Name: Imágenes de microscopía de fuerza atómica de alta velocidad del autoensamblaje del motivo de estrella de tres puntos del ADN mediante roscado fototérmico fuera de resonancia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprende a optimizar la microscopía de fuerza atómica de alta velocidad mediante el modo PORT para estudiar el autoensamblaje de motivos de ADN de estrella de tres puntos. Este protocolo mejora la velocidad y el control de imagen en biología nanométrica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imágenes mejoradas de motivos de estrellas de ADN mediante microscopía de fuerza atómica de alta velocidad PORT

<ol><li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+and+its+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy and its future prospects.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).</li>
<li>Uchihashi, T., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high-speed+atomic+force+microscopy+to+real-time+visualization+of+dynamic+biomolecular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).</li>
<li>Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy%3A+Imaging+and+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy.</a> FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).</li>
<li>Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+resolution+in+high-speed+atomic+force+microscopy+for+studying+biological+macromolecules+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action.</a> Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).</li>
<li>Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+photothermal+off-resonance+atomic+force+microscopy+reveals+assembly+routes+of+centriolar+scaffold+protein+SAS-6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6.</a> Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).</li>
<li>Heath, G. R., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+height+spectroscopy+reveals+%C2%B5s-dynamics+of+unlabeled+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules.</a> Nature Communications. 9, 4983(2018).</li>
<li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndo%2C+T+%22High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+in+Biology%22">High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).</li>
<li>Fukuda, S., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+high-speed+atomic+force+microscopy+for+imaging+of+biomolecular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes.</a> Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).</li>
<li>Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hierarchical+assembly+of+septins+revealed+by+high-speed+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM.</a> Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).</li>
<li>PeakForce Tapping. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html">https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html</a> (2023).</li>
<li>Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+S+%22International+Conference+on+Cognitive-based+Information+Processing+and+Applications+%28CIPA+2021%29%22">International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021)</a>. , Springer. Singapore. 671-679 (2022).</li>
<li>Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+force+mode%3A+a+new+method+for+the+investigation+of+surface+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Interface+Analysis%22%5BJournal%5D)">Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties.</a> Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).</li>
<li>Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+measurement+of+elastic%2C+electrostatic+and+adhesive+properties+by+scanning+force+microscopy%3A+pulsed-force+mode+operation%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation.</a> Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).</li>
<li>De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+mode+scanning+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Jumping mode scanning force microscopy.</a> Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).</li>
<li>Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+attractive+force+microscope+using+photothermal+vibration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%22%5BJournal%5D)">Scanning attractive force microscope using photothermal vibration.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).</li>
<li>Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+ordering+of+blunt-ended+DNA+tiles+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).</li>
<li>Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blunt-ended+DNA+stacking+interactions+in+a+3-helix+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif.</a> Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).</li>
<li>Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+large+2D+lattices+out+of+DNA-tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles.</a> Molecules. 26 (6), 1502(2021).</li>
<li>He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+hexagonal+DNA+two-dimensional+%282D%29+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).</li>
<li>Lipid-DNA Method. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm">http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm</a> (2023).</li>
<li>Pyne, A. L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-pair+resolution+analysis+of+the+effect+of+supercoiling+on+DNA+flexibility+and+major+groove+recognition+by+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides.</a> Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).</li>
<li>Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tip+effects+in+single-molecule+high-speed+atomic+force+microscopy+using+DNA+origami+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).</li>
<li>Nievergelt, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-range+HS-AFM+imaging+of+DNA+self-assembly+through+in+situ+data-driven+control%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control.</a> Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).</li>
<li>Caroprese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+flexibility+dominates+over+binding+strength+for+supramolecular+crystallinity%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Welcome to Mao Group. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html">https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html</a> (2023).</li>
<li>Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+for+high-speed+atomic+force+microscopy+optimized+for+low+phase-lag%5BTitle%5D)+AND+%222017+IEEE+International+Conference+on+Advanced+Intelligent+Mechatronics+%28AIM%29%22%5BJournal%5D)">Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag.</a> 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).</li>
<li>SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/</a> (2023).</li>
<li>Open Hardware. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/</a> (2023).</li>
<li>AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/</a> (2023).</li>
<li>AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW">https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW</a> (2023).</li>
<li>BioLever. AppNano. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.appnano.com/product-page/biolever">https://www.appnano.com/product-page/biolever</a> (2023).</li>
<li>Python Scripting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html">http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html</a> (2023).</li>
<li>Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cantilever+actuation+for+fast+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).</li>
<li>Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+feedback+performance+in+off-resonance+AFM+modes+through+pulse+train+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling.</a> arXiv. , (2023).</li>
<li>Giessibl, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Advances in atomic force microscopy.</a> Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).</li>
<li>Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndo%2C+T+%22Encyclopedia+of+Biophysics%22">Encyclopedia of Biophysics</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AC10DS</td><td>Olympus</td><td>BL-AC10FS-A2</td><td>Descontinuado&nbsp;</td></tr><tr><td>Biometra Compact XS/S</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-025-199&nbsp;</td><td>Unidad de electroforesis&nbsp;</td></tr><tr><td>Biometra TRIO</td><td>Biometra GmbH</td><td>207072X</td><td>termociclador para recocido</td></tr><tr><td>Configuración de AFM personalizada</td><td>Laboratorio para Bio-Nano Instrumentación, Instituto Interfacultativo de Bioingeniería, Escuela de Ingeniería, Escuela Politécnica F&eacute; d&eacute; rale Lausanne</td><td></td><td>Obtenible a través del laboratorio para Bio-Nano Instrumentación</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ITW Reactivos</td><td>A5097</td><td>En tampón de recocido</td></tr><tr><td>Medidor de potencia láser</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Digital Handheld Optical&nbsp; Consola de medidor de potencia y energía</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación Lively 3AP, MP-310</td><td>Major Science</td><td>MP-310</td><td>Electroforesis Fuente de alimentación</td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB544692</td><td>Tampón de recocido</td></tr><tr><td>TBE</td><td>Thermo Scientific</td><td>327330010</td><td>Tampón de funcionamiento para electroforesis</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>Tampón de recocido</td></tr></tbody></table>

imágenes de microscopía de fuerza atómica de alta velocidad del autoensamblaje del motivo de estrella de tres puntos del adn mediante roscado fototérmico fuera de resonancia

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-Point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping

En esta investigación, se observó con éxito el proceso de ensamblaje dinámico de motivos de estrellas de 3 puntas de ADN en islas estables utilizando las capacidades del HS-PORT AFM. Esta técnica nos permitió capturar el ensamblaje de estas estructuras en tiempo real. En la Figura 2A, B, obtenemos un escaneo de imagen clara a velocidades de línea de 100 Hz y 200 Hz, respectivamente, para una velocidad de PORT de 100 kHz (tamaño de escaneo de 800 nm por 800 nm). Esto corresponde a 3,9 y 1,95 ciclos de oscilación por píxel, respectivamente. Sin embargo, la obtención de imágenes a velocidades más altas sin aumentos simultáneos en la velocidad PORT que permitiría un mínimo de un ciclo de oscilación por píxel reducirá drásticamente la calidad de la imagen, como se puede ver en la Figura 2C (0,78 de un ciclo de oscilación por píxel). La velocidad de obtención de imágenes está limitada por la velocidad a la que el voladizo sondea la superficie con un control adecuado de la fuerza de la muestra de punta, ya que la tasa de cambio de topografía se vuelve demasiado rápida para realizar un seguimiento a la velocidad de muestreo de la superficie.
Además de establecer una tasa PORT lo suficientemente alta, es importante que las curvas PORT contengan la información necesaria para controlar las fuerzas. Especialmente la resistencia hidrodinámica y el bajo ancho de banda de detección pueden oscurecer la fuerza aplicada. La Figura 3 muestra la deflexión en voladizo a diferentes distancias de la superficie de la muestra y las tasas de frecuencia de excitación utilizando un promedio de 4096 curvas para reducir el ruido. Las curvas azules de la Figura 3A (para una velocidad PORT de 100 kHz) y la Figura 3D (para una velocidad PORT de 500 Hz) representan el movimiento del voladizo cuando el voladizo está lejos de la superficie y oscila libremente (sin tocar la superficie durante un ciclo de oscilación). Las curvas rojas muestran la deflexión del voladizo cuando el voladizo oscila cerca de la superficie y entra en contacto intermitentemente con la superficie, sondeando la muestra. Para obtener la curva de interacción verdadera y, por lo tanto, la interacción punta-muestra, restamos la curva azul de la curva roja para obtener la Figura 3B,E, respectivamente. En la Figura 3B se muestra un ejemplo de una curva de interacción clara necesaria para la obtención de imágenes no destructivas de muestras biológicas. Esta configuración conduce a la buena calidad de imagen que se muestra en la Figura 3C, donde la velocidad PORT es de 100 kHz. A medida que aumentamos la frecuencia de excitación cerca de la resonancia del voladizo, en algún punto, el control de retroalimentación se deteriora, incluso cuando el voladizo muestra suficiente oscilación de amplitud para desprenderse de la superficie después de aumentar la potencia del láser de excitación (Figura 3E). Si la frecuencia PORT está demasiado cerca de la frecuencia de resonancia en voladizo, la resonancia en voladizo limita la respuesta temporal de la dinámica en voladizo. Por lo tanto, la flexión en voladizo ya no representa con precisión la interacción punta-muestra, y la curva de interacción que obtenemos se oscurece. Esto conduce a una degradación de la calidad de la imagen, como se muestra en la Figura 3F.
También puede producirse una curva de interacción comprometida a frecuencias PORT más altas debido a la reducción de la eficiencia de actuación a frecuencias más altas33, que actualmente es uno de los factores limitantes de los voladizos comerciales de AFM de alta velocidad. Esta disminución finalmente alcanza un nivel de umbral en la caída, en el que se dificulta la obtención de imágenes adecuadas: la amplitud de la oscilación puede ser insuficiente para desprenderse de la superficie, y la punta siempre está en contacto, dañando las estructuras de la muestra. Para contrarrestar la disminución de la amplitud causada a velocidades PORT más altas, exploramos un aumento en la potencia del láser. Utilizamos un cabezal PORT que puede alcanzar potencias láser más altas para observar mejor este efecto. La potencia del láser de excitación, que medimos con un medidor de potencia, se dividió en los componentes de CC y CA. La potencia total se controla ajustando en el software el voltaje de pico a pico (entrada de CA de pico a pico) y el voltaje de CC (entrada de compensación de CC) enviados al circuito de control de diodo láser. La Figura 4A muestra la amplitud de oscilación en voladizo de pico a pico resultante de un aumento de la entrada de CA de pico a pico. Como era de esperar, la amplitud de la oscilación se correlaciona bien con el valor de entrada de CA. Es importante tener en cuenta que estas amplitudes de pico a pico son más altas que las que se utilizan normalmente en las imágenes PORT. Al obtener imágenes de muestras frágiles, la amplitud de CA es del orden de 10-30 nm. La Figura 4B muestra la amplitud de oscilación en voladizo de pico a pico para mayores entradas de desplazamiento de CC. La amplitud de la oscilación pico a pico permanece bastante constante en el rango de voltaje de compensación de CC. Atribuimos las pequeñas variaciones a la no linealidad en la detección. La Figura 4C muestra el aumento de los componentes de potencia del láser de CA y CC como resultado del aumento de la CA pico a pico. La Figura 4D representa el aumento de los componentes de potencia del láser de CA y CC como resultado del aumento del desplazamiento de entrada de CC.
Los efectos del aumento de la entrada de CA de pico a pico y la entrada de compensación de CC se probaron por separado para determinar los efectos respectivos sobre la potencia total y la amplitud de oscilación. Un aumento en la potencia del láser hace que la muestra se interrumpa, probablemente a través del aumento de la temperatura, mientras que un aumento en la amplitud de la oscilación aumentará la fuerza de impacto en la muestra5. El aumento exclusivo de la entrada de CA de pico a pico tendrá menos impacto en el aumento total de la potencia del láser, como se muestra en la Figura 4C, y aumentará predominantemente la amplitud de la oscilación en voladizo (y, en consecuencia, la fuerza de impacto), como se muestra en la Figura 4A. El aumento de la entrada de compensación de CC tendrá un mayor efecto en el aumento de la potencia de salida del láser, como se muestra en la Figura 4D, que calienta la muestra pero tendrá un efecto insignificante en la amplitud de deflexión, como se ve en la Figura 4B. Los resultados de las imágenes se representan en la Figura 4E, F. La Figura 4E muestra el ADN 3PS para la entrada de CA de pico a pico más baja (imagen de la izquierda, con un círculo en azul) y la entrada de CA de pico a pico más alta (imagen de la derecha, con un círculo rojo), lo que resulta en daño de la muestra presumiblemente a través de las fuerzas más altas. La Figura 4F exhibe ADN 3PS para la entrada de desplazamiento de CC más baja (imagen de la izquierda, con un círculo en azul) y la entrada de desplazamiento de CC más alta (imagen de la derecha, con un círculo en rojo), donde las estructuras están dañadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig01.jpg"> 
Figura 1: La configuración del HS-AFM. (A) El cabezal del puerto en el escáner y la base del AFM, que muestra la (i) perilla para ajustar el enfoque del láser de lectura en el voladizo, (ii) la perilla para ajustar la posición del láser de lectura en el voladizo, (iii) la perilla para ajustar la posición horizontal del láser en el fotodiodo, (iv) la perilla para ajustar la posición vertical del láser en el fotodiodo, y (v) perillas para ajustar la posición del láser de accionamiento fototérmico en el voladizo. (B) Un primer plano del voladizo en la vista de la sección transversal de la cabeza con la etapa de muestra, donde (vi) es el clip de resorte que sostiene el voladizo. El canal para la inyección de líquido está marcado en rojo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig02.jpg"> 
Figura 2: Muestra de ADN 3PS fotografiada con AC10 a una velocidad de PUERTO de 100 kHz a diferentes velocidades de línea. (A) 100 Hz (3,9 ciclos de oscilación por píxel), (B) 200 Hz (1,95 ciclos de oscilación por píxel) y (C) 500 Hz (0,78 ciclos de oscilación por píxel). Las imágenes se tomaron a puntos de ajuste de 350 pN o menos. Barra de escala 200 nm. Se tomó una curva de fuerza para obtener la sensibilidad a la deflexión después de la toma de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig03v3.jpg"> 
Figura 3: Deflexión en voladizo, curva de interacción y calidad de imagen a velocidades de 100 KHz y 500 kHz PORT. (A) Deflexión en voladizo (oscilación libre del voladizo cerca pero sin tocar la superficie en azul, y la oscilación del voladizo cuando el voladizo está en contacto intermitente con la superficie en rojo), (B) curva de interacción y (C) calidad de imagen respectiva para una velocidad PORT de 100 kHz. (D) Deflexión en voladizo (oscilación libre en voladizo cerca pero sin tocar la superficie en azul, y la oscilación del voladizo cuando el voladizo está intermitentemente en contacto con la superficie en rojo), (E) curva de interacción y (F) calidad de imagen respectiva para una velocidad PORT de 500 kHz. Las imágenes se tomaron a una velocidad de línea de 100 Hz. Barra de escala de 200 nm. Se tomó una curva de fuerza para obtener la sensibilidad a la deflexión después de la toma de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig03largev3.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig04.jpg"> 
Figura 4: Efecto del voltaje de entrada de CA pico a pico y pico Voltaje de entrada de compensación de CC. Efecto de aumentar el voltaje de entrada de CA pico a pico (A) y el voltaje de entrada de compensación de CC (B) en la oscilación pico a pico del voladizo. Efecto del aumento del voltaje de entrada de CA pico a pico (C) y el voltaje de entrada de compensación de CC (D) en la potencia del láser de CA y CC. Calidad de imagen al mínimo (con un círculo en azul) y máximo (con un círculo rojo) (E) de voltaje de entrada de CA pico a pico y voltaje de entrada de compensación de CC (F). Al aumentar el voltaje de entrada de CA pico a pico, el voltaje de entrada de compensación de CC se mantuvo en 600 mV. Al aumentar el voltaje de entrada de compensación de CC, el voltaje de entrada de CA pico a pico se mantuvo en 200 mV. La integridad de la muestra se ve comprometida para la configuración de alta potencia. La velocidad PORT se mantuvo en 100 kHz y la velocidad de línea en 100 Hz. Barra de escala 200 nm. Se tomó una curva de fuerza para obtener la sensibilidad a la deflexión después de la toma de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Imágenes de microscopía de fuerza atómica de alta velocidad del autoensamblaje del motivo de estrella de tres puntos del ADN mediante roscado fototérmico fuera de resonancia

High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) is a popular molecular imaging technique for visualizing single-molecule biological processes in real-time due ...

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A modo de aprovechar microscopio de fuerza atómica (AFM) el método para la visualización de ADN plásmido, proteínas citoplasmáticas, y los complejos ADN-proteína se describe. El método incluye los enfoques alternativos para la preparación de muestras para el AFM imágenes después de la manipulación bioquímica. ADN que contiene regiones específicas que interactúan las proteínas se observan en las condiciones de amortiguación casi fisiológico.

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Este video describe un método para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en moléculas de ADN en loci específicos utilizando imágenes de una sola molécula. Estos condensados se forman debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, que permiten el reclutamiento de ARN polimerasa II y una mejor transcripción de genes.

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En este video, demostramos la microscopía estática de fuerza atómica para visualizar nucleosomas ensamblados. Esta técnica de imagen de alta resolución permite el estudio de la estructura del nucleosoma.

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Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

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Polímeros semiflexible mostrar propiedades mecánicas únicas que se aplican extensivamente por los sistemas de vida. Sin embargo, estudios sistemáticos sobre biopolímeros son limitados puesto que propiedades como la rigidez del polímero son inaccesibles. Este manuscrito describe cómo esta limitación es burlada por nanotubos de ADN programables, permitiendo estudios experimentales sobre los efectos de la rigidez del filamento.

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Imágenes de microscopía de fuerza atómica de alta velocidad del autoensamblaje del motivo de estrella de tres puntos del ADN mediante roscado fototérmico fuera de resonancia (Video) | JoVE Journal

Imágenes de microscopía de fuerza atómica de alta velocidad del autoensamblaje del motivo de estrella de tres puntos del ADN mediante roscado fototérmico fuera de resonancia

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