Name: Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende a caracterizar la dinámica de microglía en el embrión de Danio rerio mediante microscopía confocal de barrido rápido. Este protocolo permite analizar en tiempo real el movimiento y la morfología celular durante el desarrollo cerebral.

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<meta charset="utf8"></head><body>Elucidando el comportamiento de la microglía en el desarrollo del tectum óptico del pez cebra

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Sci Rep. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Marın-Teva, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+the+death+of+developing+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia promote the death of developing Purkinje cells.</a> Neuron. 41 (4), 535-547 (2004).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Hattori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglia-blood+vessel+interactions+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The microglia-blood vessel interactions in the developing brain.</a> Neurosci Res. 187, 58-66 (2023).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Shin, J., Park, H. -C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25 (1), 7-14 (2003).</li>
<li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxn4+directly+regulates+tbx2b+expression+and+atrioventricular+canal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation.</a> Genes Dev. 22 (6), 734-739 (2008).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PLoS ONE. 6 (8), e22991(2011).</li>
<li>Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+time-lapse+imaging+of+transgenic+zebrafish%3A+visualizing+retinal+stem+cells+activated+by+targeted+neuronal+cell+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation.</a> J Vis Exp. (43), e2093(2010).</li>
<li>Ferrero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+microglia+derive+from+primitive+macrophages+and+are+replaced+by+cmyb-dependent+definitive+microglia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic microglia derive from primitive macrophages and are replaced by cmyb-dependent definitive microglia in zebrafish.</a> Cell Rep. 24 (1), 130-141 (2018).</li>
<li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+colonization+of+developing+zebrafish+midbrain+is+promoted+by+apoptotic+neuron+and+lysophosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia colonization of developing zebrafish midbrain is promoted by apoptotic neuron and lysophosphatidylcholine.</a> Dev Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li>
<li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Dev Neurobiol. 73 (1), 60-71 (2013).</li>
<li>Thion, M. S., Garel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+ontogeny%2C+diversity+and+neurodevelopmental+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Microglial ontogeny, diversity and neurodevelopmental functions.</a> Curr Opin Genet Dev. 65, 186-194 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Friedman, B. A., Dejanovic, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development%2C+homeostasis%2C+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development, homeostasis, and neurodegeneration.</a> Annu Rev Genet. 53, 263-288 (2019).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Rep. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Green, L. A., O'Dea, M. R., Hoover, C. A., DeSantis, D. F., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+zebrafish+brain+is+seeded+by+a+lymphatic-dependent+population+of+mrc1%2B+microglia+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic zebrafish brain is seeded by a lymphatic-dependent population of mrc1+ microglia precursors.</a> Nat. Neurosci. 25 (7), 849-864 (2022).</li>
<li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nat Neurosci. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+is+essential+for+myelination+in+the+central+nervous+system+%28CNS%29%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">C1q is essential for myelination in the central nervous system (CNS).</a> iScience. 26 (12), 108518(2023).</li>
<li>Zengeler, K. E., Lukens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+at+the+crossroads+of+healthy+brain+maturation+and+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity at the crossroads of healthy brain maturation and neurodevelopmental disorders.</a> Nat Rev Immunol. 21 (7), 454-468 (2021).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Réu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifespan+and+turnover+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lifespan and turnover of microglia in the human brain.</a> Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li>
<li>Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+developing+brain+in+living+zebrafish+using+Brainbow+and+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the developing brain in living zebrafish using Brainbow and time-lapse confocal imaging.</a> J Vis Exp. (157), e60593(2020).</li>
<li>Tayanloo-Beik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+modeling+of+autism+spectrum+disorders%2C+current+status+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Zebrafish modeling of autism spectrum disorders, current status and future prospective.</a> Front Psychiatry. 13, 911770(2022).</li>
<li>D'Amora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+innovative+tool+for+epilepsy+modeling%3A+State+of+the+art+and+potential+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an innovative tool for epilepsy modeling: State of the art and potential future directions.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7702(2023).</li>
<li>Langova, V., Vales, K., Horacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+zebrafish+and+laboratory+rodents+in+schizophrenia+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The role of zebrafish and laboratory rodents in schizophrenia research.</a> Front Psychiatry. 11, 549232(2020).</li>
<li>Chia, K., Klingseisen, A., Sieger, D., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+organism+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease.</a> Front Mol Neurosci. 15, 940484(2022).</li>
<li>Astell, K. R., Sieger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+vivo+models+of+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in vivo models of cancer and metastasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 10 (8), 037077(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 L Tanques de cría</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTE</td><td></td></tr><tr><td>1-fenil-2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Diluido a 0,2 mM en E3 para prevenir la pigmentación embrionaria</td></tr><tr><td>Placa de imagen de vidrio inferior</td><td>FluoroDish</td><td>FD3510-100</td><td></td></tr><tr><td>Desechable Pipeta de transferencia graduada</td><td>avantor</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de bloque seco</td><td>Novolab</td><td>Grant QBD4</td><td>Para mantener la agarosa de fusión baja a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoato metanosulfonato (Tricaína)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.0</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>software de análisis</td></tr><tr><td>Imaris File Converter</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>https://imaris.oxinst.com/big-data</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Puntas de microcargador Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>&nbsp; 50081</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (90 mm)</td><td>avantor</td><td>391-0559</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Pinza de acero inoxidable Dumont n.º 5</td><td>FineScienceTools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td>Para montar los embriones</td></tr><tr><td>aguja de burla</td><td>avantor</td><td>76549-024</td><td></td></tr></tbody></table>

imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Células microgliales que expresan proteína verde fluorescente (eGFP) y células endoteliales que expresan DsRed en Tg(mpeg1:eGFPgl22; kdrl:CRES898; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRedexpress,sd5) Se obtuvieron imágenes de embriones transgénicos triples14 a 3 dpf, de acuerdo con el protocolo descrito. Un solo embrión de pez cebra se montó en agarosa de bajo punto de fusión al 1% en una placa de vidrio inferior y el proceso de imagen no obstaculizó el crecimiento del embrión durante el tiempo de adquisición. El lapso de tiempo se registró utilizando un sistema comercial de microscopía confocal de barrido puntual equipado con una lente de objetivo seco de 10x 0,45 NA, y se utilizaron láseres de excitación de 488 nm y 561 nm para obtener imágenes de la microglía y las células endoteliales, respectivamente. Además, el intervalo de tiempo, la resolución de la imagen, el tamaño de píxel y el paso z fueron de 30 segundos (s), 1024x1024, 0,49 μm y 2,5 μm, respectivamente. La grabación de timelapse duró 3,5 horas (h).
El campo de visión adquirido abarcó toda la cabeza del embrión, pero el análisis se centró específicamente en el tectum óptico, ya que durante la primera semana de desarrollo, la microglía se restringe principalmente a la capa de soma neuronal de esta región del mesencéfalo dorsal, lo que permite a los investigadores visualizar a toda la población simultáneamente15. El análisis de seguimiento 3D se realizó utilizando Imaris 10.0, como se explicó anteriormente. Como se muestra en la Figura 4, el seguimiento fue exitoso, lo que resultó en 25 pistas, coincidiendo con el número esperado de células de microglía presentes en el tectum óptico a 3 dpf16. Se requirió una corrección manual mínima de las pistas. En la figura 5 se muestra un ejemplo de los datos que se pueden extraer de un experimento de seguimiento exitoso. El marcaje simultáneo de macrófagos y células endoteliales permite cuantificar la posición de la microglía en relación con esta última, lo que permite a los investigadores visualizar la distancia relativa de cada célula a la célula endotelial más cercana en el tiempo y examinar la frecuencia y el número de interacciones potenciales (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig01.jpg"> Figura 1: Resumen del procedimiento experimental. (A) Preparación y anestesia del embrión de pez cebra. (B) Montaje y posicionamiento de muestras. (C) Adquisición de imágenes. (D) Procesamiento de imágenes y extracción de datos de motilidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes de la microglía e interacciones con el entorno celular del cerebro en el embrión de pez cebra. (A) Imagen de campo claro de la cabeza y el cerebro de un pez cebra embrionario de 3 dpf (vista dorsal), marcando el tectum óptico y el cerebro posterior. El cerebro del pez cebra embrionario se puede fotografiar en su totalidad en esta etapa debido a su pequeño tamaño y transparencia óptica. (B-D) La ubicación y el comportamiento de la microglía se pueden visualizar mediante el uso de líneas transgénicas como (B,C) Tg(mpeg1:eGFP)gl22 y (D) Tg(mpeg1:mcherry)gl23, y centrándose en el OT. (B) Las neuronas y sus cuerpos celulares se pueden identificar utilizando la línea reportera Tg(XlTubb:D sRed)zf148 y las interacciones microglía-neurona se pueden visualizar fusionando los dos canales en líneas que co-expresan ambos transgenes. Se ve una fusión de las señales verde (microglía) y roja (neuronas, en magenta). (C,D) Las líneas reporteras también pueden arrojar luz sobre las interacciones de la microglía (en verde) con las células endoteliales, aquí marcadas en rojo usando el (C) doble Tg(kdrl:cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, sd5) transgénicos, o con células gliales como los oligodendrocitos y sus precursores, utilizando el (D) doble Tg(olig2:EGFP; mpeg1:mcherry ) línea transgénica. 1: oligodendrocitos y células progenitoras en el OT, 2: neuronas eurydendroides en el cerebelo. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: dpf = días después de la fecundación; OT = tectum óptico; HB = cerebro posterior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig03.jpg"> Figura 3: Disparidad morfológica y espacial entre los macrófagos de la piel y la microglía en un embrión de pez cebra de 3 dpf. (A,B) Vista dorsal de un embrión de pez cebra Tg(mpeg1:eGFP)gl22 a 3 dpf, que representa (A) células de microglía parenquimatosas (marcadas con asteriscos magenta) frente a macrófagos de la piel (asteriscos blancos), identificados en función de su posición relativa a lo largo del eje z, como se ve en (B), que muestra la imagen 3D monocromática renderizada con codificación de colores del eje z. (C,D) Vista lateral de (C) A y (D) B, que muestra las profundidades z de las células mpeg1:eGFP+ dentro de la cabeza del embrión y destaca la localización superficial de los macrófagos de la piel en comparación con las células microgliales. (E-K) Gran aumento de cada célula indicado por un asterisco en A y B, proporcionando una visualización detallada de las distintas morfologías entre la microglía ameboide (E-G) y los macrófagos alargados de la piel (H-K). Barras de escala= 30 μm. Abreviatura: dpf = días después de la fecundación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig04.jpg"> Figura 4: Seguimiento de células microgliales en un embrión de pez cebra de 3 dpf. (A) Vista dorsal de la cabeza de un Tg de 3 dpf(kdrl:cres898; actb2: LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, sd5; mpeg1:eGFPgl22) embrión transgénico triple, que muestra microglía (verde) y la representación superficial de los vasos (magenta). (B-D) Seguimiento representativo de los movimientos de la microglía durante una ventana de tiempo de (B) 3,5 h. Se observa que las células individuales siguen trayectorias complejas. (C) Detalle de timelapse, que muestra una vista ampliada de la región en B encerrada por el cuadrado discontinuo. Se presentan seis fotogramas de la película (con 45 minutos de diferencia), que documentan el establecimiento de contactos transitorios de la microglía con las células endoteliales en su microambiente. (D) Trayectorias de migración de células microgliales individuales dentro del tectum óptico, con los ejes X, Y y Z que representan dimensiones espaciales. Barra de escala = 50 μm. Abreviatura: dpf = días después de la fecundación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig05.jpg"> Figura 5: Visualización de los datos obtenidos. Ejemplo de los datos espaciales que se pueden obtener utilizando el protocolo descrito. Los gráficos muestran (A) la velocidad promedio de las células microgliales, (B) la distancia promedio que cubren en 1 h, (C) su desplazamiento cuadrático medio y (D) su distribución en el espacio en diferentes momentos. La representación de la superficie del vaso también permitió la medición de la distancia más corta entre la microglía y las células endoteliales en un momento dado, tanto a nivel de una sola célula (E) como como promedio global (F). Para A, B y D, cada punto representa una celda individual. N = un embrión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533_20240306_SupplementalFile1%20(2).zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Fuente: Niu, L., et al. Visualización de la muerte celular lítica de macrófagos durante la infección por micobacterias en embriones de pez cebra mediante microscopía intravital. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra el uso de microscopía confocal intravital para visualizar la muerte lítica de los macrófagos en embriones de pez cebra tras una infección por Mycobacterium marinum .

Imágenes en vivo de la muerte celular de los macrófagos durante la infección por micobacterias en embriones de pez cebra

Este video muestra un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización Notch/DeltaD en los progenitores de la glía radial del pez cebra. Consiste en montar embriones de pez cebra decorionados incrustados en agarosa, inyectar una solución de colorante dirigida a los ligandos DeltaD en los RGP y obtener imágenes bajo un microscopio de fluorescencia para la división celular asimétrica que confirme la activación de la señalización Notch/DeltaD.

Un ensayo de captación de anticuerpos para la obtención de imágenes de la señalización Notch/DeltaD en los progenitores de la glía radial del pez cebra

Fuente: Lahne, M., et.al. Cultivo de explantes de retina de pez cebra transgénico adulto para obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía multifotónica. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller en explantes de retina de pez cebra incrustados en agarosa después del daño de los fotorreceptores inducido por la luz. El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) liberado por los fotorreceptores dañados activa las células...

Imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller durante la regeneración de la retina del pez cebra

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Informamos una técnica que permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma (GBM) que invaden el tejido cerebral de un vertebrado. El acoplamiento de la inyección ortotópica de células GBM marcadas con fluorescencia en un cerebro transparente de pez cebra con imágenes intravitales de alta resolución permite la medición de la dinámica del citoesqueleto durante la invasión del cáncer in situ .

Imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma que invaden el cerebro del pez cebra

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes in vivo de todo el cerebro de larvas de pez cebra utilizando microscopía de fluorescencia tridimensional. El procedimiento experimental incluye la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y la visualización.

In vivo Imágenes de todo el cerebro de larvas de pez cebra usando microscopía de fluorescencia tridimensional

Aprende a caracterizar la dinámica de microglía en el embrión de Danio rerio mediante microscopía confocal de barrido rápido. Este protocolo permite analizar en tiempo real el movimiento y la morfología celular durante el desarrollo cerebral.

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

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