Name: Modelo de roedores de pérdida muscular volumétrica de masetero para el estudio de materiales de bioingeniería (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 46 s
Description: Aprende a crear un modelo de pérdida muscular volumétrica en el masetero de rata para estudiar regeneración craneofacial. Este protocolo permite evaluar biomateriales como hidrogeles y desarrollar nuevas terapias.

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<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de biomateriales en lesiones craneofaciales de VML mediante un modelo de rata

<ol><li>Gilbert-Honick, J., Grayson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+innervated+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Vascularized and innervated skeletal muscle tissue engineering.</a> Adv Healthc Mater. 9 (1), 1900626(2020).</li>
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<li>Greising, S. M., Corona, B. T., McGann, C., Frankum, J. K., Warren, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+approaches+for+volumetric+muscle+loss+injury%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B%3A+Rev%22%5BJournal%5D)">Therapeutic approaches for volumetric muscle loss injury: A systematic review and meta-analysis.</a> Tissue Eng Part B: Rev. 25 (6), 510-525 (2019).</li>
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<li>Emara, A., Shah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+update+on+craniofacial+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Recent update on craniofacial tissue engineering.</a> J Tissue Eng. 12, 204173142110037(2021).</li>
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<li>Pavlath, G. K., Thaloor, D., Rando, T. A., Cheong, M., English, A. W., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+among+muscle+precursor+cells+in+adult+skeletal+muscles+with+differing+regenerative+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities.</a> Dev Dyn. 212 (4), 495-508 (1998).</li>
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<li>Agarwal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+heavy+chain-embryonic+regulates+skeletal+muscle+differentiation+during+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myosin heavy chain-embryonic regulates skeletal muscle differentiation during mammalian development.</a> Development. 147 (7), (2020).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), e51586(2014).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+integration+into+3D+bioprinted+skeletal+muscle+constructs+accelerates+restoration+of+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Neural cell integration into 3D bioprinted skeletal muscle constructs accelerates restoration of muscle function.</a> Nat Commun. 11 (1), 1025(2020).</li>
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<li>VanSwearingen, J. M., Cohn, J. F., Bajaj-Luthra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+impairment+of+smiling+increases+the+severity+of+depressive+symptoms+in+patients+with+facial+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Specific impairment of smiling increases the severity of depressive symptoms in patients with facial neuromuscular disorders.</a> Aesthetic Plast Surg. 23 (6), 416-423 (1999).</li>
<li>Versnel, S. L., Duivenvoorden, H. J., Passchier, J., Mathijssen, I. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satisfaction+with+facial+appearance+and+its+determinants+in+adults+with+severe+congenital+facial+disfigurement%3A+A+case-referent+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plast+Reconstr+Aesthet+Surg%22%5BJournal%5D)">Satisfaction with facial appearance and its determinants in adults with severe congenital facial disfigurement: A case-referent study.</a> J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63 (10), 1642-1649 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>F1.652 Anticuerpo monoclonal de miosina de cadena pesada (embrionario)</td><td>DSHB</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG2b anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Punzones de biopsia estándar Integra, punzón de biopsia estándar desechable; 5 mm, Diámetro: 0,19 pulg., 0,5 cm</td><td>Integra</td><td>12460411</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje con DAPI - Acuoso, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Conejo Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 647) preadsorbido</td><td>Abcam</td><td>ab150127</td><td></td></tr><tr><td>Sulfametoxazol/Trimetoprim Suspensión Oral, Sabor a Cereza, 473 mL</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU: RXBAC-SUSP</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de roedores de pérdida muscular volumétrica de masetero para el estudio de materiales de bioingeniería

Rodent Model of Masseter Volumetric Muscle Loss for Studying Bioengineering Materials

Los resultados de la evaluación de la LMV craneofacial y la regeneración tisular mediante biomateriales incluyen resultados cuantitativos y cualitativos.
La Figura 2 muestra un ejemplo de evaluación cualitativa utilizando el modelo descrito anteriormente. La observación del crecimiento de novo de la fibra muscular dentro de nuestro hidrogel es un resultado cualitativo positivo (Figura 2A) y sugiere que un biomaterial puede proporcionar suficiente soporte arquitectónico y factor de crecimiento o suministro de nutrientes. La retención de hidrogel dentro del lecho de la herida (Figura 2B) es visible en la tinción HE. Se puede realizar una evaluación cualitativa de otros tejidos dentro de un biomaterial, como la identificación de vasos sanguíneos mediante HE (Figura 2C) y tricrómico de Masson (Figura 2D). Las ramas mandibular y bucal del nervio facial son visibles en las esquinas superior izquierda y superior derecha de la imagen en la Figura 2B, lo que confirma la correcta colocación del hidrogel en el lecho de lesión VML y proporciona orientación. Se observa una capa de fascia sobre el hidrogel, lo que confirma que el cierre fascial fue exitoso y permaneció intacto durante el período postoperatorio. Un resultado negativo observado en esta etapa incluiría la pérdida total del hidrogel (Figura 2E) o la pérdida del cierre fascial y la extrusión del lecho de la herida (Figura 2F), con EH que muestra evidencia de un lecho de la herida o cicatriz fibrótica dependiendo del tiempo transcurrido después de la operación.
El análisis inmunohistoquímico es fundamental en la evaluación de biomateriales para el tratamiento de la VML craneofacial con el fin de identificar los tipos de células y las interacciones moleculares a nivel celular. Debido a que la VML resulta en la pérdida de células residentes y arquitectura capaz de regenerar el músculo esquelético, la regeneración muscular de novo en el sitio lesionado es un resultado importante en el tratamiento4 y la evaluación de la eficacia en terapias basadas en biomateriales para VML. Las isoformas de miosina en desarrollo, incluidas la miosina embrionaria (MYH3) y neonatal (MYH8), se reexpresan en las fibras musculares esqueléticas en regeneración y proporcionan un marcador específico para la regeneración de fibras18,19. En la Figura 3 se muestra un ejemplo de cómo se puede utilizar la inmunohistoquímica para identificar tipos celulares de interés, en este caso, la cadena pesada de miosina embrionaria.
Por último, ImageJ se puede utilizar para cuantificar las características de los portaobjetos de histología, incluida la inmunohistoquímica y las tinciones especializadas como el tricrómico de Masson, para medir la respuesta fibrótica (Figura 4). La extirpación de una porción de músculo en las lesiones de VML cambia la arquitectura y la composición muscular, lo que conduce a un aumento de la deposición de colágeno I y fibrosis macroscópica del tejido compartimental 2,3. Muchos estudios que evalúan tratamientos basados en biomateriales para la VML comparan la fibrosis entre su grupo de intervención y los grupos control4. Utilizando el método descrito aquí, los lechos de las heridas en los animales que sufrieron una lesión VML se pueden identificar en el tricrómico de Masson como cicatrices fibróticas (Figura 4A). La deconvolución del color a través de ImageJ puede aislar y cuantificar el canal azul correspondiente al tejido conectivo (Figura 4B), y luego ajustarlo a escala de grises para la medición (Figura 4C). El área de la cicatriz se puede aislar y medir usando la Imagen J (Figura 4D) y calibrar a una barra de escala en la imagen para obtener un tamaño preciso y un área reproducible. Con este enfoque, se puede medir la deposición de tejido conectivo (Figura 4E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66450/66450fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema quirúrgico que muestra los pasos. (A,B) Lesión VML del masetero quirúrgico. (C) Aplicación de biomateriales. (D) Recolección de masas. E) Morfología muscular después de la recolección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66450/66450fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66450/66450fig02.jpg"> 
Figura 2: Tinción tricrómica de HE y Masson. (A) Secciones de masetero de rata teñidas con HE de la interfaz hidrogel-músculo con flechas que indican estructuras identificadas morfológicamente como fibras musculares esqueléticas. (B) Sección de masetero de rata teñida con HE que demuestra la abundancia de fibras de músculo esquelético en todo el hidrogel. (C) tejido teñido con HE y (D) tejido teñido con tricrómico de Masson con flechas que indican estructuras identificadas morfológicamente como vasos sanguíneos. (E,F) Los resultados negativos mostraron pérdida completa del hidrogel con gel adherido a la cara superficial del masetero en lugar del lecho de la herida y pérdida incompleta del hidrogel con pérdida del cierre fascial, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66450/66450fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66450/66450fig03.jpg"> 
Figura 3: Tinción inmunohistológica para la cadena pesada de miosina embrionaria (eMHC) y laminina en cortes transversales de masetero de rata. (A) 2 semanas después de la cirugía. (B) 12 semanas después de la cirugía. Se observa un aumento de la concentración de eMHC en la muestra de 12 semanas en relación con la muestra de 2 semanas. Imágenes capturadas con un aumento de 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66450/66450fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66450/66450fig04.jpg"> 
Figura 4: Análisis cuantitativo de la fibrosis. (A) Sección de masetero de rata teñido con tricrómico de Masson para la cuantificación de la deposición de tejido conectivo como indicador de la fibrosis de la herida después de la lesión de VML a las 12 semanas. (B) Se utilizó la imagen J para deconvoluciar el canal azul correspondiente al tejido conectivo. (C) La imagen se convirtió a escala de grises para su análisis. (D) Se aisló el área correspondiente a la cicatriz fibrótica, y (E) se calculó el área de la sección transversal y los porcentajes del campo correspondientes al blanco (fondo) y al negro (tejido conectivo). Imágenes capturadas con microscopía óptica con un aumento de 10x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66450/66450fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Modelo de roedores de pérdida muscular volumétrica de masetero para el estudio de materiales de bioingeniería

Craniofacial volumetric muscle loss (VML) injuries can occur as a result of severe trauma, surgical excision, inflammation, and congenital or other ...

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Bioingeniería

Las lesiones por pérdida muscular volumétrica (VML) superan la capacidad regenerativa endógena, lo que resulta en déficits funcionales permanentes. La investigación actual de VML se centra principalmente en los músculos de las extremidades y el tronco. Para extender los estudios mecanicistas de la VML a los músculos craneofaciales, este artículo describe un método in vivo para la evaluación longitudinal de la función del músculo masetero antes y después de la lesión de la VML.

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Aprende a crear un modelo de pérdida muscular volumétrica en el masetero de rata para estudiar regeneración craneofacial. Este protocolo permite evaluar biomateriales como hidrogeles y desarrollar nuevas terapias.

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