+saline+%28pbs%29%22">Phosphate-buffered saline (pbs)</a>. 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).</li>
<li>Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+development+of+deferiprone+%28l1%29+and+other+iron+chelators+for+clinical+use%3A+Targeting+methods+and+application+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects.</a> Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Sulfato de hierro (II) de amonio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215406</td><td>también conocido como FAS</td></tr><tr><td>: Calceína</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr>, <tr><td>Deferiprona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379409</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>libre de magnesio y calcio</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 placas de pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812</td><td>cualquier placa de 96 pocillos ópticamente transparente funcionará</td></tr></tbody></table>

método fluorescente sin células, cuantificable y económico, para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro 

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Para el método mostrado en el paso 2, este primer experimento (Figura 1) estableció el rango lineal del lector de placas de fluorescencia de microtitulación al detectar emisiones fluorescentes de calceína. Nuestros resultados representativos muestran un amplio rango lineal de fluorescencia de calceína de 0 a 100 μM. El análisis post hoc de ANOVA con LSD demuestra que hay diferencias estadísticamente significativas en la RFU media para todas las concentraciones de calceína en comparación con un control de 0 μM de calceína. En experimentos posteriores, se utilizó calceína 1 μM (pasos 3 y 4) ya que produce diferencias estadísticamente significativas con respecto al control de 0 μM y se encuentra dentro del rango que se aplica comúnmente a las células en forma de calceína AM en citometría de flujo13.
Para el método mostrado en el paso 3, demostramos que cuando se agrega hierro en forma de Fe2+ en un rango de 0-1000 μM (como FAS) a 1 μM de calceína, los iones Fe2+ dan como resultado una disminución lineal en la fluorescencia de calceína (RFU). Esto permite la observación del enfriamiento basado en Fe2+ de la fluorescencia de calceína. La calceína, como quelante débil del hierro, se une al hierro y esto reduce la emisión fluorescente. En la Figura 2, las concentraciones de 8,9 μM FAS y superiores mostraron una disminución significativa, p&lt;0,001, en la fluorescencia de la calceína en comparación con 1 μM de calceína sola. El uso de 8,9 μM de FAS se correspondió con una reducción del 33% en la fluorescencia de calceína (RFU media). Para una mayor experimentación (paso 4) se utilizaron 10 μM de FAS, ya que se encontraba dentro del rango de enfriamiento fluorescente de la calceína.
Para el método mostrado en el paso 4, en la Figura 3 se puede observar la superación de la Calceína por los iones Fe2+ por un quelante de hierro. El hierro en forma de Fe2+ disminuye la fluorescencia de la calceína desde el control de 1 μM y el quelante de hierro deferiprona aumenta esta fluorescencia hasta un pico, liberando el enfriamiento del hierro de la calceína y aumentando la fluorescencia (RFU media). La deferiprona (utilizada como ejemplo) en concentraciones que oscilaron entre 0,97 y 512 μM dio lugar a aumentos estadísticamente significativos de la fluorescencia, como se observó con el análisis post hoc de ANOVA y LSD (p&lt;0,001). El mayor cambio fue un cambio de 3 veces en la RFU media a 62,5 μM de quelante en comparación con el control de 1 μM de calceína AM y 10 μM de FAS. Por encima de 512 μM de deferiprona no hubo diferencia estadísticamente significativa entre el quelante y el control de 1 μM de Calceína y 10 μM de FAS.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig01.jpg"> Figura 1: Concentraciones de calceína y fluorescencia (RFU) determinadas utilizando un lector de placas de microtitulación fluorescente. Aquí se muestran las concentraciones de calceína de 0-100 μM incubadas durante 30 min y la fluorescencia (RFU) determinadas. Los datos muestran la media de 8 réplicas por experimento y tres experimentos independientes, las barras de error muestran un intervalo de confianza del 95% en la media. La significación estadística se denota por **, donde p&lt;0.001 se determina utilizando ANOVA y análisis post hoc de LSD (calculado usando el prisma de la almohadilla gráfica). La RFU media de calceína de cada concentración se compara con el control de PBS y 0 μM de calceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig02.jpg"> Figura 2: El aumento de la concentración de FAS da como resultado una disminución lineal de la fluorescencia de la calceína. La concentración de FAS se incrementó de 0-1000 μM, lo que resultó en una disminución lineal en la fluorescencia de calceína de 1 μM después de 30 min de incubación en PBS. Los datos mostrados son la media de 5 réplicas por experimento y tres experimentos independientes, las barras de error muestran un intervalo de confianza del 95% en la media. La significación estadística se denota por **, donde p&lt;0.001 se determina utilizando ANOVA y análisis post hoc de LSD (calculado usando el prisma de la almohadilla gráfica). La RFU media de calceína de cada concentración de FAS y 1 μM de calceína se compara con el control de 1 μM de calceína y 0 μM de FAS en PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig03.jpg"> Figura 3: Aumento de las concentraciones de deferiprona. La concentración de deferiprona se incrementó de 0 a 1000 μM con incubación de 1 μM de calceína, 10 μM de FAS en PBS. La fluorescencia se midió en un lector de microplacas multimodal. Los datos mostrados son la media de 5 réplicas por experimento y tres experimentos independientes, las barras de error muestran un intervalo de confianza del 95% en la media. La significación estadística se denota por ** donde p&lt;0.001 según se determina utilizando ANOVA y análisis posthoc de LSD (calculado usando prisma de bloc de gráficos). La RFU media se comparó con 1 μM de calceína en PBS con 10 μM de FAS y 0 μM de deferiprona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentración (μm)</td>
			<td>Volumen de (1 mM de stock)</td>
			<td>Volumen de PBS</td>
			<td>Volumen total</td>
		</tr><tr><td>800</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>400</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>600 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>200</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>900 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>950 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>975 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>990 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>994 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>998 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>999 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Preparación de calceína para el caldo secundario.

Método fluorescente sin células, cuantificable y económico, para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

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