Imágenes de microscopía de fuerza atómica de alta velocidad del autoensamblaje del motivo de estrella de tres puntos del ADN mediante roscado fototérmico fuera de resonancia

En nuestro laboratorio, desarrollamos nuevas tecnologías de medición para la biología a nanoescala. En particular, nos centramos en el desarrollo de la microscopía de fuerza atómica de alta velocidad para estudiar los procesos biológicos dinámicos a escala nanométrica. Y para ello, hemos desarrollado recientemente un nuevo modo de imagen, al que llamamos Photothermal Off Resonance Tapping, o PORT.

En este modo, estamos utilizando un láser de accionamiento dedicado para accionar los voladizos muy controlados a alta velocidad, lo que nos permite obtener los datos y hasta dos órdenes de magnitud más rápido que con el roscado convencional fuera de resonancia. El estándar de oro en AFM de alta velocidad es la imagen en modo resonante. En este modo, el voladizo se acciona a esta frecuencia de resonancia, lo que significa que no se puede controlar la posición del voladizo, solo su amplitud de oscilación.

Para AFM de velocidad normal, los modos de resonancia fuera son cada vez más comunes. Sin embargo, la frecuencia de actuación es limitada aquí, lo que hace que estos modos de imagen sean bastante lentos. Mediante el uso de un láser secundario para accionar el voladizo, podemos lograr frecuencias de actuación más altas, lo que significa velocidades de imagen más altas.

Este enfoque nos permite mantener las ventajas asociadas con otros modos de dotación de personal fuera de resonancia, lo que significa que podemos optimizar el equilibrio entre la sensibilidad y la velocidad de la imagen. Estamos limitados en la velocidad de imagen por el retrato más alto. Si deseamos aumentar el retrato, necesitamos aumentar la potencia del láser para mantener la misma amplitud de actuación.

Esto puede provocar un mal control de la fuerza y daños en la muestra. Mejorar el ancho de banda de los voladizos mediante la reducción de su tamaño y la mejora de la eficiencia de absorción láser nos permitirá alcanzar velocidades de puerto más altas al tiempo que garantizamos un espacio adecuado para las muestras. Este avance facilitará velocidades de imagen más rápidas, lo que es crucial para examinar las complejidades de la dinámica del ensamblaje.

Para empezar, limpia y prepara los voladizos. Montar voladizos en un soporte compatible con el sistema de microscopía electrónica de barrido o SEM. A continuación, caliente el gas precursor que se utilizará en el sistema de inyección de gas para hacer crecer la nueva punta.

Una vez que el vacío alcance menos de 10 a la potencia de menos cinco milibares, purgue la línea de inyección de gas 10 veces durante dos segundos cada una para eliminar el aire residual de la línea de boquillas. Utilice el SEM para localizar el extremo del voladizo. Incline el soporte en ángulo para alinear el voladizo correctamente para la obtención de imágenes de microscopía de fuerza atómica.

Ajuste la posición y el enfoque del SEM para obtener una visión clara de la punta del voladizo donde se cultivará la nanopunta de carbono. A continuación, configure los parámetros de deposición en el software para hacer crecer la nueva punta. Inicie el proceso de deposición para hacer crecer la punta con una radiación del haz de electrones en la punta en voladizo mientras inyecta el gas precursor y detenga la inyección de gas una vez que se complete la deposición.

Realice imágenes SEM posteriores al crecimiento para evaluar la calidad y las características de la punta recién crecida, incluidos su radio y longitud. Retire el soporte de la cámara SEM. Para empezar, prepare un microscopio de fuerza atómica de alta velocidad.

Use pinzas para colocar un voladizo ultracorto debajo del clip de resorte en el soporte del voladizo. Con una jeringa, agregue 50 microlitros de líquido a través del puerto de acceso al líquido izquierdo. A continuación, utilice tres mandos del cabezal AFM para alinear el láser de lectura en el voladizo.

Observe la sombra del voladizo en un papel blanco mientras maximiza la suma. A continuación, centre el punto láser en el fotodiodo utilizando los dos mandos dedicados. A continuación, marque la casilla de excitación habilitada en excitación VI para encender y alinear el láser de accionamiento, accionando y oscilando el voladizo.

Visualice las señales de excitación y deflexión en voladizo en un osciloscopio. Utilice el método de sombra y maximice la amplitud de oscilación con las perillas de ajuste del láser de accionamiento. Para ajustar la amplitud de oscilación en voladizo en el puerto, agregue un voltaje de CC al circuito de control de diodo láser en la caja de configuración en excitación VI e ingrese la entrada de CA de pico a pico para el circuito de control de diodo láser.

Para obtener curvas de interacción, configure el controlador Z VI en modo de contacto y haga clic en Iniciar para acercarse a la superficie de la muestra. Una vez alcanzada la superficie, realice una curva de fuerza frente a distancia en la rampa VI para la calibración de la sensibilidad a la deflexión en voladizo. Haga clic en retirar para retraer el piezoeléctrico Z de la superficie donde la punta no puede llegar.

Después de la retracción completa, cambie al modo de puerto en el controlador Z VI y encienda el láser de excitación en excitación VI.Configure el modo de puerto a la frecuencia deseada. Se obtuvieron curvas de interacción claras restando la oscilación libre de la oscilación de contacto, crucial para la obtención de imágenes no destructivas de muestras biológicas. A una velocidad de puerto de 100 kilohercios, se logró una buena calidad de imagen.

Sin embargo, a medida que la frecuencia de excitación se acercaba a la resonancia en voladizo, el control de retroalimentación se deterioraba, lo que provocaba curvas de interacción oscurecidas y una calidad de imagen degradada. Para comenzar, prepare una solución de 10 milimolares de acetato de magnesio. Con una jeringa Hamilton, inyecte 50 microlitros de la solución en el canal fluídico del soporte en voladizo, creando una gota de líquido que envuelve el voladizo.

Establezca el tamaño de escaneo en el escaneo VI en 800 por 800 nanómetros y la velocidad de línea en 100 hercios. Para escanear la superficie, haga clic en la flecha del marco para comprobar la calidad. Después de escanear, haga clic en retirar en el controlador Z VI para retraer el voladizo de la superficie.

Con una jeringa Hamilton, retire la solución tampón del soporte en voladizo. A continuación, prepare una solución de estrella de tres puntos de ADN diluido e inyecte 50 microlitros de esta solución en el soporte en voladizo. Realice imágenes con un área de 800 por 800 nanómetros a una velocidad de línea predeterminada de 100 hercios.

Después del escaneo inicial, ajuste el tamaño y la velocidad de la imagen y escanee VI a los valores especificados para una mayor adquisición de datos Mantenga la entrada para el punto de ajuste en la caja de punto de ajuste VI del controlador Z en el nivel más bajo necesario para un seguimiento preciso durante todo el proceso de imagen. Repita esto para todas las áreas de muestra requeridas. Usando este protocolo, el ensamblaje en tiempo real de motivos de estrellas de tres puntos de ADN en islas estables fue observado por el puerto AFM de alta velocidad.

Se obtuvieron imágenes claras a velocidades de línea de 100 y 200 hercios para una velocidad de puerto de 100 kilohercios. Sin embargo, las velocidades de imagen más altas sin aumentar las velocidades de puerto redujeron la calidad de la imagen debido a los rápidos cambios de topografía. Los resultados de las imágenes de la estrella de tres puntos de ADN para la entrada de CA de pico a pico más baja mostraron estructuras intactas, mientras que la entrada de CA de pico a pico más alta resultó en daño observable de la muestra debido a fuerzas más altas.

Del mismo modo, la entrada de compensación de CC más baja reveló estructuras intactas, mientras que la entrada de compensación de CC más alta causó daños estructurales.