Name: Aislamiento de mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 44 s
Description: Aprende a aislar mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura para estudiar la regulación del ciclo celular y las quinasas dependientes de ciclinas en eucariotas.

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Y. Tanaka realizó la mejora técnica de Y2H. Este trabajo cuenta con el apoyo de la subvención número JP22K06336 de JSPS KAKENHI y el Instituto de Fermentación de Osaka.

1. Construcción de la biblioteca mutante
<ol><li>Configure la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (a continuación se muestra un ejemplo). Generalmente, prepare 50 μL de la reacción, que se divide en diez alícuotas de 5 μL, y amplifique el fragmento de gen objetivo en una máquina de PCR4. NOTA: Los usuarios deben seleccionar una polimerasa apropiada para introducir mutaciones de manera eficiente. Si el fragmento de ADN que se va a amplificar es corto, se necesita una polimerasa con una tasa de error más alta, como la polimerasa Taq, que carece de actividad de corrección. Si el fragmento de ADN que se va a amplificar es largo, se necesita una polimerasa de mayor fidelidad para reducir el número de mutaciones. Las mutaciones ocurren cada pocos cientos de pares de bases después de 30 ciclos de amplificación con la polimerasa 4 Taqregular. En los resultados representativos, se utilizó una polimerasa Taq diferente (ver Tabla de Materiales), que tiene mayor fidelidad que la polimerasa Taq regular, y la tasa de mutación fue de uno en 600 pares de bases. En el Archivo Complementario 1 se proporciona un ejemplo de las mezclas de PCR, los detalles del cebador y las condiciones de reacción.</li>
	<li>Una vez finalizada la PCR, combinar todas las alícuotas de la reacción, confirmar que los fragmentos de ADN de interés han sido amplificados mediante electroforesis en gel de agarosa, etcétera, y purificar el ADN5.</li>
	<li>Ensamble el fragmento de ADN generado en el paso 1.2 con el vector Y2H apropiado utilizando una estrategia de clonación "sin costuras" (Figura 1). NOTA: El sistema de clonación sin interrupciones, como el ensamblaje6 de Gibson, minimiza la contaminación de la biblioteca de mutantes construida por vectores vacíos generados a través de la autoligadura. En la Tabla 1 se proporciona una lista de vectores Y2H. Se pueden preparar por digestión BamHI antes del montaje. Todos los plásmidos están disponibles en el Proyecto Nacional de Recursos Biológicos - levadura (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Introducir la mezcla de reacción generada en el paso 1.3 en células competentes de Escherichia coli preparadas de acuerdo con un protocolo de transformación de E. coli altamente eficiente (por ejemplo, Inoue et al.7). Extienda todas las células competentes en varias placas de LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 1% de NaCl y 2% de agar) que contengan antibióticos apropiados (consulte la Tabla de materiales). En este punto, extienda una pequeña cantidad (~1/100 de la reacción total) en la misma placa de selección para calcular el título de la biblioteca. Incubar las placas a 37 °C durante la noche.</li>
	<li>Una vez que haya aparecido un gran número de colonias de E. coli , raspe todas las células de la superficie de la placa con un asa de plástico desechable. Recuperar ADN plásmido de estas células utilizando métodos populares, como la lisis alcalina8. Al mismo tiempo, cuente el número de colonias que aparecen después de esparcir pequeñas alícuotas de la mezcla de transformación en el plato. Con este número, calcule el número total de clones independientes en la biblioteca. NOTA: En este punto, recoja algunas colonias independientes (4-6) que aparezcan en la placa en la que se extendieron las pequeñas alícuotas de la reacción de transformación, cultívelas por separado y aísle los plásmidos de ellas para confirmar que prácticamente todos los clones llevan los fragmentos de ADN deseados5. Hay muchos kits comerciales disponibles para aislar plásmidos de E. coli. El número de colonias que aparecen en la placa después de esparcir pequeñas alícuotas se puede contar manualmente.</li>
	<li>Mida la concentración del grupo de ADN de la biblioteca. Por lo general, unos pocos cientos de nanogramos de ADN de biblioteca son suficientes para obtener varios miles de transformantes en el siguiente paso. NOTA: Se recomienda medir la concentración de ADN utilizando un tinte fluorescente que se adhiera al ADN porque la medición de A260 suele ser inexacta.</li>
</ol>2. Transformación de la levadura con la biblioteca de mutantes y revestimiento de réplicas
<ol><li>Introducir la biblioteca de mutantes en la cepa de levadura huésped (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) para el ensayo Y2H utilizando unos 100 ng de ADN. Pretransforme las células huésped con el plásmido 'cebo'.<ol><li>Después del procedimiento de transformación, suspenda las células de levadura en agua estéril y extienda alícuotas de diferentes cantidades en placas apropiadas (generalmente medio SC sin leucina y triptófano: SC-LW [0,67% de base de nitrógeno de levadura, 2% de glucosa, 1,546 g/L de mezcla de doble abandono SC -Leu-Trp y agar al 2%, ver Tabla de Materiales]). Incubar estas placas durante la noche a 30 °C. NOTA: El protocolo estándar, como el método de acetato de litio-PEG11 con ~ 5 × 106 células de crecimiento logarítmico, es suficiente para la transformación de la levadura. También se puede utilizar otro método con una alta eficiencia de transformación, como la electroporación.</li>
	</ol></li>
	<li>Al día siguiente, cuando aparezcan colonias diminutas, seleccione las placas con un número adecuado de células (500-2000) y haga réplicas de ellas de la siguiente manera.</li>
	<li>Coloque dos hojas de papel de filtro en un bloque de réplica para hacer varias réplicas (el medio es SC-LW y SC-LW que contiene kanamicina) (ver Tabla de Materiales). Incubar a 30 °C durante 1-2 días. NOTA: La concentración de kanamicina (G418) es de 600 μg/mL. No use terciopelo para el enchapado de réplicas porque se perderá la resolución de las colonias.</li>
	<li>Una vez que las colonias hayan crecido, compare los platos y elija los candidatos. Realice un ensayo de color Y2H (consulte el paso 3) si se utiliza lacZ como reportero. NOTA: Para el reportero Y2H, lacZ suele ser mejor para detectar una interacción débil que HIS3.</li>
</ol>3. Ensayo de color Y2H
<ol><li>Coloque una hoja de papel de filtro cortada de antemano al tamaño adecuado en la placa de réplica preparada mediante el paso 2. Tenga cuidado de no permitir que se formen burbujas de aire entre el papel de filtro y la placa. NOTA: Utilice papel de filtro No. 4A o papel de filtro de grado 50 (consulte la Tabla de materiales). Cualquier placa de kanamicina SC-LW o SC-LW, que se fabrica mediante recubrimiento de réplica, se puede utilizar para el ensayo de color.</li>
	<li>Cuando el papel de filtro de la placa esté completamente humedecido (cuando el color del papel de filtro cambie por completo), coloque varias hojas de toalla de papel encima y haga que entre en contacto con el papel de filtro para eliminar el exceso de humedad. Retire la toalla de papel cuando absorba el agua y cambie de color. Repite este proceso dos o tres veces.</li>
	<li>Recoge los bordes del papel de filtro con unas pinzas, despégalo rápidamente de la placa, sumérgelo en nitrógeno líquido y congélalo. Si no dispone de nitrógeno líquido, coloque el papel de filtro en una bandeja de plástico con la colonia hacia arriba e inmediatamente colóquelo en un congelador (de -20 °C a -80 °C) para que se congele por completo.</li>
	<li>Retire el papel de filtro congelado y colóquelo, con la colonia hacia arriba, sobre una toalla de papel seca para descongelar. Inmediatamente después de descongelar, coloque el papel de filtro, con el lado de la colonia hacia arriba, sobre otro papel de filtro que se haya colocado en una bandeja de plástico o recipiente hermético y empapado con tampón Z (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl y 1 mM MgSO4, pH 7.0) que contenga X-gal (5-bromo-5-cloro-3-indolil-β-D-galactósido) y 2-mercaptoetanol9 (consulte la tabla de materiales). Tenga cuidado de no permitir que se formen burbujas de aire entre los papeles de filtro superior e inferior.</li>
	<li>Cubra la bandeja de plástico que contiene el papel de filtro y colóquela en un recipiente hermético o en una bolsa de plástico. Cierre el recipiente hermético o la bolsa de plástico e incube a 37 °C hasta que aparezca un color azul.</li>
	<li>Cuando aparezca un color azul, coloque el papel de filtro con el lado de la colonia hacia arriba sobre unos 500 μL de solución de parada (1 M Na2CO3) colocado en una bandeja de plástico limpia. La solución de parada se absorbe rápidamente; Por lo tanto, retire el filtro inmediatamente, colóquelo sobre una toalla de papel limpia con la colonia hacia arriba y deje que se seque.</li>
	<li>Después de reemplazar la toalla de papel y el filtro esté lo suficientemente seco, use un escáner u otro dispositivo para capturar los datos.</li>
</ol>4. Recuperación y confirmación de clones candidatos
<ol><li>Seleccione clones candidatos blancos y KanR de la placa original de la réplica (o de la placa replicada que no se utilizó para el ensayo de color). Los ejemplos se muestran en la Figura 1C. Confirme que los clones candidatos son blancos y KanR volviéndolos a rayar como un pequeño parche en un medio SC-LW que contenga kanamicina e incubándolos a 30 °C durante 1-2 días. Haz al menos dos series o haz réplicas al día siguiente. NOTA: Se deben seleccionar colonias blancas porque las colonias de color azul pálido podrían retener la interacción.</li>
	<li>Una vez que los clones candidatos hayan vuelto a crecer bien, repita el ensayo de color con al menos una placa generada en el paso 4.1 como se describe en el paso 3 y confirme que permanecen blancos y no se vuelven azules (Figura 2A). NOTA: Al volver a rayar los candidatos, no lleve grandes cantidades de celdas. Demasiadas células hacen que sea imposible distinguir los clones de KanR y KanS .</li>
	<li>Tome clones que aún sean blancos y KanR generados en el paso 4.2 a partir de los restos de la placa y cultívelos independientemente en 1 mL de medio de selección (SC-L o SC-W, dependiendo del vector que se utilice para la construcción de la biblioteca) durante la noche a 30 °C.</li>
	<li>Transfiera el cultivo a un microtubo y recoja las células por centrifugación (~ 15,000 × g, durante 10-30 segundos a temperatura ambiente). Aísle el ADN completo de la célula de la siguiente manera.</li>
	<li>Suspender el pellet celular en 400 μL de tampón de lisis (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-Cl (8.0) y 1 mM de EDTA) que contenga 1 μL de 2-mercaptoetanol y 20 mg/mL de Zymolyase 100T (ver Tabla de Materiales), e incubar a 37 °C durante 30 min para digerir las paredes celulares. En este momento, mezcle suavemente invirtiendo el tubo cada 5-10 minutos.</li>
	<li>Cuando la suspensión celular se haya vuelto opaca o translúcida, añadir un volumen igual de una mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y mezclar bien mediante vórtice a velocidad moderada durante 10-20 s.</li>
	<li>Centrifugar los microtubos en una microcentrífuga durante 5 minutos a máxima velocidad (~15.000 × g, a temperatura ambiente) y recuperar la fase acuosa que contiene el ADN en un nuevo microtubo. Añadir 0,8 volumen de isopropanol y mezclar bien invirtiendo el tubo.</li>
	<li>Deje el tubo a temperatura ambiente durante 2-3 minutos y luego centrifugar en una microcentrífuga durante 4-5 minutos a máxima velocidad (~15.000 × g, a temperatura ambiente) para precipitar el ADN.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y lavar el precipitado con unos 500 μL de etanol al 70%. Retire el etanol por completo y seque el precipitado brevemente.</li>
	<li>Agregue 20 μL de tampón TE (10 mM de Tris-Cl (8.0) y 1 mM de EDTA) al precipitado, mezcle brevemente y deje el tubo durante la noche a temperatura ambiente para disolver el precipitado. NOTA: Si los usuarios tienen prisa, mantenga los tubos a 37-50 °C. El precipitado de ADN se disolverá en unas pocas horas.</li>
	<li>Una vez que el gránulo esté completamente disuelto, transforme E. coli con una pequeña cantidad de esta solución de ADN. NOTA: Aproximadamente 0,5 μL de solución de ADN es suficiente si se utiliza E. coli con una alta eficiencia de transformación.</li>
	<li>Cuando aparezcan colonias de E. coli , elija varias colonias independientes, cultívelas y recupere los plásmidos mediante métodos estándar, como la lisis alcalina.</li>
	<li>Introduzca el ADN del plásmido obtenido en el paso 4.12 en las células huésped Y2H que albergan el plásmido cebo. Cuando aparezcan los transformantes, compruébelos mediante el ensayo de color (deben aparecer blancos) y el western blot4 (deben expresar una proteína del tamaño deseado). NOTA: El método post-alcalino12 es una forma fácil y rápida de preparar un extracto de célula entera a partir de levadura.</li>
	<li>Si se cumplen los dos criterios anteriores, determine el sitio de mutación de los clones mediante secuenciación de nucleótidos4.</li>
</ol>

Estudios de interacción biomolecular mediante la técnica de dos híbridos de levadura 

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Leanna, C. A., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reverse+two-hybrid+system%3A+A+genetic+scheme+for+selection+against+specific+protein%2Fprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).</li>
<li>Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+two-hybrid+and+one-hybrid+systems+to+detect+dissociation+of+protein-protein+and+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).</li>
<li>Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+isolation+of+interaction-null%2Fimpaired+mutants+using+the+yeast+two-hybrid+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique.</a> Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+4th+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
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<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>Bartel, P. L., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein-protein+interactions+using+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system.</a> Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+associates+with+the+loaded+DNA+helicase+at+replication+origins+and+defines+a+novel+step+in+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation.</a> EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).</li>
<li>Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+plays+a+role+in+functioning+of+the+eukaryotic+replicative+DNA+helicase%2C+cdc45-mcm-gins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins.</a> Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).</li>
<li>Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-initiation+complex+assembly+functions+as+a+molecular+switch+that+splits+the+mcm2-7+double+hexamer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer.</a> EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

En este artículo se describe cómo aislar mutantes nulos o deteriorados por interacción mediante el ensayo Y2H. Estos mutantes son herramientas poderosas para analizar la función de una proteína de interés. Para aislar dichos mutantes, se desarrollaron previamente ensayos de rY2H modificandola cepa 2,3 del huésped Y2H. Sin embargo, no han reducido en gran medida la cantidad de mano de obra. Por el contrario, los mutantes se pueden aislar con este método sin una ca...

Las interacciones entre biomoléculas son la parte más básica de los fenómenos biológicos. Las interacciones proteína-proteína constituyen una parte importante de dichas interacciones. Por lo tanto, la identificación de los socios de interacción de una proteína de interés es fundamental para dilucidar aún más la función de la proteína/gen de interés. El método de dos híbridos de levadura (Y2H) es una técnica popular para identificar interacciones proteína-proteína in vivo1. En este sistema, dos proteínas (X e Y) cuya interacción se va a probar se fusionan con el dominio de unión al ADN (DB) y el dominio de activación transcripcional (AD), respectivamente. La proteína de fusión DB-X se une a una secuencia de reconocimiento del dominio DB; por lo tanto, cuando las proteínas X e Y interactúan, la proteína de fusión AD-Y entra en la proximidad de la secuencia de reconocimiento. En consecuencia, se activa la transcripción del gen reportero aguas abajo de la secuencia de reconocimiento. Por lo tanto, la presencia o ausencia de actividad del gen reportero puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de la interacción proteína-proteína1.
Una vez que se identifica un socio de interacción específico de la proteína de interés, se deben realizar análisis adicionales para dilucidar la función biológica de la interacción. Para este propósito, si se pueden aislar los mutantes de las proteínas que perjudican o eliminan la interacción específica proteína-proteína, servirán como herramientas poderosas. El sistema Y2H se puede utilizar directamente para aislar dichos mutantes mediante el cribado de clones "negativos para la interacción", empezando por el clon de tipo salvaje "positivo para la interacción". Para acelerar este proceso, se desarrollaron sistemas Y2H "inversos" (rY2H) 2,3. En los sistemas rY2H, las cepas de levadura huésped albergan genes marcadores contraseleccionables como genes reporteros, lo que significa que las células de levadura crecen solo cuando las proteínas AD-Y y DB-X no interactúan.
Aunque tanto el sistema Y2H como el rY2H permiten el aislamiento de mutantes con interacción negativa, el proceso de aislamiento de los mutantes es laborioso porque no todos los candidatos obtenidos mediante cribado portan el tipo de mutaciones deseado (normalmente mutaciones con cambio de sentido). El problema más grave es que una fracción significativa de los candidatos albergan mutaciones de cambio de marco o sin sentido, y es necesario realizar Western blot para excluir clones no deseados. Para superar este problema, se han desarrollado nuevos vectores plásmidos4. En estos vectores, KanMX, un marcador de resistencia a los fármacos, se posiciona fuera de marco aguas abajo del dominio DB o AD. El gen marcador se convierte en marco con el dominio DB o AD solo cuando se inserta el gen de interés. Cuando se introducen mutaciones aleatorias en el gen de interés, los mutantes indeseables, como los que tienen mutaciones con cambio de marco o mutaciones sin sentido, pueden eliminarse fácilmente mediante la selección de resistencia a los fármacos, y los candidatos portadores de mutaciones deseables con cambio de sentido pueden identificarse fácilmente con el cribado Y2H4. En este artículo se presenta un protocolo para aislar mutantes nulos/alterados de interacción de una proteína de interés utilizando esta estrategia.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (8,0)</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>14347-21</td><td></td></tr><tr><td>Solución SDS al 10% Fujifilm</td><td>Wako Pure Chemical Corp.</td><td>313-90275</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>135-07522</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kishida Chemical Co. Ltd.</td><td>110-64785</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galactopiranósido (X-Gal)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>021-07852</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>paramedium</td><td>AGR60</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina Sodio Fujifilm</td><td>Wako Pure Chemical Corp.</td><td>68-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Etiqueta anti-HA mAb-HRP-DirecT&nbsp; &nbsp;</td><td>Médico & Laboratorios Biológicos Co. Ltd.</td><td>M180-7</td><td></td></tr><tr><td>ADN de testículos de salmón Merck</td><td>KGaA.</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck KGaA.</td><td>9-0770-4-4L-J</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro para levantamiento de colonias (Grado 50)</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>1450-090</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro para levantamiento de colonias (No.4A)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>01411090</tr><tr><td>Papel de filtro para replicación (No.1)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>00011150</tr><tr><td>Sulfato G-418</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>075-05962</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Kishida Chemical Co., Ltd.</td><td>230-37585</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de litio dihidratado</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>20604-22</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&toro; 7H2O</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>131-00405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&toro; 12H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>10039-32-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31319-45</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&toro; 2H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31717-25</td><td></td></tr><tr><td>Toalla de papel</td><td>AS ONE Corp.</td><td>7-6200-02</td><td></td></tr><tr><td>fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>25970-56</td><td></td></tr><tr><td>ADN de plásmidos</td><td>: Proyecto Nacional de Recursos Biológicos - levadura (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de plásmidos,</td><td>Nippon Genetics Co., Ltd.</td><td>FG-90502</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol #4,000</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>11574-15</td><td></td></tr><tr><td>SC mezcla de doble puntera -Leu -Trp</td><td>Formedium</td><td>DSCK172</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonación sin costuras (ensamblaje In-Fusion</td>) <td>Takara Bio Inc.</td><td>#639648</td><td></td></tr><tr><td>Leche descremada en polvo</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>190-12865</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasa Taq (GoTaq Green Master Mixes)</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (hidroximetil) aminometano</td><td>paramedio</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Levadura Base de nitrógeno (YNB)</td><td>Para medio</td><td>CYN0210</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>07665-55</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Las interacciones proteína-proteína son uno de los procesos más básicos que subyacen a los fenómenos biológicos. Una de las formas más sencillas y mejores de comprender el papel y la función de una interacción proteína-proteína específica es comparar el fenotipo del tipo salvaje (con la interacción proteína-proteína relevante) y los de los mutantes que carecen de la interacción relevante. Por lo tanto, si estos mutantes se pueden aislar, ayudarán a dilucidar los procesos biológicos relacionados. El procedimiento de dos híbridos de levadura (Y2H) es un enfoque poderoso no solo para detectar interacciones proteína-proteína, sino también para aislar mutantes nulos o deteriorados de interacción. En este artículo, se presenta un protocolo para aislar mutantes nulos o deteriorados por interacción utilizando la tecnología Y2H. En primer lugar, se construye una biblioteca de mutaciones combinando la reacción en cadena de la polimerasa y una eficiente tecnología de clonación sin fisuras, que excluye eficazmente el vector vacío de la biblioteca. En segundo lugar, los mutantes nulos o deteriorados por interacción se examinan mediante el ensayo Y2H. Debido a un truco en el vector Y2H, los mutantes no deseados, como aquellos con cambio de marco y mutaciones sin sentido, se eliminan de manera eficiente del proceso de detección. Esta estrategia es simple y, por lo tanto, se puede aplicar a cualquier combinación de proteínas cuya interacción pueda ser detectada por el sistema de dos híbridos.

Recientemente, se descubrió que la mitad C-terminal de la proteína Pol2 (Pol2-C) interactúa con Mcm10. Ambas proteínas son esenciales para el inicio de la replicación del ADN y, por lo tanto, para el crecimiento celular en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Para ayudar a comprender la importancia biológica de esta interacción, se aislaron mutantes Pol2-C que no tienen interacción o tienen una inte...

Las interacciones de las biomoléculas, como las interacciones proteína-proteína, son la base molecular de las funciones biológicas. Si se pueden aislar mutantes nulos/deteriorados por interacción que carecen específicamente de la interacción relevante, serán de gran ayuda para comprender las funciones de esta interacción. Este artículo presenta una forma eficiente de aislar mutantes nulos o deteriorados por interacción.

Aislamiento de mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

Estamos interesados en comprender los mecanismos reguladores del ciclo celular en eucariotas, especialmente la relación entre la replicación del ADN, el mantenimiento estable de los gérmenes y la proliferación celular. La progresión del ciclo celular está regulada por quinasas dependientes de ciclinas, o CDK, en los eucariotas. Este es el caso del inicio de la replicación del ADN.Hemos identificado una forma, en sustratos de CDKs, de iniciar la replicación del ADN. Para comprender la función de la proteína de su interés, una comparación entre el tipo salvaje y el mutante es una forma directa y efectiva. El ensayo de dos híbridos de levadura, al ser de detección sencilla y mejorará el proceso de aislamiento de mutantes nulos de interacción.Esto contribuirá al avance de la investigación en este campo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

MITO permite la detección sensible de las interacciones transitoria y estable entre las proteínas que se expresan en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae. Se ha aplicado con éxito para estudiar las proteínas integrales de membrana exógenos y la levadura con el fin de identificar a sus socios que interactúan de un modo de alto rendimiento.

Split-ubiquitina levadura membrana base de dos híbridos (MITO) del sistema: Una poderosa herramienta para identificar interacciones proteína-proteína

Hemos modificado la levadura de dos híbridos convencionales de detección, una herramienta eficaz en la identificación genética interacción de proteínas. Esta modificación notable acorta el proceso, reduce la carga de trabajo, y lo más importante, reduce el número de falsos positivos. Además, este método es reproducible y confiable.

Modificado levadura sistema híbrido de dos para identificar proteínas que interactúan con el factor de crecimiento progranulina

Este video muestra el ensayo de dos híbridos de levadura para detectar autointeracciones de proteínas específicas. En este ensayo, la proteína de interés se marca con dos dominios de un factor de transcripción que codifica la enzima β-galactosidasa. Cuando las dos proteínas interactúan, esto hace que la transcripción y la traducción formen la enzima, que luego se detecta mediante un ensayo bioquímico.

Ensayo de dos híbridos de levadura para determinar la autoasociación de proteínas en células de levadura

En este video, demostramos el ensayo de un híbrido de levadura modificada, que detecta múltiples proteínas que interactúan con el ADN objetivo. Las células de levadura transformadas contienen la secuencia de ADN diana aguas arriba del gen reportero. Además, expresan proteínas factores de transcripción. Cuando las proteínas forman complejos y se unen al ADN diana, el gen reportero se expresa y puede detectarse enzimáticamente.

Ensayo híbrido de levadura y uno modificado para detectar interacciones heteroméricas entre el complejo de proteínas y el ADN

Este artículo se centra en la identificación de la interacción de datos de alta confianza entre anfitrión y proteínas de patógenos utilizando una combinación de los dos métodos ortogonales: levadura de dos híbridos seguido de un ensayo de interacción de alto rendimiento en células de mamífero llamado HT-GPCA.

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

El ketoconazol se une a y antagoniza pregnano X activación del receptor (PXR). De levadura de alto rendimiento pantallas de mutantes PXR definen una región única para la unión ketoconazol. Este método de genética de la levadura descubre la interacción del receptor nuclear novedosas con ligandos que se asocian con los sitios de unión de la superficie.

Invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos Receptor Nuclear Residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas

La oligomerización del receptor de rianodina, un canal iónico homotetrámero que media la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares, es fundamental para la contracción del músculo esquelético y cardíaco. Aquí, presentamos métodos complementarios in vivo e in vitro para detectar la autoasociación de proteínas y determinar la estequiometría de homooligómeros.

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

proteínas efectoras bacterianas son importantes para establecer infecciones exitosas. Este protocolo describe la identificación experimental de parejas de unión proteica de una proteína efectora bacteriana en su huésped natural de la planta. La identificación de estas interacciones efectoras a través de levadura híbrido de dos pantallas se ha convertido en una herramienta importante en el descubrimiento de estrategias moleculares de patogenicidad.

Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

Procesamiento por lotes de pantallas 2-híbrido de levadura permite la comparación directa de los perfiles de la interacción de múltiples proteínas de cebo con un sistema altamente complejo presa de proteínas de fusión. Aquí, describimos métodos de refinado, nuevos reactivos y cómo implementar su uso para esas pantallas.

Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

Presentamos un protocolo de pantalla simple supresor en fisión levaduras. Este método es eficiente, libre de mutágeno y selectivo para las mutaciones que ocurren a menudo en un locus genómico.  El protocolo es conveniente para aislar los supresores que paliar defectos de crecimiento en cultivo líquido que son causados por una mutación o una droga.

Una pantalla de supresor asistida por secuenciación profunda, espontánea en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe

Aquí, presentamos una levadura mejorada Detección protocolo para identificar los factores de transcripción (TFs) que se pueden unir a una región de ADN humana de interés de uno híbrido. Este método utiliza una tubería de proyección de alto rendimiento que puede interrogar el atascamiento de &gt; 1.000 TFs en un solo experimento.

Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano

Aprende a aislar mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura para estudiar la regulación del ciclo celular y las quinasas dependientes de ciclinas en eucariotas.

Aislamiento de mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura

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