Name: DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Descubre el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzima 10-23 para la detección selectiva de ácidos nucleicos. Este protocolo utiliza software gratuito y demuestra su aplicación en la detección de fragmentos del virus Epstein-Barr.

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<meta charset="utf8"></head><body>Nanomáquinas de precisión DNAzyme para el análisis discriminativo de ARN y ADN

<ol><li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+hybridization+probes+to+DNA+machines+and+robots%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots.</a> Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).</li>
<li>Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+hybridization+probes+for+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection.</a> Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).</li>
<li>Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sides+of+the+coin%3A+affinity+and+specificity+of+nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Tr+Bioche+Sc%22%5BJournal%5D)">Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions.</a> Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+probes+for+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Binary probes for nucleic acid analysis.</a> Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).</li>
<li>Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+hybridization+probes+for+sensitive+and+selective+DNA+and+RNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection.</a> Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+16S+rRNA+using+a+molecular+beacon-based+X+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor.</a> Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).</li>
<li>Dark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+LightCycler+Septi+Fast+for+the+detection+and+identification+of+pathogens+in+the+blood+of+patients+with+suspected+sepsis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis.</a> Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).</li>
<li>Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Detection+of+Stem-Loop+Primer+Amplification+%28SPA%29+products+without+denaturation+using+peroxidase-like+DNA+machines+%28PxDM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sc%22%5BJournal%5D)">Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM).</a> Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).</li>
<li>Gorbenko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+nanomachine+for+visual+detection+of+structured+RNA+and+double+stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Comm%22%5BJournal%5D)">DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA.</a> Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).</li>
<li>Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+using+G-quadruplex+amplification+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies.</a> Methods. 64 (3), 185-198 (2013).</li>
<li>Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MNAzymes%2C+a+versatile+new+class+of+nucleic+acid+enzymes+that+can+function+as+biosensors+and+molecular+switches%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches.</a> JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+cleaving+deoxyribozyme+sensor+for+nucleic+acid+analysis%3A+the+limit+of+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection.</a> Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+16S+RNA+in+a+signal-producing+structure+for+detection+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria.</a> Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).</li>
<li>Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+M+%22Chin.+Chem+Let%22">Chin. Chem Let</a>. , 109232(2023).</li>
<li>Peeters, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+PCR-amplified+DNAzyme+activity+for+real-time+FO-SPR+detection+of+the+MCR-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene.</a> Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).</li>
<li>Wood, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+typing+of+nontuberculous+Mycobacteria+by+use+of+deoxyribozyme+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors.</a> Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).</li>
<li>Yan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralow+background+one-pot+detection+of+Lead+%28II%29+using+a+non-enzymatic+double-cycle+system+mediated+by+a+hairpin-involved+DNAzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme.</a> Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).</li>
<li>Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subzymes%3A+Regulating+DNAzymes+for+point+of+care+nucleic+acid+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sens.+Act.+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing.</a> Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).</li>
<li>Safdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-only%2C+microwell-based+bioassay+for+multiplex+nucleic+acid+detection+with+single+base-pair+resolution+using+MNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes.</a> Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).</li>
<li>Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+antenna+tile-associated+deoxyribozyme+sensor+with+improved+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity.</a> Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).</li>
<li>Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+minimachine+for+selective+and+sensitive+detection+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA.</a> Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).</li>
<li>Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Nanomachine+%28DNM%29+Biplex+Assay+for+Differentiating+Bacillus+cereus+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sc%22%5BJournal%5D)">DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species.</a> Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).</li>
<li>El-Deeb, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+home+test+for+COVID-19+diagnosis%3A+DNA+machine+for+amplification-free+SARS-CoV-2+detection+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples.</a> Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).</li>
<li>Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+DNAzyme-based+fluorescent+biosensor+for+detection+of+RNA-containing+Nipah+henipavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus.</a> Biosensors. 13 (2), 252(2023).</li>
<li>Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barley+haplotyping+using+biplex+deoxyribozyme+nanomachine%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Act+Rep%22%5BJournal%5D)">Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine.</a> Sens Act Rep. 4, 100132(2022).</li>
<li>Okonechnikov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unipro+UGENE%3A+a+unified+bioinformatics+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit.</a> Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li>
<li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DINAMelt+web+server+for+nucleic+acid+melting+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction.</a> Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).</li>
<li>Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+hybridization+enables+discrimination+of+a+point+mutation+within+5-40+C%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C.</a> JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).</li>
<li>Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+dynamic+gated+and+cascaded+transient+DNAzyme+networks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks.</a> ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).</li>
<li>Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+kinetics+of+the+10-23+RNA-cleaving+DNAzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sc%22%5BJournal%5D)">Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme.</a> Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).</li>
<li>Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular-beacon-based+tricomponent+probe+for+SNP+analysis+in+folded+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem-eur+J%22%5BJournal%5D)">Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids.</a> Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).</li>
<li>MacDougall, D., Crummett, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+data+acquisition+and+data+quality+evaluation+in+environmental+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry.</a> Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expedited+quantification+of+genetically+modified+ribosomal+RNA+by+binary+deoxyribozyme+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors.</a> RNA. 10, 1834-1843 (2015).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+16S+RNA+in+a+signal-producing+structure+for+detection+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria.</a> Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).</li>
<li>GC Content Calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU">https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU</a> (2023).</li>
<li>Hussein, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAzyme+nanomachine+with+fluorogenic+substrate+delivery+function%3A+advancing+sensitivity+in+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection.</a> Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).</li>
<li>Safdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-only%2C+microwell-based+bioassay+for+multiplex+nucleic+acid+detection+with+single+base-pair+resolution+using+MNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes.</a> Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxyribozyme+cascade+for+visual+detection+of+bacterial+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA.</a> Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).</li>
<li>Eckert, K. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity+and+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Res%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction.</a> Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).</li>
<li>Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems%3A+Programmable+nuclease+revolutionizing+the+molecular+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis.</a> Mol Biotech. , (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 mL</td><td>Biofil CFT011015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp+ DNA Ladder</td><td>Evrogen</td><td>NL002</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; L pipeta</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro1000</td><td></td></tr><tr><td>10-100 &micro; L pipeta</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro100</td><td></td></tr><tr><td>1-10 &micro; L pipeta</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro10</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; L pipeta</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro200</td><td></td></tr><tr><td>2-20 &micro; Pipeta L</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro20</td><td></td></tr><tr><td>4x Tinte de carga de gel</td><td>Evrogen</td><td>PB020</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida 4K</td><td>AppliChem</td><td>A1090,0500</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Carl Roth</td><td>2809447</td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td></td><td>https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Bisacrilamida</td><td>Molekula</td><td>22797959</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>TechSnab</td><td>H-0202</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td>12003153</td><td></td></tr><tr><td>Costar Placa de poliestireno negro de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>COS3915</td><td></td></tr><tr><td>DinaMelt</td><td>Instituto</td><td></td> de ARN <td>http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>Am-O105</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>BioLabMix</td><td>EtBr-10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Amresco</td><td>Am-O485</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>AppliChem</td><td>131396</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658001EDU</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 10 &micro; Puntas en L</td><td>Kirgen</td><td>KG1111-L</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 1000 &micro; Puntas en L</td><td>Kirgen</td><td>KG1636</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 200 &micro; Consejos L</td><td>Kirgen</td><td>KG1212-L</td><td></td></tr><tr><td>Pixelmator Pro</td><td>Pixelmator Team</td><td></td><td>https://www.pixelmator.com/pro/</td></tr> <tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Carl Roth</td><td>1782751</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Fuente de alimentación</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de ARNasa/ADNasa</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Película de sellado para placas de PCR</td><td>Sovtech</td><td>P-502</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Vekton</td><td>HCh (0,1)</td><td></td></tr>Spark lector de <tr><td>microplacas multimodo</td><td>Tecan</td><td>Spark- 10M</td><td></td></tr><tr><td>T100 amplificador</td><td>BioRad</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Molekula</td><td>68604730</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Amresco</td><td>Am-O497</td><td></td></tr><tr><td>UNAFold</td><td>Instituto</td><td></td> de ARN <td>http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>LOIP</td><td>LB-140<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Oligos utilizados</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Analito: </fuerte></td><td>Evrogen</td><td></td><td>orden directo, purificación</td></tr> <tr><td>de desalinización estándarGAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGGGG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tile-Arm3:</td><td>Evrogen</td><td></td><td>pedido directo, purificación de desalinización estándar</td></tr><tr><td>CCG GGCTGCTGTGTCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT</td><td>Evrogen</td><td></td><td>pedido directo, purificación de desalinización estándar</td></tr><tr><td>Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCTCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA</td><td>Evrogen</td><td></td><td>pedido directo, purificación</td></tr> <tr><td>de desalinización estándar<fuerte>F-sub oligonucleótido: </fuerte> AAGGTT (FAM) TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1</td><td>Orden directo de ADN-Syntez</td><td></td><td>, purificación de HPLC</td></tr></tbody></table>

dnazyme 10-23 - nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

El objetivo del primer experimento fue mostrar el ensamblaje del DNM antes del fragmento sintético del analito. Todos los hilos de DNM constituyentes se añadieron al tampón de reacción y se ensamblaron en el vaso de precipitados. El complejo DNM ensamblado fue evaluado para determinar su tamaño y homogeneidad correctos por PAGE nativo. La página nativa muestra el DNM ensamblado con el analito en el carril 1 y dos hebras de DNM en los carriles 2 y 4. Si la nanomáquina de ADN no estuviera ensamblada, serían visibles 2 o 3 bandas separadas en lugar de una sola banda de baja movilidad (carril 2 en la Figura 2A).
La segunda parte del Protocolo implica la caracterización funcional del rendimiento del DNM y la detección de ácidos nucleicos objetivo. En este estudio se utilizó el fragmento sintético de EBV 13972-14154. Para ello, los fragmentos de los DNMs preensamblados, junto con el Dza, se incubaron con diversas concentraciones del analito durante 1 h a 55 °C. Se midieron dos valores de señal fluorescente de control: el de los fragmentos de DNMs preensamblados y Dzb sin el analito (blanco), y el del fondo de F-sub (básico). Se realizaron tres mediciones técnicas. En cuanto a las estadísticas, también se han realizado tres ensayos independientes. Cabe destacar que la concentración de magnesio en este estudio es superior a lo que se puede encontrar en la literatura30. Los altos niveles de iones de magnesio aumentan la señal en todos los tubos de ensayo, ya que promueven una escisión espontánea de F-sub31. Optimizamos la composición del tampón de reacción durante las etapas preliminares del desarrollo de la tecnología y no repetimos este proceso con cada estudio realizado.
Después de 1 h de incubación, la fluorescencia de la muestra se midió utilizando un espectrofluorómetro (ver Tabla de Materiales). Para confirmar la detección del ADN analizado por el DNM, se comparó la señal fluorescente del sensor ensamblado con el ADN analizado y la del testigo negativo, que no contiene ningún analito añadido. La relación señal/blanco (una relación entre las unidades de fluorescencia relativa media de los pocillos que contienen el analito y los pocillos que no tienen analito) no debe ser inferior a 1,5 para confirmar el éxito de la detección32. La relación entre el blanco y el principio básico (fluorescencia de la respuesta del sensor en ausencia de analito dividida por la del control F-sub solamente) debe estar en el rango de 1,1-1,5; esta relación se puede ajustar cambiando las concentraciones de DNM y Dzb (el rango de concentración típico para cada uno es de 5 a 20 nM). En nuestra práctica, el LOD se cuantifica como la intersección de la línea de tendencia y tres desviaciones estándar por encima del blanco medio (Figura 2B). El DNM es efectivo si el LOD es de &lt;100 pM33. El DNM debe rediseñarse si el LOD es superior a 100 pM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66461/66461fig01.jpg"> Figura 1: Los tres brazos DNM utilizados en este estudio. Tres oligonucleótidos, Dza, Dzb-Tile y Tile-Arm3, están marcados como verde, azul y morado, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66461/66461fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66461/66461fig02.jpg"> Figura 2: Caracterización del DNM. (A) Montaje del DNM mediante electroforesis nativa en gel de poliacrilamida al 12%, 80 V, 1 h, utilizando una escalera de ADN de 50 bp+. B) El límite de detección de ADN sintético después de 60 minutos de incubación a 55 °C. La línea horizontal representa el umbral y la línea vertical es el LOD. Los valores promedio de tres mediciones independientes se presentan con una desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66461/66461fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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