Name: Estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a establecer organoides de cáncer de ovario a partir de diferentes estadios de la enfermedad, abordando la variabilidad entre pacientes. Este protocolo facilita la expansión a largo plazo y el descubrimiento de biomarcadores predictivos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El estudio está financiado por el Centro Alemán de Investigación del Cáncer DKTK, sede asociada de Múnich, una asociación entre DKFZ y el Hospital Universitario LMU de Múnich. El estudio también cuenta con el apoyo de la beca German Cancer Aid (#70113426 y #70113433). La inclusión en parafina de tejidos y organoides se ha realizado en las instalaciones centrales del Instituto de Anatomía de la Facultad de Medicina de la LMU de Múnich. La obtención de imágenes confocales se ha realizado en la instalación principal de bioimagen en el Centro Biomédico (BMC). Los autores quieren agradecer a Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink y Martina Rahmeh por su ayuda técnica.

Estandarización del biobanco de organoides para el cáncer de ovario

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).</li>
<li>Berger, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+pan-cancer+molecular+study+of+gynecologic+and+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers.</a> Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).</li>
<li>Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biobanks%3A+addressing+the+practical+and+ethical+issues+to+deliver+a+valuable+tool+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).</li>
<li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanking+in+health+care%3A+evolution+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Biobanking in health care: evolution and future directions.</a> J Transl Med. 17 (1), 172(2019).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Larsen, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-cancer+organoid+platform+for+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A pan-cancer organoid platform for precision medicine.</a> Cell Rep. 36 (4), 109429(2021).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+drug+screening+of+patient-derived+tumor+organoids+using+high-content+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101407(2022).</li>
<li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+efficient+establishment+and+drug-response+profiling+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids.</a> Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).</li>
<li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Next-generation cancer organoids.</a> Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expansion+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids+requires+a+low-Wnt+environment%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment.</a> EMBO J. 39 (6), e104013(2020).</li>
<li>Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+and+Wnt+pathways+regulate+stemness+and+differentiation+in+human+fallopian+tube+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids.</a> Nat Commun. 6, 8989(2015).</li>
<li>Trillsch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+optimize+the+biobanking+of+ovarian+cancer+organoids+by+accommodating+patient-specific+differences+in+stemness+potential%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102484(2023).</li>
<li>Maenhoudt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+organoids+from+ovarian+cancer+as+experimental+and+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models.</a> Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).</li>
<li>Fuerer, C., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+to+probe+and+manipulate+the+Wnt+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway.</a> PLoS One. 5 (2), e9370(2010).</li>
<li>Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf">https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf</a> (2021).</li>
<li>Thermo Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microm+EC350+Modular+tissue+embedding+center+Instruction+manual%22">Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual</a>. , (2009).</li>
<li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Sci Rep. 10 (1), 12581(2020).</li>
</ol>

M.K. figura como inventor en una patente relacionada con un medio para organoides de cáncer de ovario. F.T. recibió fondos de investigación, consejo asesor, honorarios y gastos de viaje de AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics y Tesaro/GSK. S.M. recibió fondos de investigación, consejo asesor, honorarios o gastos de viaje: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

El protocolo diseñado aborda los desafíos previos del biobanco de organoides de cáncer de ovario con respecto a la formación de organoides y el potencial de paso a largo plazo y garantiza la generación de líneas completamente expandibles a partir de la mayoría de los depósitos de tumores sólidos. El proceso de recolección quirúrgica de muestras tumorales que se utilizarán para la generación de organoides tiene un impacto significativo en el rendimiento y el potencial de expansión. Las muestras de tejido tumoral se pueden obtener durante varios procedimientos, incluida la cirugía multivisceral, la laparoscopia diagnóstica o la biopsia. El cirujano gineco-oncológico experimentado debe priorizar la obtención de muestras tumorales limpias de localizaciones peritoneales. En particular, se ha observado que las áreas macroscópicamente necróticas dentro de grandes depósitos tumorales son menos adecuadas para la generación exitosa de cultivos de organoides. Dado que la pureza de la muestra es crucial para reflejar las características moleculares y fenotípicas para las aplicaciones posteriores, se requieren esfuerzos sincronizados de los equipos clínicos y de laboratorio para un biobanco óptimo, asegurando que las líneas se creen a partir de las regiones más relevantes del tumor.
Si bien este protocolo cubre las variaciones en las dependencias de los factores de crecimiento que hemos observado durante 2 años de biobancos, está claro que se justifica un refinamiento adicional para aumentar aún más la eficacia, ya que todavía no observamos ningún crecimiento de organoides en el 20% de los casos y el número de líneas que demostraron un potencial de expansión limitado sugirió un mantenimiento subóptimo del tallo. Aunque nuestro biobanco de organoides actualmente incluye solo muestras de cáncer de ovario de histología serosa (HGSOC y LGSOC), nuestra experiencia con muestras de diferentes histologías epiteliales de cáncer de ovario antes del programa de biobanco estructurado mostró tasas de éxito comparables sin diferencias específicas. En particular, la mayoría de los subtipos epiteliales de cáncer de ovario comparten una morfología pseudoestratificada cilíndrica similar con tejidos que se desarrollaron a partir del tracto mülleriano (trompa de Falopio, útero, cuello uterino), mientras que, por el contrario, el epitelio ovárico en sí se origina en el desarrollo de la cresta genital y el mesonefros, estando cubierto por una sola capa de epitelio cuboidal. Dado que las vías de desarrollo que regulan la homeostasis epitelial tienen un papel central en el control del potencial de las células madre adultas, las diferencias en el origen embrionario deben tenerse en cuenta al desarrollar protocolos para el biobanco de organoides. Por lo tanto, creemos que los progenitores de la superficie del ovario probablemente requieren condiciones de cultivo específicas del órgano para mantener un crecimiento estable a largo plazo.
Cabe destacar que, en nuestro laboratorio, el protocolo ha demostrado ser exitoso también para muestras de cáncer de ovario post-neoadyuvante, aunque la quimioterapia neoadyuvante afecta la viabilidad celular y el fenotipo tisular. Estas muestras exhiben más restos y agregados de tejido extracelular en comparación con las muestras derivadas de tejido previo a quimioterapia de cirugías citorreductoras primarias, lo que podría afectar el potencial de formación de organoides. En estos casos, experimentamos que una cantidad adecuada de tejido quirúrgico y el cumplimiento estricto de las condiciones de transporte recomendadas son cruciales para el éxito de la generación de organoides, ya que las muestras post-neoadyuvantes pueden ser más sensibles.
Un fenómeno muy interesante del efecto beneficioso de la breve expansión sobre el plástico en 2D de progenitores recién aislados sobre el crecimiento posterior de organoides, que hemos observado repetidamente y, por lo tanto, incluido en el procedimiento experimental estandarizado, es una adición importante a la metodología del campo de investigación de organoides cancerosos, que se basa en gran medida en estrategias de siembra directa. Es tentador especular que la sensibilidad de los progenitores después de la digestión enzimática y la capacidad de los factores de crecimiento para prepararlos adecuadamente podrían ser los mecanismos subyacentes detrás de esta diferencia, que en algunos casos es un factor decisivo si se puede establecer la línea. Sin embargo, se necesita más investigación para establecer dependencias claras.
Para hacer frente a los desafíos planteados por la alta adhesión celular y las uniones funcionales en los organoides de cáncer de ovario 3D, que son difíciles de digerir, una combinación de disociación mecánica y enzimática con aguja y jeringa puede ayudar cuando quedan grandes grumos después de la tripsinización. La experimentación con diferentes condiciones enzimáticas podría conducir a nuevas mejoras.
Después del almacenamiento a largo plazo, las líneas de organoides pueden descongelarse y cultivarse de acuerdo con el diseño experimental y utilizarse para aplicaciones posteriores. Esto permite acceder en cualquier momento a líneas de organoides ya generadas con fines de investigación específicos y es particularmente interesante para investigar el comportamiento a largo plazo de ciertas líneas a la luz de la progresión de la enfermedad del paciente. Sin embargo, la criopreservación de organoides de cáncer de ovario sigue siendo un desafío. Las variaciones de temperatura durante los ciclos de congelación y descongelación pueden afectar negativamente la viabilidad, la funcionalidad y el potencial de expansión de los organoides. El almacenamiento a largo plazo es más estable en nitrógeno líquido, donde las temperaturas muy bajas minimizan el riesgo de degradación para que se pueda mantener la integridad de los organoides. Sin embargo, se justifica la optimización continua para establecer procedimientos consistentes para congelar, almacenar y descongelar, para mejorar aún más estos procesos.
A pesar de los problemas pendientes mencionados, este protocolo demuestra la capacidad de generar consistentemente líneas organoides estables a partir de muestras de tumores sólidos de pacientes con cáncer de ovario. En nuestro laboratorio, procesamos hasta la fecha 120 muestras de tejido de cáncer primario de ovario logrando el éxito en aproximadamente el 50% de los casos, incluyendo una amplia gama de subtipos histológicos y estadios de la enfermedad con citorreducción primaria, enfermedad recurrente y muestras quirúrgicas posneoadyuvantes. Al proporcionar un marco estructurado para la generación de organoides derivados de varias muestras de pacientes, la siembra paralela en diferentes medios y la implementación de diferentes estrategias de siembra, este protocolo brinda la oportunidad de evaluar las diferencias individuales en el potencial de tallo, proporcionando así información adicional sobre la biología tumoral. Hasta donde sabemos, la gran mayoría de los estudios suelen seguir el enfoque inverso de probar los componentes del medio en un pequeño número de muestras y elegir por simplicidad un medio óptimo. Nuestras pruebas sistemáticas del efecto de HER1ß, el efecto de la suplementación con RSPO1 y FGF10 y la siembra 2D/3D demuestran de manera concluyente que el tejido de cáncer de ovario tiene un grado de variabilidad entre pacientes en las propiedades de la madre, y el medio óptimo es, de hecho, específico para el paciente. Por lo tanto, es esencial realizar pruebas paralelas sistemáticas de diferentes composiciones de medios que proporcionen diferentes entornos de señalización paracrina exógena.
El establecimiento de un biobanco viviente con un amplio panel de organoides derivados de varias pacientes con cáncer de ovario, junto con su información clínica recopilada prospectivamente, sirve como un recurso valioso para una amplia gama de aplicaciones de investigación y refleja el panorama clínico heterogéneo que es potencialmente aplicable a una población de pacientes más grande17. El cultivo y la criopreservación a largo plazo permiten la consistencia experimental y la accesibilidad repetida de la misma línea de organoides a lo largo del tiempo, sirviendo como base para diseños experimentales longitudinales con propiedades celulares inalteradas de la línea tumoral.
Al conservar la arquitectura epitelial y la polarización, las líneas organoides son un modelo adecuado para estudiar la comunicación célula-célula y la toma de decisiones sobre el destino celular dependiente del contexto mediada por vías de señalización paracrinas. La inclusión de los organoides en el gel histológico es un paso intermedio práctico y eficiente para evitar la pérdida de material después de la fijación y garantiza que el procesamiento posterior (inclusión en parafina y corte) se pueda realizar en paralelo con las muestras de tejido. La pérdida de organoides durante el procedimiento de fijación es un problema crítico cuando el número de organoides es muy limitado. Sin embargo, esta pérdida puede contrarrestarse eliminando completamente los organoides de la matriz extracelular mediante el lavado en un medio de cultivo basal frío y agrupando al menos dos pocillos completamente desarrollados de una placa de formato de 24 pocillos antes de la fijación. El protocolo de tinción por inmunofluorescencia permite que las imágenes confocales de alta resolución correspondan las características moleculares y fenotípicas de los organoides del cáncer de ovario con el tejido tumoral parental, pero también es una herramienta valiosa para estudiar la respuesta celular a compuestos químicos o la caracterización de líneas modificadas genéticamente. El método también es adecuado para la tinción histológica sin ninguna modificación específica. Dependiendo del propósito del estudio, se deben considerar secciones más delgadas cortadas con un micrótomo (2-3 μm).
Es importante destacar que el cultivo estable a largo plazo es un requisito previo para los experimentos de edición genética y los ensayos funcionales sobre la respuesta a los fármacos y la resistencia a las terapias nuevas y estándar17,21. En particular, los organoides generados a partir de las rebiopsias que se realizan durante la progresión y la recurrencia de la enfermedad ofrecen la posibilidad de realizar análisis comparativos directos entre el tumor original sin tratamiento previo y las características recién adquiridas observadas durante la recaída. La identificación de las respuestas al tratamiento específicas de cada paciente y la formación de resistencia a la terapia in vitro hacen avanzar el campo de la medicina de precisión en la investigación del cáncer de ovario21.

El manejo clínico de las pacientes con cáncer epitelial de ovario sigue siendo un reto debido a su presentación clínica heterogénea en estadios avanzados y a las altas tasas de recurrencia1. Mejorar nuestra comprensión del desarrollo del cáncer de ovario y el comportamiento biológico requiere enfoques de investigación que aborden la variabilidad específica de la paciente durante el curso de la enfermedad, la respuesta al tratamientoy las características histopatológicas y moleculares.
El biobanco, caracterizado por la recolección sistemática y la preservación a largo plazo de muestras tumorales derivadas de pacientes con cáncer de ovario junto con su información clínica, ofrece la preservación de una gran cohorte de pacientes en diferentes etapas de la enfermedad, incluidas muestras tumorales de cirugías citorreductoras primarias, después de quimioterapia neoadyuvante y de enfermedad recurrente. Tiene un valioso potencial para avanzar en la investigación del cáncer, sirviendo como un recurso de biomarcadores pronósticos prometedores y dianas terapéuticas3. Sin embargo, los métodos convencionales de biobancos, como la fijación y congelación de formol, no son susceptibles de realizar estudios funcionales en las muestras tumorales originales debido a la pérdida de viabilidad y a la alteración de la arquitectura tridimensional del tejido nativo 4,5.
Los estudios de los mecanismos moleculares, en oncología y fuera de ella, dependen fundamentalmente del uso de modelos experimentales apropiados que reflejen fielmente la biología de la enfermedad y mantengan las propiedades in vitro del tejido observado in vivo. Los organoides derivados del paciente, basados en la preservación del potencial de renovación, reproducen en el laboratorio la estructura y función originales del epitelio y permiten realizar pruebas en un contexto específico del paciente. Por lo tanto, se han convertido en herramientas muy prometedoras para la investigación del cáncer y la medicina personalizada, cerrando la brecha entre la diversidad clínica y la investigación de laboratorio 6,7,8,9. Las estrategias terapéuticas personalizadas, basadas en las respuestas farmacológicas individuales de las líneas de organoides y en las pruebas de la relevancia funcional de los perfiles moleculares, pueden aplicarse directamente a la atención del paciente10,11. La posibilidad de cultivo a largo plazo, incluyendo las características específicas del paciente y la recopilación de datos clínicos prospectivos relevantes a lo largo del tiempo, es muy prometedora para identificar nuevos factores pronósticos y predictivos implicados en la progresión de la enfermedad y los mecanismos de resistencia 3,9.
Sin embargo, la construcción de un biobanco que incluya organoides de diferentes muestras tumorales requiere una combinación de cumplimiento estricto de una metodología compleja y el establecimiento de protocolos para facilitar su mantenimiento12. La estandarización de los procesos garantiza que el biobanco pueda ser establecido y mantenido de manera eficiente por personal capacitado, incluso con una alta rotación, al mismo tiempo que se adhiere a los más altos estándares de calidad13. Varios estudios informaron la generación exitosa de líneas organoides estables de cáncer de ovario correspondientes al perfil mutacional y fenotípico del tumor original con tasas de eficiencia variables. Aun así, los biobancos rutinarios siguen siendo un reto en la práctica, especialmente para el crecimiento estable a largo plazo de las líneas, que es un requisito previo para la expansión a gran escala o el éxito de la edición genómica.
En particular, la cuestión de la capacidad de expansión sigue estando vagamente definida en el campo, ya que los organoides que muestran un potencial de crecimiento lento y limitado se cuentan ocasionalmente como líneas establecidas. Como demostraron inicialmente Hoffmann et al., un estudio cuyos principales hallazgos proporcionaron la base para este protocolo más desarrollado, el manejo óptimo del tejido de cáncer de ovario requiere una estrategia única para acomodar la heterogeneidad14. La caracterización fenotípica de los organoides obtenidos por este método y la estrecha similitud con el tejido tumoral parental se confirmaron mediante secuenciación de ADN de panel y análisis transcriptómico de cultivos maduros (4-10 meses de cultivo), demostrando la estabilidad del modelo 8,9,12,14.
En contraste con el ambiente paracrino que regula la homeostasis en las trompas de Falopio sanas, la capa epitelial, que probablemente produce cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC), el potencial de regeneración del cáncer y la capacidad de formación de organoides, depende menos de la suplementación exógena con Wnt. Además, la señalización activa de la Proteína Morfogenética Ósea (BMP), caracterizada por la ausencia de Noggin en medio organoide, demostró ser beneficiosa para el establecimiento de cultivos a largo plazo a partir de depósitos de tejido sólido de cáncer de ovario14,15. Durante el biobanco sistemático de depósitos sólidos de cáncer de ovario, hemos confirmado estos hallazgos y hemos establecido la canalización, con detalles descritos en este protocolo que garantiza una expansión sostenida a largo plazo en la mayoría de los casos. Encontramos que las pruebas paralelas de diferentes composiciones de medios y modalidades de siembra cuando se trabaja con aislados primarios son esenciales para mejorar el establecimiento de líneas de organoides estables a largo plazo y para aumentar los rendimientos, lo que permite una propagación robusta y la expansión a formatos de pocillos múltiples requeridos para experimentos posteriores16.
Además, la pureza y la calidad de las muestras recogidas durante la cirugía son de crucial importancia para el potencial traslacional de los organoides del cáncer de ovario en la investigación básica y el diagnóstico molecular. La complejidad de la presentación clínica del HGSOC requiere una estrecha cooperación entre los cirujanos, oncólogos y los científicos del laboratorio para garantizar que el material relevante se identifique correctamente, que las condiciones de transporte se mantengan constantes y que se generen líneas de organoides con alta eficiencia que representen las características más importantes de la enfermedad de cada paciente. Este protocolo proporciona un marco estandarizado pero adaptable para capturar todo el potencial de los organoides del cáncer de ovario, considerando la heterogeneidad que caracteriza al cáncer de ovario16,17. En particular, este protocolo permite un biobanco confiable del amplio espectro de presentación clínica del cáncer de ovario, incluidos diferentes tipos histológicos (cáncer de ovario de alto y bajo grado, LGSOC), diferentes depósitos de las mismas pacientes que presentan diferencias en la regulación de la madre, tejidos de cirugías en un entorno posneoadyuvante, material de biopsia y muestras de cirugías en la fase recurrente de la progresión de la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>100 Sterican 26 G</td><td>Braun, Melsungen, Alemania</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>100 Sterican 27 G</td><td>Braun, Melsungen, Alemania</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>293T HA Rspo1-Fc</td><td>R& D systems, Minneapolis, EE. UU.</td><td>3710-001-01</td><td>Alternativa: Línea celular que expresa R-Spondin1, Sigma-Aldrich, SC111</td></tr><tr><td>A-83-01 (TGF-b inhibidor de la quinasa RI IV)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>616454</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 Medium&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-p53 (DO1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Texas, EE. UU.</td><td>Anticuerpo sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX8</td><td>Proteintech, Manchester, Reino Unido&nbsp;</td><td>10336-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de vacío con tapa de botella 0.2 &micro; m</td><td>Corning, Berlín, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>430049</tr><tr><td>matraz de cultivo celular CELLSTAR, 175 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Austria</td><td>661175</td><td></td></tr><tr><td>matraz de cultivo celular CELLSTAR, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Austria</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular CELLSTAR, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Austria</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa I</td><td>Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well Clear TC-treated&nbsp;</td><td>Corning, Berlín, Alemania &nbsp;</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SFM</td><td>PromoCell &ndash; Ciencia Centrada en el Ser Humano, Heidelberg, Alemania</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Extracto de Membrana Basal con Factor de Crecimiento Reducido, Tipo 2, Pathclear</td><td>R& D systems, Minneapolis, EE. UU</td>. <td>3533-005-02</td><td>Alternativa: Matrigel, matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento&nbsp; Corning, 356231&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAKO&nbsp; Tampón de citrato, pH 6.0, 10x Recuperador de antígenos</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti conejo Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, EE. UU</td>. <td>A32814</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&agudo; s Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel</td><td>Thermo Scientific, Waltham, EE. UU</td>. <td>Epredia HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Poliestireno de 24 pocillos&nbsp;</td><td>Corning, Berlín, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>351447</tr><tr><td>Bisturí de plumas&nbsp;</td><td>Pfm medical, Colonia, Alemania</td><td>200130010</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Formalina 37% libre de ácido, estabilizado</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Alemania</td><td>1019205000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td></td><td></td>156630080</tr><tr><td>Anticuerpo humano EpCAM/TROP-1</td><td>R& D systems, Minneapolis, EE. UU.</td><td>AF960</td><td></td></tr><tr><td>FGF10 humano</td><td>Peprotech, NJ, EE. UU.</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>BMP2 recombinante humano</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>PHC7146</td><td></td></tr><tr><td>EGF recombinante humano</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>Heregulina beta-1 recombinante humana</td><td>Peprotech, NJ, EE. UU</td><td>. 100-03</td><td></td></tr><tr><td>Software central LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/</td></tr> <tr><td>Leica TCS SP8 X&nbsp; Microscopio confocal láser de luz blanca</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Melsungen, Alemania</td><td>3570519</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm de parafina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omnilab, Múnich, Alemania</td><td>5170002</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Alemania</td><td>1176201000</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>P4333-100</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 400 &micro; m</td><td>PluriSelect, Leipzig, Alemania</td><td>43-50400-01</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Toulouse, Francia</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisado de glóbulos rojos</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Roticlear</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>A538.5</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cryoviales</td><td>Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>375418PK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tinción azul de tripán</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>PanReac AppliChem, Darmstadt, Alemania</td><td>A4974-0100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Alemania</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU</td>. <td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Si bien el establecimiento de un biobanco de cáncer de ovario a partir de organoides derivados de pacientes junto con su información de antecedentes clínicos promete avances en la investigación y la atención al paciente, la estandarización sigue siendo un desafío debido a la heterogeneidad de esta neoplasia maligna letal, combinada con la complejidad inherente de la tecnología de organoides. Este protocolo adaptable proporciona un marco sistemático para aprovechar todo el potencial de los organoides del cáncer de ovario teniendo en cuenta la variabilidad de los progenitores específica de cada paciente. Mediante la implementación de un flujo de trabajo experimental estructurado para seleccionar las condiciones óptimas de cultivo y los métodos de siembra, con pruebas paralelas de siembra directa en 3D frente a una ruta 2D/3D, obtenemos, en la mayoría de los casos, líneas de expansión robustas a largo plazo adecuadas para una amplia gama de aplicaciones posteriores. 
En particular, el protocolo ha sido probado y ha demostrado su eficacia en un gran número de casos (N = 120) de material de partida muy heterogéneo, incluido el cáncer de ovario de alto y bajo grado y los estadios de la enfermedad con citorreducción primaria, enfermedad recurrente y muestras quirúrgicas posneoadyuvantes. Dentro de un entorno de señalización exógena de bajo Wnt y alto BMP, observamos que los progenitores son susceptibles de manera diferente a la activación de la vía de la heregulina 1 ß (HERß-1), con HERß-1 promoviendo la formación de organoides en algunos mientras que la inhibe en otros. Para un subconjunto de las muestras del paciente, la formación óptima de organoides y el crecimiento a largo plazo requieren la adición del factor de crecimiento de fibroblastos 10 y R-Espondina 1 al medio. 
Además, destacamos los pasos críticos de la digestión de los tejidos y el aislamiento de los progenitores y señalamos ejemplos en los que el cultivo breve en 2D sobre plástico es beneficioso para la posterior formación de organoides en la matriz del extracto de membrana basal tipo 2. En general, un biobanco óptimo requiere pruebas sistemáticas de todas las condiciones principales en paralelo para identificar un entorno de crecimiento adecuado para las líneas individuales. El protocolo también describe el procedimiento de manipulación para la inclusión, el corte y la tinción eficientes para obtener imágenes de alta resolución de los organoides, que se requiere para un fenotipado completo.

Después de la disociación, filtración y recuento inicial de tejidos, las células se siembran en paralelo directamente en formato 3D, como se explicó anteriormente, así como la suspensión en el matraz para una breve expansión 2D. En algunos casos, la expansión transitoria 2D influye positivamente en la formación de organoides, y la línea a largo plazo se establece con éxito a través de esta ruta, mientras que la siembra 3D paralela comparativa puede resultar en la detención del crecimiento (Figura 1). Para cada tejido donante que se procesa, las células se analizan de acuerdo con la matriz de medios. Siguiendo esta estrategia, nuestro biobanco ahora contiene líneas representativas de cada condición de crecimiento estándar como se muestra en la Figura 2. Mediante la implementación estricta de esta mini plataforma de cribado de pruebas de diferentes medios y modos de siembra, hemos generado con éxito líneas de organoides de diferentes tipos histológicos y estadios de desarrollo de la enfermedad de cáncer de ovario (Figura 3) de cirugías serosas primarias de alto grado, cirugías de intervalo posneoadyuvantes y de enfermedad recurrente. La caracterización fenotípica de las líneas organoides mediante tinción por inmunofluorescencia de los marcadores principales en comparación con el tejido parental demuestra de manera convincente que las características distintivas del compartimento tumoral epitelial se conservan en el modelo organoide: arquitectura epitelial y adhesión marcadas por (EpCAM), identidad de linaje (PAX8) y mutación puntual típica de TP53 característica de HGSOC que conduce a la acumulación en el núcleo (Figura 4).
También se deben considerar algunos puntos metodológicos importantes para una toma de decisiones eficiente durante el biobanco de organoides. El potencial de crecimiento de los organoides no solo está determinado por el aumento del diámetro del organoide. Además, las características fenotípicas determinan potenciales de expansión como el color, la oscuridad y la integridad del contorno. La formación de vacuolas de estrés citoplasmáticas indica condiciones subóptimas. Los problemas iniciales con respecto al crecimiento y el potencial de formación de organoides pueden ocurrir debido a condiciones de transporte inadecuadas y retraso en la procesión del tejido. Como se observa una alta variabilidad interindividual en el potencial de expansión dentro de las líneas tumorales, recomendamos esperar al menos 14 días antes de tomar una decisión final sobre el potencial de crecimiento. Si inicialmente se observan patrones de crecimiento similares en diferentes medios, se deben expandir múltiples condiciones. Según nuestra experiencia, una distinción clara del potencial de crecimiento estable a largo plazo a menudo solo es posible después de un cultivo de varias semanas o meses.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig01.jpg"> Figura 1: Beneficios de la siembra breve en 2D de aislados primarios para la posterior generación de organoides. (A) Esquema del diseño experimental que muestra la estrategia de siembra paralela de dos vías: 2D/3D y siembra directa en 3D en cuatro medios diferentes. (B) Imagen de aislados primarios adherentes antes de la tripsinización y la transferencia 3D. (C) Un ejemplo del depósito primario donde la siembra paralela reveló la clara ventaja de la ruta 2D/3D, ya que la expansión de organoides a largo plazo solo fue posible a partir de progenitores que inicialmente se aislaron en plástico. La imagen superior izquierda muestra un cultivo 3D 7 días después del aislamiento en el pasaje 0 (denominado P0) con formación insuficiente de organoides después del primer paso (denominado P1) en la imagen inferior izquierda. Después de la siembra 2D en plástico (ver Figura 1B) seguida de la transferencia a un cultivo 3D, ya se observa una mejor formación de organoides en P0, mientras que el potencial de expansión a largo plazo se confirma en el pasaje 4 (P4). Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig02.jpg"> Figura 2: Requerimiento de medio específico para cada paciente. Ejemplos de cuatro líneas expandidas estables a largo plazo diferentes, cada una creciendo en un medio diferente. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: OCM = medio para cáncer de ovario; her = heregulina 1β; HGSO = cáncer de ovario seroso de alto grado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig03.jpg"> Figura 3: Generación de organoides en todas las etapas de la enfermedad. Imágenes de líneas expansivas estables a largo plazo, de cáncer de ovario seroso de grado alto y de cáncer de ovario seroso de grado bajo en la presentación primaria de la enfermedad, de cirugía de intervalo (quimioterapia posneoadyuvante) y de tejido canceroso recidivante. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: HGSOC = cáncer de ovario seroso de alto grado; LGSOC = cáncer de ovario seroso de bajo grado; NACT = quimioterapia neoadyuvante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig04.jpg"> Figura 4: Coincidencia cercana del fenotipo de los organoides y el tejido canceroso parental. Las imágenes confocales de la tinción por inmunofluorescencia de (A) tejido canceroso y (B) línea de organoides pareados muestran una similitud muy alta en el patrón de tinción y el nivel de expresión de todos los marcadores, EpCAM (verde), PAX8 (rojo), TP53 (magenta). Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Composición de los medios y la mezcla de digestión utilizados en este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467_Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Este protocolo ofrece un marco sistemático para el establecimiento de organoides de cáncer de ovario de diferentes estadios de la enfermedad y aborda los desafíos de la variabilidad específica del paciente para aumentar el rendimiento y permitir una expansión robusta a largo plazo para aplicaciones posteriores. Incluye pasos detallados para el procesamiento de tejidos, la siembra, el ajuste de los requisitos de medios y la tinción de inmunofluorescencia.

Estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...

El mejor manejo clínico en investigación traslacional de vanguardia para pacientes con cáncer de ovario avanzado tiene la máxima prioridad en nuestra institución. Con el biobanco de organoides derivados de pacientes, hemos logrado un gran progreso hacia una gestión individualizada. Esto nos permite evaluar las características específicas de los pacientes e identificar biomarcadores predictivos.Hemos logrado avances significativos en los últimos años en la mejora de la cirugía multivisceral radical, la quimioterapia, la terapia antiangiogénica y también la terapia con inhibidores de PARP en pacientes con cáncer de ovario avanzado y hemos mejorado las tasas de supervivencia incluso con eso. Ahora, el siguiente gran paso sería predecir mejor qué paciente se beneficiaría de qué tratamiento específico. En la actualidad, las decisiones de tratamiento clínico se basan en las características histopatológicas generales y en la información sobre la deficiencia de recomendación homóloga o en el tejido tumoral incluido en parafina.Los modelos biológicos que evalúan las respuestas específicas a la quimioterapia y a los tratamientos dirigidos aún no se han implementado en la rutina clínica. Hemos identificado las características clave del tejido de cáncer de ovario, específicamente los requisitos de cultivo necesarios para mantener su potencial de renovación in vitro, y utilizamos este conocimiento para lograr un crecimiento robusto a largo plazo de las líneas de organoides y establecer un biobanco a partir de muestras en varias etapas de la enfermedad. Nuestra experiencia diaria en el biobanco de organoides de cáncer de ovario muestra efectivamente una notable heterogeneidad en la biología de esta neoplasia maligna, lo que podría allanar el camino a una nueva clasificación o proporcionar la base para nuevas soluciones terapéuticas dirigidas al potencial del IAMCEST.

strategy-for-biobanking-ovarian-cancer-organoids-addressing

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Se describen las metodologías para el establecimiento...

Heterotípicos tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelado de estromal-epitelial interacciones durante la iniciación y progresión del cáncer de ovario

Los organoides derivados del paciente (DOP) son una herramienta poderosa en la investigación traslacional del cáncer, que refleja tanto la heterogeneidad genética y fenotípica de la enfermedad como la respuesta a las terapias personalizadas contra el cáncer. Aquí, se detalla un protocolo consolidado para generar DOP de cáncer de vejiga primario humano en preparación para la evaluación de análisis fenotípicos y respuestas a medicamentos.

Cultivo de organoides del cáncer de vejiga como herramientas de medicina de precisión

Los biobancos son recursos cruciales para la investigación biomédica y el Biobanco de Medicina Traslacional y Digital del Instituto Europeo de Oncología es un modelo en este campo. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de los procedimientos operativos estándar de los biobancos para la gestión de diferentes tipos de muestras biológicas humanas.

Biobanco para Medicina Traslacional: Procedimientos Operativos Estándar para el Manejo Óptimo de Muestras

Los organoides derivados del paciente (PDO) son un cultivo tridimensional (3D) que puede imitar el entorno tumoral in vitro. En el cáncer de ovario seroso de alto grado, las PDO representan un modelo para estudiar nuevos biomarcadores y terapias.

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

El presente protocolo describe métodos para evaluar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Aquí se incluyen métodos integrales de recubrimiento y tinción, así como procedimientos de cuantificación detallados y objetivos.

Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia

Aquí se proporciona un protocolo detallado para establecer organoides mamarios humanos a partir de resecciones de tumores de mama derivados de pacientes o tejido mamario normal. El protocolo proporciona instrucciones completas paso a paso para el cultivo, la congelación y la descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes humanos.

Establecimiento y cultivo de organoides mamarios derivados de pacientes

Presentamos un protocolo que se puede utilizar para realizar pruebas terapéuticas de fármacos con organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes.

Modelos de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario para pruebas preclínicas de medicamentos

Los organoides tumorales han revolucionado la investigación del cáncer y el enfoque de la medicina personalizada. Representan un modelo tumoral clínicamente relevante que permite a los investigadores estar un paso por delante del tumor en la clínica. Este protocolo establece organoides tumorales a partir de muestras frescas de tejido tumoral pancreático y xenoinjertos derivados de pacientes de origen adenocarcinoma de páncreas.

Establecimiento de organoides tumorales derivados del cáncer de páncreas y fibroblastos a partir de tejido fresco

Este protocolo describe un método para facilitar la recolección de muestras de prostatectomía radical. El objetivo es mapear, caracterizar y micro-macro diseccionar muestras de tejido de los especímenes en base a criterios anatomopatológicos antes de almacenarlas en un Biobanco.

Mejora de la fiabilidad de los biobancos de tumores de próstata con una técnica de muestreo y caracterización histológica mejoradas

Este protocolo describe el establecimiento de organoides tisulares tridimensionales (3D) a partir de células primarias del epitelio de superficie ovárica humana (hOSE). El protocolo incluye el aislamiento de hOSE a partir de ovarios recién recolectados, la expansión celular de la hOSE, los procedimientos de criopreservación-descongelación y la derivación de organoides. Se incluyen la inmunofluorescencia, el análisis cuantitativo y la demostración de su utilidad como plataforma de cribado.

Organoides del epitelio de la superficie del ovario humano como plataforma para estudiar la regeneración de tejidos

Este protocolo detalla el desarrollo de modelos de ratón de carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir de la derivación de organoides de trompas de Falopio murinos, su modificación genética para recapitular la genética HGSOC humana y su introducción en la bolsa ovárica de ratones singénicos para el desarrollo in vivo de tumores.

Desarrollo de líneas de organoides derivados de ratones a partir de células epiteliales de trompas de Falopio para el modelado de carcinoma de ovario seroso de alto grado

Aprende a establecer organoides de cáncer de ovario a partir de diferentes estadios de la enfermedad, abordando la variabilidad entre pacientes. Este protocolo facilita la expansión a largo plazo y el descubrimiento de biomarcadores predictivos.

Estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad (Video) | JoVE Journal

Estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad

Explorar más videos