Name: Aislamiento rápido de ovocitos en estadio I en pez cebra desprovistos de células granulosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprende a aislar rápidamente ovocitos en estadio I libres de células granulosas en pez cebra. Este método modificado facilita análisis precisos de genoma y epigenética en investigación de biología del desarrollo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Procedimiento mejorado para obtener ovocitos de pez cebra en etapa I libres de células de la granulosa

<ol><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanism+of+long-term+bisphenol+S+exposure+disrupted+ovarian+lipids+metabolism%2C+oocytes+maturation%2C+and+offspring+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish.</a> Chemosphere. 277, 130304(2021).</li>
<li>Hau, H. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Larp6+controls+oocyte+development%2C+chorion+formation+and+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation.</a> Development. 147 (4), 187385(2020).</li>
<li>Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+ski7+tunes+RNA+levels+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition.</a> PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+reveals+insights+into+the+development+and+function+of+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary.</a> Elife. 11, 76014(2022).</li>
<li>Li, C. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+expression+of+bone+morphogenetic+protein+family+ligands+and+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+A+potential+paracrine-signaling+mechanism+for+oocyte-follicle+cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication.</a> Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).</li>
<li>Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+proteins+F-actin+and+tubulin+distribution+and+interaction+with+mitochondria+in+the+granulosa+cells+surrounding+stage+III+zebrafish+%28Danio+rerio%29+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes.</a> Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).</li>
<li>Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+teleosts%3A+How+eggs+are+formed%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in teleosts: How eggs are formed.</a> Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).</li>
<li>Song, Y., Hu, W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+models+expressing+fluorescence+proteins+in+the+oocytes+and+somatic+supporting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).</li>
<li>Sousa, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+hormones+affect+follicular+cells+and+ooplasm+of+stage+I+and+II+oocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish.</a> Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).</li>
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<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, R. A., Selman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+aspects+of+oogenesis+and+oocyte+growth+in+fish+and+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians.</a> J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).</li>
<li>Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+analysis+of+early+oogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish.</a> Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).</li>
<li>Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+oocyte+and+follicle+layer+for+gene+expression+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).</li>
<li>Zhan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explorations+of+the+optimal+method+for+isolating+oocytes+from+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+B+Mol+Dev+Evol%22%5BJournal%5D)">Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary.</a> J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).</li>
<li>Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals">https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals</a> (2020).</li>
<li>Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction">https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction</a> (2015).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Solución de disociación celular de Kinger</td><td>PlantChemMed</td><td>PC-33689</td><td>La solución de disociación celular de Kinger se puede almacenar de manera estable a -20 &deg; C después del empaque y se puede usar después de descongelar a baja temperatura (4 &deg; C). Se puede utilizar directamente para disociar los ovarios del pez cebra. La temperatura óptima es de 28,5 °C; C, durante aproximadamente 2-3 horas. La duración se puede ajustar de acuerdo con las condiciones específicas de disociación, ya sea acortada o extendida (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).</td></tr><tr><td>Filtros de células (100 &mu; m )</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Aguja capilar de vidrio</td><td>/</td><td>/</td><td>Embotado por combustión con mechero</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Yesen</td><td>40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de baja adsorción (10 &mu; l )</td><td>Labsellect</td><td>T-0010-LR-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 medio medio (con L-glutamina)</td><td>Hyclone</td><td>SH30525.01</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de hielo</td><td>/</td><td>/</td><td>Se utiliza agua helada para sacrificar al pez cebra</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>WIGGENS</td><td>WH-01</td><td></td></tr><tr><td>Peces juveniles</td><td>/</td><td>/</td><td>5&ndash; 6 semanas después de la fertilización, longitud estándar [SL] de 10 &ndash; Plato de plástico de 15 mm</td></tr><tr><td>(35 mm)</td><td>SORFA</td><td></td> 230101 <td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Motic</td><td>SMZ-161</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos (6 pocillos)</td><td>SORFA</td><td>0110006</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Fine Science Toosl</td><td>#15000-00</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento rápido de ovocitos en estadio i en pez cebra desprovistos de células granulosas

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

En la Figura 1 se ilustra la morfología ovárica observada tanto en el pez cebra adulto como en el juvenil, mostrando ovocitos en diferentes etapas de desarrollo para que sirvan de referencia. La figura 1A proporciona una representación gráfica de la morfología y el tamaño de los ovocitos en cada etapa del desarrollo, comenzando con la etapa de crecimiento primario (etapa I) y terminando con el óvulo ovulado (etapa V). Las figuras 1Ai-v ilustran los diámetros correspondientes a los estadios I a V de los ovocitos. La Figura 1B (panel izquierdo) muestra imágenes ováricas en peces juveniles (6 wpf con SL = 1,5 cm). En particular, el ovario juvenil exhibe una apariencia lobulillar distintiva, caracterizada principalmente por una abundancia de ovocitos transparentes en estadio I, acompañados de una población más pequeña de ovocitos en estadio II. Esta prevalencia de ovocitos en estadio I facilita enormemente su observación y recuperación. El panel de la derecha muestra la morfología del ovario de los peces adultos (6 meses), donde se pueden observar ovocitos en diversas etapas de desarrollo. Sin embargo, en el ovario predominan los ovocitos opacos en estadio tardío (estadio II-III).
La figura 2 ilustra los procesos representativos desde la disección hasta la obtención de ovocitos limpios en estadio I. En la Figura 3 se presentan los ovocitos en estadio I obtenidos tanto por el método de referencia como por el método modificado. Después de la tinción de Hoechst, los núcleos de los ovocitos y de las células de la granulosa exhibieron fluorescencia azul bajo luz ultravioleta. En las imágenes obtenidas con el método de referencia (Figura 3A), la superficie de los ovocitos estaba densamente rodeada por numerosos núcleos de células granulosas teñidas. Por el contrario, los ovocitos en estadio I separados por el método modificado (Figura 3B) presentan una exposición y limpieza completas, sin tinción de núcleos de células de la granulosa.
Nuestros hallazgos demostraron la efectividad del método propuesto para aislar ovocitos en estadio I. El proceso de desarrollo de los ovocitos en peces teleósteos exhibe varias características comunes7. Para evaluar su aplicabilidad entre especies, se realizaron análisis adicionales en otras especies de peces. Las lochas hembras de estanque se adquirieron en un mercado local, y los ovocitos en etapa temprana (diámetro &lt;100 μm) se aislaron siguiendo el mismo procedimiento. La composición ovárica de la locha de estanque también mostró una mezcla de ovocitos en múltiples etapas de desarrollo, caracterizada por una sorprendente semejanza en la morfología y el tamaño de los ovocitos con el pez cebra durante la misma etapa. Como se ilustra en la Figura 4A, los ovarios de las hembras adultas de locha de estanque estaban dominados por ovocitos tardíos opacos intercalados con ovocitos tempranos transparentes. Se observó una clara monocapa de células de la granulosa en la superficie de los ovocitos. De acuerdo con nuestras observaciones en pez cebra, los ovocitos de locha que miden menos de 100 μm de diámetro corresponden a la etapa anterior a la etapa de diploteno. La Figura 4B muestra los ovocitos limpios de locha de estanque (Misgurnus anguillicaudatus) obtenidos por el método modificado. En comparación con los ovarios del pez cebra, los ovarios de locha de estanque son más difíciles de disociar. Después de 6-7 h de digestión, los ovocitos en etapa temprana se disocian. No obstante, este enfoque ajustado produjo los ovocitos limpios y desnudos deseados. El pez cebra pertenece a la familia Cyprinidae, mientras que las lochas de estanque se clasifican dentro de la familia Cobitidae. Estas dos familias exhiben una relación taxonómica distante, pero su etapa de desarrollo ovárico y morfología son notablemente similares, lo que indica que este método generalmente se puede utilizar para analizar ovocitos de varias especies de peces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig01v2.jpg"> Figura 1: Imágenes representativas de ovarios y ovocitos de pez cebra en diferentes estadios. (A) Morfología y tamaño de los ovocitos en cada etapa de desarrollo (St). i-v representa las imágenes y el diámetro de los ovocitos desde el estadio I hasta el estadio V. Barra de escala = 200 μm. (B) Morfología ovárica del pez cebra adulto y juvenil. Barras de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig02v2.jpg"> Figura 2: Imágenes representativas del procedimiento de aislamiento, desde la disección hasta la adquisición de ovocitos limpios en estadio I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig03.jpg"> Figura 3: Ovocitos en estadio I obtenidos a través de los dos métodos. (A) Ovocitos en estadio (St) I aislados por el método referenciado. (B) Ovocitos en estadio I aislados mediante el método modificado. Los núcleos de los ovocitos y de las células de la granulosa se tiñeron con Hoechst y se excitaron con luz ultravioleta. Barras de escala = 100 μm. BF = campo claro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig04.jpg"> Figura 4: Ovocitos en estadio temprano de locha de estanque obtenidos por el método modificado. (A) Imágenes representativas de ovario y ovocitos de locha de estanque. I, II representan los ovarios de las lochas de estanque bajo diferentes aumentos, y III-IV representan los ovocitos en etapa temprana de las lochas de estanque. Barras de escala: i (500 μm); II (200 μm); III, IV (100 μm). (B) Ovocitos en etapa temprana aislados de locha de estanque. Los ovocitos y los núcleos de las células de la granulosa se tiñeron con Hoechst y se excitaron con luz ultravioleta. Barras de escala = 100 μm. BF = campo claro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aislamiento rápido de ovocitos en estadio I en pez cebra desprovistos de células granulosas

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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La utilidad de la etapa específica-Mediados o finales<em&gt; Drosophila</em&gt; Aislamiento folículo

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