Name: Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a producir vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando células HEK293 en suspensión. Este protocolo optimizado reduce el tiempo y el trabajo necesarios para la terapia génica en el sistema nervioso central.

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Este trabajo contó con el apoyo de una beca del fondo de investigación de la Real Academia de las Artes y las Ciencias de los Países Bajos (KNAW) y una subvención de Start2Cure (0-TI-01). Agradecemos a Leisha Kopp por sus aportes y consejos en la configuración del protocolo. Las figuras fueron creadas con Biorender.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Real Academia de Ciencias de los Países Bajos (KNAW) y se ajustaron a la Ley holandesa de experimentación animal en el marco del proyecto número AVD8010020199126. En la Figura 1, se proporciona una descripción general esquemática del protocolo completo. Desde la siembra de células hasta la purificación de AAV, el protocolo tarda 6 días en completarse.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Purificación de plásmidos<ol><li>Realice la extracción de plásmidos como lo describe el fabricante con algunos ajustes para garantizar la esterilidad de los plásmidos.</li>
		<li>Prepare etanol al 70% con agua destilada estéril y etanol absoluto.</li>
		<li>Después de la etapa de centrifugación de isopropanol, seque los plásmidos en la campana de la cabina de flujo y agregue etanol estéril al 70% a los tubos. Después de la precipitación de etanol, seque los plásmidos en la campana de la cabina de flujo y vuelva a suspender el plásmido en agua destilada estéril. Tenga cuidado de utilizar tubos de microcentrífuga esterilizados.</li>
		<li>Tome una alícuota para la cuantificación, el análisis de restricción y, si es necesario, la secuenciación. Se recomienda comprobar la integridad de las repeticiones terminales invertidas (ITR), ya que las mutaciones pueden tener un impacto negativo en el rendimiento. Ajuste la concentración de la muestra a 1 μg/μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de 10x Tampón de lisis Tween<ol><li>Disuelva 30,3 g de tampón Tris y 2,033 g de MgCl2,6H 2O en 400 ml de agua destilada estéril, ajuste el pH a 8,0 y aumente el volumen total a 450 ml.</li>
		<li>Mantenga el Tween 20 estéril, agregue 50 ml de Tween 20 a la solución tampón en la campana y esterilice con un filtro de vacío de 0,2 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluciones de yodixanol<ol><li>La solución de yodixanol se suministra a una concentración del 60%. Utilice la solución inicial para hacer soluciones de 15%, 25% y 40%.</li>
		<li>Para una solución al 15 %, diluir 60 ml de solución al 60 % con 48 ml de NaCl 5 M y 48 ml de PBS-MK (5 veces PBS con 5 mM de MgCl2 y 12,5 mM de KCl) y agregar agua destilada hasta 240 ml.</li>
		<li>Para una solución al 25%, diluir 67 ml de solución al 60% y 32 ml de PBS-MK. Agregue agua destilada hasta 160 ml. Mezclar bien y añadir 1,6 ml de solución de rojo de fenol.</li>
		<li>Para una solución al 40 %, diluya 160 ml de solución al 60 % con 48 ml de PBS-MK y agregue agua destilada hasta 240 ml. Para una solución al 60%, agregue 1 ml de rojo de fenol a 100 ml de solución al 60%.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de sacarosa PBS al 5%<ol><li>Añadir 25 g de sacarosa a un frasco de 500 ml de DPBS sin calcio ni magnesio. Agitar bien y filtrar con un filtro de vacío de botella de 0,2 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de polietilenglicol (PEG) 8000<ol><li>Disolver 400 g de PEG 8000 y 24 g de NaCl en agua destilada estéril y ajustar a un volumen final de 1000 mL. Revuelva con fuego hasta que se disuelva por completo. Ajuste el pH a 7.4 usando papel de pH.</li>
		<li>Esterilizar con un filtro de vacío de botella de 0,2 μM para obtener una solución PEG 8000 al 40%. Tenga en cuenta que la filtración tardará un tiempo debido a la viscosidad del almacén de solución a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultivo de células en suspensión HEK293
<ol><li>Use toallitas empapadas en etanol al 70% para la limpieza. Limpie la campana de bioseguridad, prepare y limpie todos los materiales necesarios para el cultivo de células.</li>
	<li>Precalentar 30 mL de medio celular de suspensión a 37 °C en un tubo de cultivo cónico de 50 mL. Recuperar células de producción viral a partir de nitrógeno líquido. Descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C. Justo antes de que el vial se descongele por completo, límpielo con una toallita empapada en etanol al 70% y transfiera el vial a la campana de bioseguridad. NOTA: Los detalles de las células de producción viral utilizadas aquí se proporcionan en la Tabla de Materiales.</li>
	<li>Transfiera rápidamente las células al tubo de cultivo cónico precalentado de 50 ml. Cultivo de células en incubadora de agitación a 37 °C, 80% de humedad, 8% de CO2, 200 revoluciones por minuto (RPM) y un diámetro de agitación de 50 mm. Células de paso, una vez que la viabilidad es superior al 90% y la densidad celular es superior a 1-3 x 106 células/mL. NOTA: La incubadora utilizada tiene un diámetro de agitación de 50 mm; Las condiciones de cultivo deben ajustarse para un diámetro de agitación diferente.</li>
	<li>Pasar las células 3-4 días después de la descongelación. Revise los tubos de cultivo para asegurarse de que no haya signos de contaminación; Por ejemplo, el hongo aparecerá como un anillo descolorido (negro o verde).</li>
	<li>Preparar 400 μL de solución de azul de tripano al 0,4% por muestra utilizando una tira de 1 mL.</li>
	<li>Recupere rápidamente las células en suspensión de la incubadora. Extraiga inmediatamente 500 μL del tubo con una tira de 1 mL. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Añadir 100 μL de suspensión celular al tubo de azul de tripano preparado. Invierta suavemente el tubo para mezclar; No pipetear para mezclar, ya que esto provocará la muerte celular. Regrese las células a la incubadora.</li>
	<li>Tome 50 μL de suspensión celular tratada con azul de tripano y aplíquelo al portaobjetos del hemocitómetro. Cuente el total de células viables y calcule la cantidad de suspensión celular y el medio necesario para el paso o la transfección al día siguiente.</li>
	<li>Calentar el medio en la incubadora durante 10-15 min. Agregue la suspensión celular al medio calentado y regrese a la incubadora. Para células de paso durante 3 días (es decir, de lunes a jueves), ajuste a 0,5 x 106 células/ml; para las células de paso durante 4 días (es decir, de jueves a lunes), se establece en 0,3 x 106 células/ml. NOTA: Según el fabricante, las células de producción viral se duplican cada 26 h y deben estar entre 3,5 x 106 y 5,5 x 106 antes de pasar al paso. Las celdas se pueden conservar hasta el paso 20.</li>
</ol>3. Transfección
<ol><li>Día 1<ol><li>A las 24 h antes de la transfección, cultivar 1 x 106 células por/mL en 300 mL de medio.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 2<ol><li>Medio caliente, plásmidos y reactivo de transfección a temperatura ambiente. Para conocer las cantidades a preparar, consulte la Tabla 1.</li>
		<li>Brevemente plásmidos y reactivos de vórtice. Agregue plásmidos al medio preparado, vórtice. Agregue brevemente el reactivo de transfección y el vórtice. No agite la mezcla después de este paso. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Mientras tanto, cuente las células preparadas el día 1. Las células deben estar entre 2 y 2,5 x 106 células por ml y > 95% viables.</li>
		<li>Después de la incubación, gota a gota, agregue la mezcla de transfección a las células mientras gira suavemente el tubo. Incubar durante 72-96 h.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Recolección de las células
<ol><li>Día 5<ol><li>Añadir 33 mL de tampón de lisis celular 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), mezclar agitando suavemente e incubar a 37 °C durante 1,5 h con agitación.</li>
		<li>Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 60 min. Filtrar a través de un filtro de vacío PES de 0,45 μM para clarificar el lisado celular, dejando el lisado clarificado en el recipiente del filtro. NOTA: Opcional después de la filtración: tomar 50 μL de muestra para PCR cuantitativa (Q-PCR).</li>
		<li>Añadir 90 ml de solución PEG 8000 al 40% a 360 ml de lisado celular filtrado.</li>
		<li>Limpie la barra agitadora con etanol al 70% y agréguela a la muestra. Revuelva en hielo o en la cámara frigorífica a 300 RPM durante 1 h. Incubar a 4 °C sin agitar durante la noche. NOTA: Se han probado tiempos de incubación de 1 h a 72 h. Los tiempos de incubación más largos tienen un efecto negativo en la precipitación general de proteínas.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Purificación de yodixanol
<ol><li>Día 6<ol><li>Transfiera toda la muestra de volumen de cultivo precipitado PEG a un tubo cónico grande y limpio y centrífugo a 2820 x g y 4 °C durante 15 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de PEG en 15 mL de DPBS con calcio y magnesio. El gránulo es difícil de resuspender; Tómese el tiempo para hacer esto con cuidado.</li>
		<li>Transfiera la pieza resuspendida a un tubo limpio de 50 ml. El PEG permanecerá a los lados del tubo del biorreactor. Agregue 10 ml adicionales, teniendo cuidado de recoger todo el precipitado de PEG. Transfiera todo a un recipiente de 50 ml para obtener un volumen total de 25-30 ml.</li>
		<li>Añadir 40 μL de DNasa I (10 U/μL). Colocar en la incubadora durante 1 h 37°C. NOTA: Opcional después de la incubación de la DNasa: tomar 50 μL de muestra para Q-PCR.</li>
		<li>Limpie bien las barras de agitación que se utilizaron para la precipitación de PEG con una solución de cloruro seguida de etanol al 70%. Deje las barras agitadoras en etanol al 70% para el próximo experimento.</li>
		<li>Llene un tubo de polialómero de 25 mm x 89 mm con una pipeta Pasteur de vidrio con 15,5 ml de lisado celular concentrado en cada tubo. Después de añadir el lisado celular, cambie la pipeta Pasteur de vidrio por una nueva.</li>
		<li>Añadir soluciones de yodixanol del 15% al 60%: infundir 9 ml de la solución de yodixanol al 15% suavemente debajo del lisado celular. A continuación, agregue 5 ml de las soluciones de yodixanol al 25% y 40% y, por último, agregue 5 ml de la solución de yodixanol al 60%.</li>
		<li>Rellene el tubo con una jeringa con DPBS +/+ para eliminar la mayoría de las burbujas de aire, teniendo cuidado de no alterar las capas de yodixanol. Selle el tubo con un adorno de tubo eléctrico.</li>
		<li>Centrifugar en un rotor no oscilante durante 1 h 10 min a 490.000 x g a 16 °C en una ultracentrífuga. Retire de la ultracentrífuga, ensamble los tubos en un broche de metal y prepare los tubos de recolección. Abra el rotor en el capó en caso de derrames durante el centrifugado.</li>
		<li>Prepare un tubo de 50 ml (para desechar el tubo del rotor), un tubo de 15 ml (para recoger el virus), una jeringa de 5 ml y una aguja de 30 G y 19 G por gradiente.</li>
		<li>Perfore un agujero en la parte superior del tubo con una aguja de 30 G. Deje la aguja en su lugar. Coloque una aguja de 19G en la jeringa.</li>
		<li>Perfore con cuidado el tubo justo debajo de la interfaz 40%/60%, que se puede ver por el indicador rojo de fenol. Asegúrese de que el bisel de la aguja esté orientado hacia la capa del 40%.</li>
		<li>Retire la aguja 30G de la parte superior del tubo con la mano no dominante. Con la aguja biselada, extraiga lentamente el virus/yodixanol. El objetivo es extraer entre 3 mL y 4,5 mL. Aproximadamente a la mitad y bien dentro de la capa de 40%/transparente, gire la aguja para que el bisel quede hacia abajo y continúe extrayendo para evitar la recolección de la capa de proteína.</li>
		<li>Prepare el tubo de 50 ml con la mano no dominante, extraiga con cuidado la aguja mientras coloca el tubo en el tubo de 50 ml y deséchelo. Diluya la suspensión de AAV/iodixanol 5 veces en DPBS llenando hasta 15 ml.</li>
		<li>Transferir a un tubo de filtro centrífugo y centrifugar a 3428 x g, 4 °C durante 10 min. Deseche el flujo continuo; Retire con cuidado el soporte del filtro y coloque el recipiente inferior en una botella de desecho. Agregue 15 ml de sacarosa PBS-5% para filtrar y vuelva a suspender.</li>
		<li>Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 20 min. Repita el intercambio de búfer al menos 3 veces. Almacenar virus (~150-250 μL) a 4 °C (PHP. B un máximo de 3 meses) o alícuotas en alícuotas de 50 μL y almacenar a -80 °C durante mucho tiempo. NOTA: PHP. Las variantes de la cápside B son sensibles a la congelación/descongelación, por lo que esto debe evitarse.</li>
		<li>Realice la valoración como se describe en un protocolo anterior10.</li>
	</ol></li>
</ol>

Producción simplificada y eficiente de AAV con el cultivo en suspensión HEK293

<ol><li>Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+of+administration+for+adeno-associated+viruses+carrying+gene+therapies+for+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases.</a> Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).</li>
<li>Pietersz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhP.B+Enhanced+adeno-associated+virus+mediated-expression+following+systemic+delivery+or+direct+brain+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Several+rAAV+vectors+efficiently+cross+the+blood%E2%80%93brain+barrier+and+transduce+neurons+and+astrocytes+in+the+neonatal+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22MolTher%22%5BJournal%5D)">Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system.</a> MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).</li>
<li>Goertsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+variants+with+brain-wide+transgene+expression+and+decreased+liver+targeting+after+intravenous+delivery+in+mouse+and+marmoset%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset.</a> Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li>
<li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((purification%2C+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> J Vis Exp. (143), e58960(2019).</li>
<li>Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+dual+promoter+adeno-associated+viral+vector+for+efficient+delivery+of+two+genes+to+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Thr%22%5BJournal%5D)">A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons.</a> Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).</li>
<li>Verhaagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+gene+therapy%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal gene therapy, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).</li>
<li>Nasse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addgene+AAV+data+hub%3A+A+platform+for+sharing+AAV+experimental+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data.</a> Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).</li>
<li>Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+using+suspension+HEK293+cells+and+continuous+harvest+of+vector+from+the+culture+media+for+GMP+FIX+and+FLT1+clinical+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector.</a> Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).</li>
<li>Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).</li>
</ol>

Mirus proporcionó una muestra gratuita de TransIT para las pruebas iniciales, después de lo cual se compró el reactivo para su uso posterior. Los autores no tienen otros intereses financieros contrapuestos que informar.

La administración sistémica de AAV es una herramienta poderosa para la transferencia de genes al SNC; sin embargo, la producción de AAV es un proceso costoso y laborioso. Mediante el uso de celdas de suspensión, se reduce la mano de obra y los plásticos en comparación con el cultivo adherente de HEK293T en placas de 15cm2 . Además, los tubos cónicos implementados aquí son fáciles de manejar y maximizan el uso del espacio del laboratorio. El protocolo fue establecido por dos investigadores y posteriormente aplicado por otros en el laboratorio. Una serie de producciones realizadas por tres investigadores independientes produjo, en promedio, suficientes vectores por lote para inyectar de 6 a 7 ratones.
El uso de células de suspensión HEK293 ha sido descrito anteriormente13,14. Sin embargo, la línea celular en suspensión descrita no está disponible gratuitamente para fines de investigación. Esto supone un cuello de botella para los investigadores académicos a la hora de aplicar los métodos descritos. La línea celular en suspensión descrita en este protocolo está disponible gratuitamente para fines de investigación. El cultivo de las células en suspensión se realizó en tubos cónicos en lugar de los de Erlenmeyer para ahorrar espacio y tiempo. Con Erlenmeyer's, se pueden cultivar hasta 4 producciones simultáneamente, frente a 12 producciones que utilizan tubos cónicos. Los tubos cónicos se pueden transferir directamente a la centrífuga para la cosecha.
Una posibilidad alternativa para un sistema de cultivo celular en suspensión es el sistema baculoviral. Una ventaja del sistema baculo es que estas células y medios están disponibles públicamente y se pueden aplicar fácilmente. Para los académicos, están disponibles repositorios como Addgene, que contiene una gran biblioteca de plásmidos de transferencia AAV listos para usar12. Si bien estos también pueden tener advertencias, como ITR defectuosos, sirven como una buena fuente para experimentos plug-and-play. Se optó por mantener un sistema de producción basado en HEK293, ya que los plásmidos disponibles se pueden utilizar directamente para la producción sin la transferencia de la construcción al baculovirus.
Para la transfección, la polietileno es relativamente barata y, por lo tanto, es el reactivo de transfección de elección. Como alternativa, se evaluó un nuevo método de transfección (TransIt) para aumentar el rendimiento de los vectores. Se observó una mejora de tres veces utilizando la mitad de la cantidad de plásmidos. Esto hace que TransIt sea un reactivo de transfección alternativo interesante cuando se necesitan existencias más grandes. Una limitación de esto es el costo, lo que lo hace menos interesante para lotes pequeños.
En resumen, aquí se presenta un protocolo que se puede utilizar para producir AAV de alto rendimiento en células en suspensión en un entorno de laboratorio académico. Se describen herramientas que se pueden utilizar en un entorno de laboratorio académico para producir AAV con un alto rendimiento.

El virus adenoasociado (AAV) fue descubierto en 1965 y desde entonces se ha utilizado en una gran cantidadde aplicaciones. Los AAV se han aplicado en la investigación neurocientífica para estudiar la función génica y neuronal, mapear neurocircuitos o producir modelos animales para enfermedades2. Tradicionalmente, esto se hace inyectando directamente en el sitio de interés, ya que la mayoría de los serotipos naturales no atraviesan la barrera hematoencefálica ni necesitan una dosis alta para hacerlo 1,2,3.
Con el descubrimiento de AAV. PHP.B4 y cápsidas de última generación como AAV. PHP.eB5 y AAV. CAP-B106, es posible dirigirse al sistema nervioso central (SNC) mediante una simple inyección sistémica. El mapeo espacial revela las células a las que se dirige AAV. PHP.eB a nivel celular 6,7. En combinación con promotores/potenciadores específicos, estas cápsidas ofrecen amplias oportunidades para que los neurocientíficos estudien los genes y la función cerebral mediante la administración no invasiva de AAV 4,8.
Mientras que se necesita una dosis más baja para AAV. PHP.eB (típicamente 1 a 5 x 1011 copias del genoma (GC)/ratón) en comparación con AAV9 (4 x 1012 GC/ratón)7, aún se necesita producir más vector en comparación con las estrategias de inyección directa (típicamente inyección de 1 x 109 GC/μL). La mayoría de los serotipos naturales se pueden producir utilizando el sistema clásico de cultivo celular adherente en combinación con la purificación de yodixanol 9,10,11,12. Para AAV. PHP.eB Esto implica un proceso laborioso de cultivo y transfectación de células para obtener suficientes vectores para un experimento8. Por lo tanto, se desarrolló la producción de AAV en cultivo celular en suspensión en tubos cónicos. Los tubos cónicos, con una capacidad de hasta 300 ml, son compactos, lo que ahorra espacio en la incubadora y plásticos. Las células en suspensión son mucho más fáciles de cultivar y manipular en grandes cantidades que las células adherentes en placas de 15 cm. Los componentes de transfección del protocolo siguen siendo los mismos. Por lo tanto, los plásmidos utilizados previamente con el sistema adherente pueden utilizarse fácilmente en este protocolo basado en la producción en células en suspensión. El protocolo se transfirió con éxito a otros investigadores en el laboratorio y se utilizó con éxito para varias cápsidas y construcciones.

<table><tbody><tr><td>39 mL, Tubo de Polipropileno Redondo Quick-Seal, 25 x 89 mm - 50Pk</td><td>Beckman Coulter</td><td></td> Adaptador de 342414 <td></td></tr><tr><td>600 mL tubos cónicos, para rotor S-4x1000,&nbsp;</td>La placa adaptadora <td>de 5920701002</td><td></td> <td>eppendorf</td></tr><tr><td>se adapta a 16 biorreactores de 600 ml</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>587633</td><td></td></tr><tr><td>Tapones herméticos a los aerosoles, para cubos redondos de 750 mL</td> Centrífuga <td>5820747005</td><td></td><td>eppendorf</td></tr><tr><td>5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, cubos redondos y adaptador Tubos cónicos de 15 mL/50 mL Agua</td><td></td> Destilada <td>Eppendorf</td> 5948000315 <td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td></td><td></td>15230147</tr><tr><td>DNasa I recombinante, sin RNasa</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I recombinante, sin RNasa</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, calcio, magnesio</td><td>Gibco</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Unidades de filtro PES desechables 0,2</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>FB12566504</tr><tr><td>Fisherbrand Unidades de filtro PES desechables 0,45</td><td>Fisher</td><td>FB12566505</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para tubos de cultivo de 50 ml también se adapta a Falcon Tube</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>31362</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para tubo de cultivo celular de 600 ml</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>66129</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Minitron 50 mm</td><td>Infors HT</td><td>500043</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAX Medio de producción</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>A3583401</tr><tr><td>N-Tray Universal</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>31321</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep - Iodixanol</td><td>Serumwerk bernburg</td><td>1893</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Clorhidrato de polietileno lineal de grado de transfección (MW 40,000)</td><td>Poly-sciences</td><td>24765-100</td><td></td></tr><tr><td>Solución de rojo de fenol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72420100</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol) 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-VirusGEN</td><td>Mirus</td><td>Mir 6706</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripán, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>5250061</td><td></td></tr><tr><td>Biorreactores TubeSpin-50ml</td><td>TTP</td><td>87050</td><td></td></tr><tr><td>Biorreactores TubeSpin-600ml</td><td>TTP</td><td>87600</td><td></td></tr><tr><td>Células de producción viral</td><td>Gibco</td><td>A35347</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 MWCO 100 000</td><td>Cytvia</td><td>28932363</td><td></td></tr></tbody></table>

producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión hek293

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

Los vectores virales adenoasociados (AAV) son una herramienta notable para investigar el sistema nervioso central (SNC). Cápsidas innovadoras, como AAV. PHP.eB, demuestran una transducción extensa del SNC por inyección intravenosa en ratones. Para lograr una transducción comparable, se necesita un título 100 veces mayor (mínimo 1 x 1011 copias del genoma por ratón) en comparación con la inyección directa en el parénquima del SNC. En nuestro grupo, la producción de AAV, incluido el AAV. PHP.eB se basa en células HEK293T adherentes y en el método de triple transfección. Lograr altos rendimientos de AAV con células adherentes implica un proceso intensivo en mano de obra y materiales. Esta limitación impulsó el desarrollo de un protocolo para el cultivo celular en suspensión en tubos cónicos. Los AAV generados en las células adherentes se compararon con el método de producción en suspensión. Se compararon cultivos en suspensión utilizando reactivos de transfección Polietilenimina o TransIt. Los vectores AAV se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de yodixanol, seguida de intercambio de tampón y concentración mediante un filtro centrífugo. Con el método adherente, logramos un promedio de 2.6 x10 12 copias del genoma (GC) en total, mientras que el método de suspensión y la polietilenimina produjeron 7.7 x 1012 GC en total, y TransIt produjo 2.4 x 1013 GC en total. No hay diferencia en la eficiencia de transducción in vivo entre los vectores producidos con adherente en comparación con el sistema de celdas de suspensión. En resumen, se introduce un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que da como resultado una menor cantidad de tiempo y mano de obra necesaria para la producción de vectores, al tiempo que se logran rendimientos de 3 a 9 veces mayores utilizando componentes disponibles de proveedores comerciales con fines de investigación.

La mayoría de los laboratorios académicos utilizan células HEK293T adherentes para la producción de AAV 8,9. Si bien esto funciona relativamente bien cuando se necesitan pequeñas cantidades de AAV para la inyección directa, se necesita un título 100 veces más alto (mínimo 1 x 1011 GC/ratón) para lograr una transducción similar con cápsidas sistémicas como AAV. PHP.eB.
En este protocolo se estableció la producción de AAV utilizando células HEK293 en suspensión cultivadas en tubos cónicos. Los cultivos a pequeña escala se pueden realizar en tubos de 50 mL y a gran escala en tubos de 600 mL. Para agitadores específicos (ver Tabla de Materiales), se puede utilizar una gradilla en la que se pueden cultivar hasta 16 tubos grandes simultáneamente. Esta gradilla se utiliza en combinación con insertos especiales para tubos de 50 ml (Figura 2A). Este sistema ofrece una ganancia significativa de tiempo para el segmento de cultivo y transfección de este protocolo. La configuración inicial de la producción se realizó con construcciones reporteras para luciferasa y proteína verde fluorescente (GFP)10,11. Paralelamente, la construcción de GFP se produjo en 12 placas de 15cm2 como se describe en un protocolo publicado previamente12. En promedio, se logró un rendimiento total de 7,7 x 1012 GC con polietilenimina (PEI) y de 2,4 x 1013 GC con TransIt (Figura 2B). Para PEI, esto es una mejora de casi 3 veces; en el caso de TransIt, supone una mejora de 9,2 veces respecto a los títulos obtenidos con cultivo adherente (2,6 x 1012). Cuando se utiliza para transfectar células en suspensión, TransIt proporciona una mejora de aproximadamente 3 veces en el rendimiento en comparación con el PEI (Figura 2B).
Posteriormente, se probó in vivo el comportamiento de los vectores AAV. Los vectores GFP se produjeron con PEI y TransIt y se compararon con los vectores GFP producidos con el sistema adherente clásico. A las 4 semanas después de la inyección, se sacrificaron ratones (6 semanas C57BL/6 ratones hembra con un peso de 20-25 g) y se evaluó la expresión de GFP en el cerebro de los ratones mediante histología (Figura 3A). Se realizó un análisis comparativo de secciones cerebrales sagitales. No se observaron diferencias en el patrón de transducción del virus producido con estos métodos de producción (Figura 3B). También se evaluó la actividad luciferasa de los vectores producidos utilizando cualquiera de los dos métodos. La transducción se midió in vivo durante 3 semanas; el patrón de expresión a lo largo del tiempo es similar independientemente del reactivo de transfección que se utilice (Figura 4).
A continuación, el protocolo fue probado e implementado por otros miembros del equipo (Tabla 2). La producción de otras cápsidas con PEI fue exitosa, arrojando un rendimiento promedio de 3.5 x 1012 vectores GC. Para la producción de cápside B10, se puede lograr una mejora de 3 veces mediante el uso de TransIt frente a PEI. Para otro proyecto, varias construcciones empaquetadas en AAv.PHP.eB dieron un rendimiento promedio de 3,7 x 1012, que es suficiente para inyectar 7 ratones por vía intravenosa a una dosis de 5 x 1011 GC por ratón. Estos resultados ilustran que el protocolo puede ser utilizado con éxito por varios investigadores para varias cápsidas y combinaciones de constructos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig01.jpg"> Figura 1: Vista general esquemática de la producción. En el día 1 (D1), las células se cultivan en tubos de 300 ml. En el día 2 (D2), las células se transfectan con los plásmidos relevantes. En el día 5 (D5), las células se cosechan y se lisan utilizando un tampón de lisis de interpolación 10x. Después de la lisis, los restos celulares se eliminan por centrifugación. Posteriormente, el lisado celular se filtra para eliminar las proteínas grandes y el virus AAV se precipita utilizando polietilenglicol (PEG) 8000. En el día 6 (D6), se realiza la purificación y concentración de yodixanol. El concentrado de PEG del día anterior se trata con DNasa y posteriormente se somete a un gradiente de yodixanol. Posteriormente, los vectores purificados se desalinizan y concentran mediante un filtro centrífugo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig02.jpg"> Figura 2: Configuración de la incubadora y rendimientos de AAV. (A) Las células de producción viral se cultivan en una incubadora de agitación con un diámetro de agitación de 50 cm. Esta incubadora está equipada con una placa adaptadora para tubos de 600 ml e insertos especiales para tubos de 50 ml producidos por el departamento de mecatrónica. (B) Después de la configuración inicial, las construcciones reporteras utilizaron polietileno (PEI; 7,7 x 1012 GC total, n = 5) o TransIt (2,4 x 1013 GC total, n = 5) como método de transfección y se compararon con los rendimientos logrados con el método adherente clásico (2,6 x 1012 GC total, n = 5) como se describe en Verhaagen et al.12. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig03.jpg"> Figura 3: Patrón de expresión de GFP después de la evaluación in vivo . (A) Representación esquemática de una construcción típica de vector AAV que contiene el promotor ubicuo potenciador inmediato-temprano de CMV, el promotor de β-actina de pollo y el sitio aceptor de empalme de β-globina (CAG) de conejo seguido de la proteína verde fluorescente (GFP), el elemento regulador postranscripcional (WPRE) del virus de la hepatitis de la marmota (WHV) y una cola de poliadenilación (pA)13. Aquí, ratones hembra de 6 semanas de edad (n = 3) recibieron una inyección en la vena de la cola que contenía 5 x 1011 copias genómicas totales (gc) / ratón. A las 4 semanas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y los cerebros fueron analizados por histología. (B) Representación representativa del patrón de transducción en secciones sagitales, utilizando células de HEK293T adherentes y células de suspensión con polietileneimina (PEI) o reactivo de transfección TransIt, se observa un patrón de transducción similar independientemente del método de producción utilizado. Barra de escala = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig04v2.jpg"> Figura 4: Actividad similar de la luciferasa independientemente del método de transfección. (A) Representación esquemática del constructo utilizado que contiene el promotor ubicuo CMV potenciador inmediato-temprano, promotor de β-actina de pollo y sitio aceptor de empalme de β-globina (CAG) luciferasa (LUC) de conejo con una etiqueta V5 y una cola de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (BGHpA), se inyectó 5 x10 11 GC total/ratón (n = 3) a través de la vena de la cola, actividad de luciferasa en el área craneal (encerrada en un círculo rojo, en la imagen de ejemplo) como imagen bioluminiscente se midió semanalmente. (B) La actividad bioluminiscente se midió como unidades de luminiscencia relativa (RLU) representadas como una barra azul para la producción de PEI y una barra marrón para TransIt. No se observaron diferencias significativas en la actividad de la luciferasa en el área cerebral seleccionada entre los grupos. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig04largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Parámetros de transfección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/table%201_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Rendimientos del protocolo implementado. Protocolo de suspensión utilizado por otros investigadores para producir AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/table%202_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Aquí, se presenta un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que resulta en una reducción del tiempo y la mano de obra necesarios para la producción de vectores utilizando componentes que están disponibles para fines de investigación de proveedores comerciales.

Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...

Nuestro laboratorio utiliza vectores virales como plataforma para administrar genes terapéuticos al sistema nervioso lesionado. Recientemente, se han desarrollado numerosos vectores virales no invasivos que son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. El uso de estos vectores requiere títulos altos y, por lo tanto, un proceso de producción mejorado.La implementación de nuestro procedimiento de células de suspensión HEK293 hace que este protocolo AAV sea menos laborioso en comparación con otros sistemas basados en células adherentes, mientras que al mismo tiempo obtiene mayores rendimientos de vectores AV. No existen tratamientos para reparar el daño en el sistema nervioso central. Nuestro objetivo es utilizar vectores virales no invasivos para estimular la reparación del sistema nervioso central.La ventaja de este protocolo es que ahora podemos producir vectores virales con un alto rendimiento, lo que nos permite realizar una entrega terapéutica no invasiva de genes al sistema nervioso central lesionado. Nuestro trabajo actual allanará el camino para desarrollar una terapia génica no invasiva para múltiples enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis múltiple, el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer.

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Neurociencia

Recombinante virus adeno-asociado (rAAVs) vectores son cada vez más valioso...

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

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La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

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