Name: Administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Aprende a administrar vectores AAV9 por vía intratecal en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar. Este protocolo quirúrgico permite evaluar la eficacia de terapias génicas en modelos pediátricos de enfermedades del sistema nervioso central.

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Los autores desean agradecer a Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi y Lacey Stearman de UT Southwestern por una discusión productiva sobre el desafío que plantean las ratas juveniles para la inyección intratecal. Este trabajo fue financiado en parte por Jaguar Gene Therapy (a JLFK).

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory (IACUC). En el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (28-30 días de edad, masa en el rango de aproximadamente 90-135 g, machos y hembras).
1. Preparación del vector
<ol><li>Descongele el vector AAV9 (consulte la Tabla de materiales) en hielo al comienzo del procedimiento.</li>
	<li>Centrifugar brevemente el tubo de microcentrífuga que contiene el vector en una centrífuga de mesa para asegurarse de que todo el líquido esté en el fondo del tubo.</li>
	<li>Agite suavemente el tubo de la microcentrífuga para asegurarse de que la solución esté bien mezclada.</li>
</ol>2. Preparación de la jaula de recuperación
<ol><li>Coloque una jaula limpia sobre una manta eléctrica (consulte la Tabla de materiales) de modo que solo la mitad de la jaula esté en contacto con la manta.</li>
	<li>Ajuste la temperatura de la manta a ~37 °C.</li>
</ol>3. Preparación de la plataforma quirúrgica
<ol><li>Calentar una almohadilla isotérmica (ver Tabla de Materiales) a 39 °C en un microondas o en un baño de agua para que el contenido se vuelva líquido.</li>
	<li>Coloque la almohadilla isotérmica en la plataforma quirúrgica y cúbrala con una almohadilla de banco absorbente limpia.</li>
</ol>4. Preparación animal
<ol><li>Anestesiar a las ratas con isoflurano en una caja transparente (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Iniciar la inducción anestésica con isoflurano al 5% e ir disminuyendo un 1% por minuto hasta llegar al 2%. Sostenga al animal al 2% durante 3 minutos más.</li>
	<li>Mueva la caja que sujeta al animal a una campana extractora y abra la caja. NOTA: Esto limita la exposición del cirujano al anestésico.</li>
	<li>Retire el pelo del lomo del animal con una cortadora de pelo eléctrica. NOTA: Alternativamente, se puede utilizar una crema depilatoria o una maquinilla de afeitar manual y crema de afeitar.</li>
	<li>Coloque al animal en la plataforma quirúrgica con su hocico en el cono de la nariz de anestesia. NOTA: El animal puede comenzar a recuperar la conciencia mientras se retira el pelaje del sitio quirúrgico. Si esto sucede, anestesia nuevamente como se describió anteriormente.</li>
	<li>Aplique ungüento lubricante para los ojos en cada ojo para evitar que las córneas se sequen durante el procedimiento.</li>
	<li>Desinfecte el área quirúrgica con tres aplicaciones alternas de toallitas de povidona yodada e isopropanol.</li>
	<li>Inyecte los analgésicos por vía subcutánea. NOTA: La buprenorfina se utiliza generalmente en una dosis de 0,01-0,05 mg/kg, administrada cada 12 h. Alternativamente, se puede administrar una forma de liberación lenta de este fármaco una vez a 1 mg/kg para proporcionar un control adecuado del dolor durante 72 h. Consulte con la IACUC de la institución para conocer sus pautas con respecto al manejo del dolor.</li>
	<li>Inyectar 100 μL de lidocaína al 1% por vía subcutánea por encima de las apófisis espinosas L2 a L6 para proporcionar anestesia local.</li>
	<li>Coloque un rollo de papel toalla o un tubo de 1,5 cm de diámetro debajo del animal, justo rostral hasta las caderas. Esto ayuda a flexionar la columna vertebral, lo que facilita la inserción de la aguja entre las dos láminas.</li>
	<li>Coloque una cortina fenestrada (ver Tabla de Materiales) sobre el animal, centrando la fenestración sobre la columna lumbar.</li>
</ol>5. Exposición de la columna lumbar
<ol><li>Confirme la profundidad de la anestesia pellizcando cada una de las patas del animal y buscando la ausencia de una respuesta de retirada.</li>
	<li>Con una hoja de bisturí #11, haga una incisión de aproximadamente 3 cm de largo en la piel a lo largo de la línea media de L2 a L6.</li>
	<li>Afloje la piel del músculo insertando un par de tijeras quirúrgicas curvas estériles entre el músculo y la piel y luego abriendo las puntas.</li>
	<li>Retire la fascia que cubre las apófisis espinosas L2-L5.</li>
</ol>6. Carga de la jeringa
<ol><li>Pipetear 25-35 μL del vector (para lograr la dosis deseada) en la tapa de un tubo de microcentrífuga estéril.</li>
	<li>Introduzca todo el volumen en la jeringa de insulina. NOTA: Tenga cuidado de no aspirar aire durante este proceso.</li>
</ol>7. Realización de la inyección
<ol><li>Identificar las apófisis espinosas L5 y L4. NOTA: L6 se encuentra directamente entre las dos crestas ilíacas, y su apófisis espinosa debe ser fácil de identificar mediante un sondeo con un instrumento romo. A continuación, el instrumento se puede deslizar suavemente por la parte posterior para encontrar los límites de los procesos L5 y L4.</li>
	<li>Coloque una mano de modo que el pulgar descanse suavemente sobre la cola y una pata del animal. Use un dedo para estabilizar la jeringa.</li>
	<li>Coloque la aguja de la jeringa de modo que quede a la izquierda de la apófisis espinosa L5 y alineada con su extremo caudal. Coloque la jeringa de manera que esté a unos 30° de la línea media y 30° hacia arriba del plano de la mesa. NOTA: Puede ser útil utilizar un microscopio quirúrgico para identificar mejor los puntos de referencia y colocar la punta de la aguja.</li>
	<li>Avance la aguja de la jeringa hacia adelante unos 8 mm, sobre la parte superior de la lámina L5 y luego debajo de la lámina L4 en la cisterna lumbar hasta que se golpee el hueso. La colocación correcta dará como resultado una contracción de la pata y/o la cola que se puede ver o sentir con el pulgar apoyado en la pata/cola. Si no hay espasmo, retire la aguja e intente el procedimiento desde el lado izquierdo. Si aún no hay contracción, repita el procedimiento entre L4/L3 y L3/L2 según sea necesario.</li>
	<li>Presione el émbolo lentamente durante unos 5 s. NOTA: Puede haber un tic en la pata o la cola durante la inyección.</li>
	<li>Mantenga la jeringa en su lugar durante unos 30 segundos después de presionar completamente el émbolo para permitir que la presión se equilibre y minimice el reflujo de la inyección cuando se retire la aguja.</li>
	<li>Retire lentamente la aguja.</li>
</ol>8. Cierre de la incisión
<ol><li>Aproxima los bordes de la incisión.</li>
	<li>Comenzando en un extremo de la herida, use una sutura 4-0 (consulte la Tabla de materiales) o grapas quirúrgicas para cerrar la incisión.</li>
</ol>9. Recuperación y seguimiento
<ol><li>Coloque al animal en la jaula precalentada.</li>
	<li>Revise al animal al menos cada 15 minutos hasta que esté completamente ambulatorio. NOTA: Esto debería tardar entre 15 minutos y 45 minutos.</li>
	<li>Durante los próximos tres días, realice controles de bienestar al menos una vez al día. Proporcionar analgésicos durante los primeros 2 días después de la cirugía o según lo requiera la IACUC.</li>
	<li>Una semana después de la cirugía, retire las suturas o grapas.</li>
</ol>10. Procedimiento de seguimiento
NOTA: Para determinar la precisión de la técnica de inyección, inyecte el tinte azul de tripán como se describe anteriormente y luego eutanasique inmediatamente al animal (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) y realice una laminectomía para visualizar el resultado.
<ol><li>Mientras el animal permanece bajo anestesia, eutanasiarlo administrándole una dosis letal de pentobarbital mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 150 mg/kg.</li>
	<li>Una vez que cesan la respiración y la actividad cardíaca, abra la cavidad torácica para asegurar la muerte. Extienda la incisión quirúrgica por la espalda hasta el cuello.</li>
	<li>Hacer una incisión de 4 cm de largo en el músculo paralelo a la columna vertebral a ambos lados de las apófisis espinosas, manteniéndolo lo más cerca posible de las apófisis.</li>
	<li>Con pinzas finas o tijeras, retire el músculo de entre las apófisis espinosas.</li>
	<li>Retire las apófisis espinosas desde L6 hasta la columna torácica inferior con un rongeur (ver Tabla de Materiales). Evite los movimientos de torsión, ya que esto puede dañar los rongeurs.</li>
	<li>Inserte la punta inferior del rongeur debajo de la lámina L5 y retire el hueso que recubre la médula espinal sacando varias "mordidas" de él. NOTA: Tirar hacia atrás de la apófisis espinosa L6 puede facilitar la inserción de la punta del rongeur. Se debe tener cuidado para evitar daños en la médula espinal.</li>
	<li>Continuar expandiendo la laminectomía al menos cuatro láminas rostralmente. Inspecciona la superficie interior de las láminas en busca de signos de tinte, lo que puede indicar una inyección fallida.</li>
</ol>

Punción lumbar de AAV9 en ratas juveniles para terapia génica del SNC

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</ol>

El Dr. Donsante es inventor de una patente pendiente sobre la administración de vectores AAV9 en LCR.

Una amplia variedad de enfermedades afectan al SNC. Proporcionar una copia funcional del gen relevante a través de un vector viral es una estrategia de tratamiento atractiva para aquellos que son recesivos y de naturaleza monogénica, como la atrofia muscular espinal. Sin embargo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye la mayoría de los vectores de terapia génica administrados por vía intravenosa11. Aquellos que pueden atravesar la barrera hematoencefálica, como el AAV9, deben administrarse en dosis altas para superar la pérdida de vectores debida a la transducción periférica12. La edad también es una barrera. La exposición ambiental a los diversos serotipos de AAV aumenta con la edad13 y a menudo conduce a la producción de anticuerpos que pueden neutralizar los vectores terapéuticos14. Por lo tanto, la administración intravenosa de vectores de terapia génica para los trastornos del SNC generalmente se limita a los lactantes y no se usa en pacientes diagnosticados más tarde en la vida. 
Para los pacientes de edad avanzada, la inyección directa de vectores en el LCR puede producir una amplia transducción en el SNC, evitando tanto la BHE como los anticuerpos anti-AAV preexistentes15. Dado que este enfoque es específico, también se pueden utilizar dosis de vector más bajas. Existen dos abordajes principales en el entorno clínico: (1) punción lumbar y (2) inyección en los ventrículos laterales. Este último conlleva más riesgo, pero generalmente proporciona una mayor transducción cerebral. La punción lumbar es más segura, pero la transducción está sesgada hacia la médula espinal. La transducción cerebral podría mejorarse colocando al paciente en la posición de Trendelenburg, pero los datos al respecto son contradictorios16,17. El uso de un catéter para llegar a la cisterna magna a través de una punción lumbar puede proporcionar una mejor opción en la clínica, pero se encuentra en una etapa temprana de uso5. Puede haber otros desafíos para trasladar los enfoques elaborados en modelos animales a la clínica, como la pérdida de vectores debido a la fuga de LCR18 y la toxicidad en los ganglios de la raíz dorsal19.
En la mayoría de los estudios de terapias dirigidas al SNC realizadas en roedores se utilizan animales recién nacidos o adultos (>60 días de edad). Los neonatos tienen la ventaja de un tamaño corporal pequeño, lo que permite dosis efectivas más altas, y un sistema inmunitario inmaduro, lo que evita las complicaciones de una respuesta inmunitaria contra la terapéutica. Sin embargo, en términos de desarrollo cerebral, un ratón o rata recién nacido representa mejor una etapa fetal en los humanos. Para las terapias destinadas a niños en el rango de edad de 5 a 10 años, la rata juvenil (25-35 días de edad) es un mejor modelo en términos de desarrollo neurológico20. Dado que no se había descrito previamente un método de inyección intratecal para ratas jóvenes, y que los métodos establecidos para ratones adultos y ratas demostraron ser ineficaces en ratas a esta edad, se desarrolló el enfoque descrito anteriormente. Para ser claros, las ratas juveniles no solo son más pequeñas que las adultas, sino que también pueden diferir en la elasticidad de la duramadre que protege la médula espinal, lo que hace que un procedimiento que funciona para perforar esta capa en una rata adulta sea ineficaz en una rata juvenil.
Al aprender a realizar la inyección intratecal en ratas jóvenes, es necesario utilizar un colorante (como el azul de tripán) como sustituto de la terapia, y el usuario debe tener mucha confianza en su capacidad para realizar el procedimiento de forma exitosa y reproducible antes de comenzar un estudio con una terapia. Dominar la técnica requerirá práctica para adquirir experiencia con la sensación de la jeringa cuando la trayectoria es de objetivo frente a fuera de él. Hay dos errores comunes. Si el ángulo de aproximación es demasiado superficial, la aguja golpeará la parte superior de una de las láminas o la parte posterior de la lámina rostral. No habrá contracción y la distancia a la que avanza la aguja será de unos milímetros menos de 8 mm. Si el ángulo de abordaje es demasiado grande, existe el riesgo de que la aguja pase entre las dos láminas y penetre en la cavidad abdominal. Cuando esto sucede, la aguja avanzará mucho más de 8 mm. Si esto sucede, retire la aguja, vuelva a colocarla y vuelva a intentarlo. En las pocas ocasiones en que esto ha sucedido, la entrada transitoria de la cavidad abdominal unos pocos milímetros antes de la retirada y la reposición no ha causado ningún daño duradero aparente a los animales. 
Se ha encontrado que observar una respuesta física a la colocación de la aguja es fundamental para lograr la reproducibilidad con una alta tasa de éxito con este procedimiento. Cuando no hubo respuesta, la tasa de éxito de la inyección fue baja. Sin embargo, en algunos casos, un animal requirió intentos en múltiples sitios para lograr una respuesta, y se observaron trazas de tinte en una o más de las huellas de agujas anteriores. No se observó tinte en el espacio epidural, lo que sugiere que algunos de los pinchazos de aguja anteriores habían penetrado en la duramadre sin producir una contracción de la cola o la pata. Dado que el reflujo fue mínimo (similar a lo que se observa en la pista de la aguja de la inyección), se cree que el efecto de los pinchazos previos con la aguja en la eficacia de la administración en estos casos fue insignificante. 
Una vez que uno alcanza la competencia en la técnica de parto, se puede encontrar un segundo desafío no quirúrgico. Específicamente, en ratas adultas (~ 70 días de edad), la potencia de los vectores AAV9 para la entrega intratecal a la médula espinal y el cerebro puede variar sustancialmente de un lote a otro, incluso cuando son generados por el mismo núcleo vectorial. Algunos lotes se comportarán como se espera, produciendo transducción en la médula espinal de materia gris a lo largo de su longitud. Otros, sin embargo, no lograrán penetrar en la materia gris, principalmente transduciendo los ganglios de la raíz dorsal10. La causa de esta variabilidad no está clara, ya que los vectores son potentes in vitro y cuando se inyectan directamente en la médula espinal. Se recomienda realizar un estudio piloto de 3-4 animales con cualquier nuevo lote de virus para confirmar que el nuevo lote se comporta como se espera antes de comenzar un estudio a gran escala. La potencia puede evaluarse mediante inmunohistoquímica o tinción de inmunofluorescencia del producto transgénico de la proteína, o cuantificar la cantidad de genomas de ARNm o vectores transgénicos mediante PCR cuantitativa o ddPCR21. Además de las variables desconocidas que distinguen los lotes virales, pequeñas diferencias en la edad del animal, el volumen de inyección, la velocidad de entrega y la concentración del vector pueden causar variabilidad en los resultados. Antes de comenzar un estudio a gran escala, es posible que deban optimizarse para cada virus u otro agente terapéutico candidato.
Una vez entrenado, un cirujano experimentado puede completar el procedimiento de inyección intratecal de una rata juvenil en aproximadamente 30 minutos, desde la inducción de la anestesia hasta el comienzo del período de recuperación. Esto permite tratar a grandes cohortes en un corto período de tiempo. La recuperación de la cirugía también es rápida. La mayoría de los animales deambulan normalmente en 20-30 minutos. Después de realizar más de 200 de estas cirugías, no se han encontrado efectos adversos de este procedimiento. 
Por último, minimizar el sufrimiento de los animales y garantizar su bienestar durante los procedimientos quirúrgicos son consideraciones primordiales. Por lo tanto, se requiere el uso adecuado de anestésicos y analgésicos, y se debe mantener la temperatura corporal durante el procedimiento y hasta que el animal se recupere completamente de la anestesia. Los organismos reguladores pertinentes y el personal veterinario de las diferentes instituciones pueden tener diferentes requisitos y recomendaciones con respecto a estos temas. El uso de anestésicos y analgésicos descritos en este procedimiento se desarrolló en consulta con los veterinarios de la Universidad de Emory y el personal de la IACUC. Los investigadores deben trabajar en estrecha colaboración con sus veterinarios locales y la IACUC para cumplir con los objetivos necesarios.
Este procedimiento tiene ciertas limitaciones. El método descrito aquí fue desarrollado para su uso en ratas jóvenes, y una miríada de diferencias estructurales y de otro tipo entre humanos y ratas pueden limitar la traducción de estos procedimientos a los humanos. El objetivo de permitir la inyección intratecal lumbar de un tratamiento en ratas juveniles es facilitar el uso del modelo de rata juvenil para probar la eficacia del tratamiento terapéutico candidato, incluso si el modo preciso de administración tendría que modificarse para su aplicación en pacientes.

La promesa de las terapias génicas mediadas por virus finalmente se ha hecho realidad en los últimos años con la aprobación de la FDA de tratamientos para la atrofia muscular espinal, la distrofia de retina, la hemofilia del factor IX, el cáncer y más 1,2,3,4. Un sinnúmero de otras terapias están actualmente en desarrollo. La terapia génica tiene como objetivo administrar un gen terapéutico a las células de un paciente. Los productos de este nuevo gen pueden reemplazar la actividad faltante de un gen endógeno deficiente, inhibir un gen tóxico, matar células cancerosas o proporcionar alguna otra función beneficiosa.
En el caso de las enfermedades que afectan al sistema nervioso central (SNC), suele ser deseable administrar el vector de terapia génica directamente al tejido diana. Los enfoques no sistémicos proporcionan dos beneficios: minimizan los efectos secundarios fuera del objetivo que pueden ser causados por la transducción periférica y reducen en gran medida la cantidad de vector necesaria para lograr niveles adecuados de transducción en el tejido objetivo5.
Existe una variedad de enfoques para administrar vectores de terapia génica al SNC. La inyección intraparenquimatosa, la inyección de un vector directamente en la médula espinal o el tejido cerebral, se puede utilizar para la administración a una región definida. Sin embargo, para muchas enfermedades, se desea una transducción amplia del SNC. Esto se puede lograr mediante la entrega de un vector al líquido cefalorraquídeo (LCR)5, el líquido que fluye dentro y alrededor del cerebro y la médula espinal. Hay tres formas principales de entregar vectores al CSF. El enfoque más invasivo es la administración intracerebroventricular, que consiste en perforar un orificio a través del cráneo y hacer avanzar una aguja a través del cerebro hasta los ventrículos laterales. Esto produce la transducción a través del cerebro. Sin embargo, el procedimiento puede causar hemorragia intracraneal, y el abordaje generalmente produce solo una transducción limitada de la médula espinal6. La inyección en la cisterna magna en la base del cráneo es menos invasiva, pero conlleva el riesgo de daño al tronco encefálico. Si bien se usa a menudo en la investigación con animales5, la inyección en la cisterna magna ya no se usa de manera rutinaria en la clínica7. La punción lumbar es el abordaje menos invasivo para acceder al líquido cefalorraquídeo. Consiste en colocar una aguja entre dos vértebras lumbares y dentro de la cisterna lumbar.
La punción lumbar para el parto del vector se realiza de forma rutinaria en ratas y ratones adultos y en ratones neonatos 8,9. Los autores de este estudio realizaron recientemente punciones lumbares en ratas jóvenes (28-30 días de edad) para administrar vectores del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9). En ratas adultas, se colocó una aguja de punción lumbar neonatal verticalmente entre las vértebras L3 y L49. La colocación adecuada da como resultado un movimiento de la cola y el líquido cefalorraquídeo que fluye hacia el depósito de la aguja. Sin embargo, en ratas jóvenes, no se pudo lograr ninguna de estas lecturas. A continuación, los autores intentaron adaptar un procedimiento en ratones adultos utilizando una jeringa de insulina de 27 G insertada en un ángulo entre L5 y L610. En ratones adultos, que suelen ser más pequeños que las ratas P28, esto no produce un movimiento de la cola, pero la colocación incorrecta de la aguja es evidente por el reflujo de la inyección. Sin embargo, en ratas jóvenes, este enfoque condujo uniformemente a que la inyección se administrara por vía epidural, probablemente como resultado de la diferente elasticidad entre ratones adultos y ratas juveniles de las capas de tejido que rodean la médula espinal. A continuación, se evaluaron los abordajes de los catéteres. En concreto, se introdujo un catéter a través de una incisión en la duramadre de la cisterna lumbar y hasta la médula espinal torácica media; Sin embargo, este enfoque condujo a un reflujo sustancial del inyectado fuera del sitio de la incisión durante el parto. Los intentos de colocar el catéter en el espacio intratecal por vía percutánea utilizando una aguja guía tampoco tuvieron éxito. Debido a la estrechez del ancho interlaminar, es probable que el catéter golpee la lámina rostral y no avance.
Aquí, se describe un método para lograr una administración exitosa y reproducible de la solución a través de una punción lumbar en la rata juvenil. Este enfoque se puede utilizar para vectores virales y, probablemente, también para células, productos farmacéuticos y otras terapias.

<table><tbody><tr><td>200 y micro; Puntas de pipeta filtradas</td><td>L MidSci</td><td>PR-200RK-FL</td><td>Virus de pipeteo</td></tr><tr><td>AAV9-GFP</td><td>Vector Builder</td><td>P200624-1005ynr</td><td>AAV9 vector que expresa GFP</td></tr><tr><td>Sutura absorbible con vicryl polyglactin recubierto de aguja 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Tamaño 4 - 0 Trenzado</td><td>McKesson</td><td>J422H</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de banco</td> de sutura <td>VWR</td><td>56616-031</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Almohadillas isotérmicas Braintree Scientific, 8'' x 8''</td> <td>Fisher Scientific</td><td>50-195-4664</td><td>Mantiene la temperatura corporal</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>McKesson</td><td></td><td>1013922 Analgésico</td></tr><tr><td>Buprenorfina-ER (1 mg/mL)</td><td>Zoopharma</td><td></td><td>Analgésico de liberación prolongada</td></tr><tr><td>Hisopos de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-365-409</td><td>Extracción</td></tr> <tr><td>de sangreCortina, Ratón, Plástico Transparente, 12" x 12", con Fenestración Adhesiva</td><td>Steris</td><td>1212CPSTF</td><td>Paño quirúrgico</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Pinza</td></tr><tr><td>Manta eléctrica</td><td>CVS Health CVS Health</td><td></td><td>Series 500 Almohadilla térmica extra larga</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, pipeta de 1 canal, variable, 20&ndash; 200 y micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td>Virus de pipeteo</td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Tijeras quirúrgicas curvas</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td>Laminectomía</td></tr><tr><td>Halsey Portaagujas</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td>Atornillador de aguja</td></tr><tr><td>Jeringas de insulina con aguja ultrafina 12,7 mm x 30 G 3/10 mL/cc</td><td>BD</td><td>328431</td><td>Jeringa</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>McKesson</td><td>803250</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>Toallitas de isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-031-350</td><td>Desinfección de la piel</td></tr><tr><td>Lidocaína, 1%</td><td>McKesson</td><td>239935</td><td>Anestesia local</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-137</td><td>Carga de la jeringa</td></tr><tr><td>Povidona yodada</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-118-0481</td><td>Desinfección de la piel</td></tr><tr><td>Mango de bisturí - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td>Portacuchillas de bisturí</td></tr><tr><td>Cámara de inducción Sure-Seal</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-17</td><td>Caja de anestesia</td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica Miltex Acero al carbono n.º 11 Estéril Desechable Envuelto individualmente</td><td>McKesson</td><td>4-111</td><td>#11 Hoja de bisturí</td></tr><tr><td>SYSTANE NIGHTTIME Ungüento para los ojos Alcon</td><td></td><td></td><td>Ungüento para los ojos</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td>Inyección</td></tr></tbody></table>

administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

La terapia génica es una poderosa tecnología para entregar nuevos genes a un paciente para el tratamiento de una enfermedad, ya sea para introducir un gen funcional, inactivar un gen tóxico o proporcionar un gen cuyo producto pueda modular la biología de la enfermedad. El método de administración del vector terapéutico puede adoptar muchas formas, desde la infusión intravenosa para la administración sistémica hasta la inyección directa en el tejido diana. En el caso de los trastornos neurodegenerativos, a menudo es deseable sesgar la transducción hacia el cerebro y/o la médula espinal. El enfoque menos invasivo para dirigirse a todo el sistema nervioso central implica la inyección en el líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que permite que la terapia llegue a una gran fracción del sistema nervioso central. El método más seguro para inyectar un vector en el líquido cefalorraquídeo es la inyección intratecal lumbar, en la que se introduce una aguja en la cisterna lumbar de la médula espinal. Esta técnica, también conocida como punción lumbar, ha sido ampliamente utilizada en roedores neonatos y adultos y en modelos animales grandes. Si bien la técnica es similar en todas las especies y etapas de desarrollo, las diferencias sutiles en el tamaño, la estructura y la elasticidad de los tejidos que rodean el espacio intratecal requieren adaptaciones en el enfoque. En este artículo se describe un método para realizar la punción lumbar en ratas juveniles para administrar un vector adenoasociado al serotipo 9. Aquí, se inyectaron 25-35 μL de vector en la cisterna lumbar y se utilizó un reportero de proteína fluorescente verde (GFP) para evaluar el perfil de transducción resultante de cada inyección. Se discuten los beneficios y desafíos de este enfoque.

Para determinar la precisión de la técnica de inyección, se utilizó un tinte, el azul de tripano, como sustituto de la terapéutica. Este tinte se une fácilmente a las proteínas, por lo que generalmente permanece dentro de la estructura en la que se inyectó. Esto significa que es posible que el tinte no prediga con precisión la distribución posterior a la inyección del tratamiento; Simplemente se utiliza para revelar la precisión de la inyección. Cuando se introduce con éxito en la cisterna lumbar, el azul de tripán se une a la duramadre, tiñendo de azul el perímetro de la médula espinal. Sin embargo, cuando la aguja no logra penetrar en la duramadre, el tinte termina en el espacio epidural. Tanto la duramadre como los tejidos circundantes (la superficie del hueso y los ligamentos y músculos que conectan las láminas) se teñirán de azul. Estos patrones son fácilmente visibles a simple vista.
La diferencia entre la inyección administrada correctamente y la incorrectamente es difícil de evaluar si simplemente se hace un corte transversal a través de la médula espinal y la columna vertebral. En su lugar, se recomienda realizar una laminectomía con un par de rongeurs que comiencen en la lámina L5 y se muevan rostralmente. Se debe tener cuidado de no dañar la duramadre en el proceso. El uso del microscopio de disección facilita este proceso. La Figura 1 proporciona ejemplos comparativos de inyecciones exitosas e inyecciones solo parcialmente exitosas. Con una inyección exitosa, se observa poco o ningún reflujo a lo largo de la pista de la aguja cuando se retira la aguja. Después de una inyección exitosa, la extracción de la lámina para exponer la médula espinal revela azul tripano dentro de la médula espinal, pero no en la superficie del hueso (Figura 1A). El tinte también es visible en el tronco encefálico y el cerebelo después de una inyección exitosa (Figura 1B). Por el contrario, una inyección parcialmente exitosa se evidencia por un reflujo significativo de tinte hacia el tracto de la aguja durante el proceso de inyección y/o evidencia visible de tinte en el hueso (Figura 1C).
Utilizando el procedimiento anterior, se inyectaron 28 μL de un vector AAV9 que expresaba proteína fluorescente verde mejorada (GFP) a una concentración de 3 x10 13 genomas de vectores/mL, para una dosis total de 8,4 x 1011 genomas de vectores/animal. Cuatro semanas después, los animales fueron sacrificados y perfundidos con paraformaldehído10 al 4%. A continuación, se extrajeron el cerebro y la médula espinal y se prepararon para la sección congelada. Se obtuvieron secciones de 40 μm de espesor y se tiñeron para GFP. La Figura 2 proporciona ejemplos del patrón de transducción obtenido con este vector. La transducción fue generalmente más alta en la médula espinal, particularmente en la región lumbar (Figura 2A-C), probablemente debido a su proximidad al lugar de la inyección. La transducción del cerebro se logró (Figura 2D-F), pero, como era de esperar, tendió a ser más limitada que lo que se observó en la médula espinal.
Para ilustrar la reproducibilidad de los resultados logrados por un solo cirujano experimentado utilizando un solo lote de virus, se presentan secciones teñidas del cerebelo y la corteza de cada una de las 15 ratas inyectadas para este estudio en la Figura 3 y la Figura 4, respectivamente. También se presentan las secciones teñidas de la médula espinal cervical de 7 de estas 15 ratas (Figura 5). Por supuesto, la cantidad de transducción cerebral puede mostrar una variabilidad aún mayor con diferentes dosis, lotes de vectores y cirujanos10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig01.jpg"> Figura 1: Exposición de la médula espinal después de una inyección del tinte. Las laminectomías se realizaron después de la inyección de azul de tripán. (A) La médula espinal se tiñe de azul en una inyección administrada correctamente, y no se observa tinte en el hueso extraído durante la laminectomía (flechas). (B) El tinte también se puede observar alrededor del tronco encefálico. (C) En una inyección en la que hubo un reflujo significativo durante la inyección, hay menos tinte dentro del cordón y el tinte está presente en la superficie del hueso (flechas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplos de patrones de transducción logrados después de la administración intratecal de AAV9-GFP. Secciones de 40 μm de espesor de la médula espinal (A) cervical, (B) torácica y (C) lumbar se tiñeron inmunohistoquímicamente para GFP (tinción negra). Se observaron altos niveles de transducción de materia gris en todos los niveles. (D) En contraste, el cerebro exhibe una transducción general más escasa. Los cuadros izquierdo y derecho se amplían en (E) y (F), respectivamente. (E) La mayoría de las tinciones se observan en el cerebelo, principalmente en las neuronas de Purkinje (flechas). (F) Las neuronas (flechas) y los astrocitos (puntas de flecha) se transducen dentro de la corteza cerebral. Barras de escala: (A-C) 325 μm; D) 5 mm; y (E,F) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig03v2.jpg"> Figura 3: Reproducibilidad de la transducción en el cerebelo. Reproducibilidad de la transducción en el cerebelo de 15 ratas inyectadas por el mismo cirujano utilizando la misma dosis y cantidad de virus. Barra de escala: 1 mm. Los números de las imágenes indican los números de identificación de las ratas ('camada'). individual'). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig03largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig04.jpg"> Figura 4: Reproducibilidad de la transducción en la corteza. Reproducibilidad de la transducción en la corteza de 15 ratas inyectadas por el mismo cirujano utilizando la misma dosis y cantidad de virus. Barra de escala: 500 μm. Los números de las imágenes indican los números de identificación de las ratas ('camada'). individual'). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig05.jpg"> Figura 5: Reproducibilidad de la transducción en la médula espinal cervical. Reproducibilidad de la transducción en la médula espinal cervical de 7 ratas inyectadas por el mismo cirujano utilizando la misma dosis y cantidad de virus. Barra de escala: 500 μm. Los números de las imágenes indican los números de identificación de las ratas ('camada'). individual'). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se describe un procedimiento quirúrgico para realizar inyecciones en la cisterna lumbar de la rata juvenil. Este enfoque se ha utilizado para la administración intratecal de vectores de terapia génica, pero se prevé que este enfoque se pueda utilizar para una variedad de terapias, incluidas las células y los fármacos.

Administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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