Name: Hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: Aprende el método OPTIR-FISH para identificar células individuales y analizar su metabolismo a nivel de célula única en entornos complejos. Esta técnica combina imagen infrarroja fototérmica con hibridación in situ de fluorescencia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo completo para la identificación celular y el análisis metabólico mediante OPTIR-FISH

<ol><li>Evers, T. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+metabolic+heterogeneity+by+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis.</a> Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).</li>
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<li>Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+metabolic+activities+in+single+cells%2C+with+emphasis+on+nanoSIMS%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS.</a> FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).</li>
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<li>Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal-fluorescence+in+situ+hybridization+for+functional+analysis+and+genetic+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells.</a> Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+oligodeoxynucleotide+probes+for+the+major+subclasses+of+proteobacteria%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22System+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions.</a> System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).</li>
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<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsecond+fingerprint+stimulated+Raman+spectroscopic+imaging+by+ultrafast+tuning+and+spatial-spectral+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning.</a> Nat Commun. 12 (1), 3052(2021).</li>
<li>Fu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+non-fluorescent+molecules+by+photothermal+relaxation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy.</a> Nat Photon. 17, 330-337 (2023).</li>
<li>Tamamitsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+widefield+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared widefield nanoscopy.</a> arXiv. , (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>96% Etanol</td><td>ThermoScientific</td><td>T032021000</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de calcio</td><td>Crystran</td><td>CAFP10-0.35</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-Gluocosa (U-13C6, 99%)</td><td>Cambridge Isotopic Laboratories</td><td>CLM-1396-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>formamida</td><td>ThermoScientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria-Bertani&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Sales mínimas 5x</td><td>SIGMA</td><td>M6030-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OPTIR instrumento</td><td>Espectroscopia fototérmica Corp.</td>Solución de paraforaldehído <td>mIRage</td><td></td>LS</tr><tr><td>, 4% en solución de</td> poli-L-lisina PBS <td>ThermoScientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>al 0,1% (p/v)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-25G</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano, 99+%</td><td>ThermoScientific</td><td>A11379.18</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja trípico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (optir-fish)

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

El flujo de trabajo general para el análisis metabólico microbiano unicelular con identificación genética mediante OPTIR-FISH se resume en Figura 2. Los resultados representativos que demuestran la capacidad de imagen metabólica unicelular de OPTIR se muestran en Figura 3. En este ejemplo se utilizaron células de E. coli incubadas con 12C- o bien 13C-glucosa durante 24 h. La incorporación de 13Se ha demostrado que el C en proteínas causa un desplazamiento al rojo significativo de las amidas de proteínas I y II (Figura 3A)17,18. Por lo tanto, estos dos números de onda clave que representan el 12Proteína C (1656 cm-1, banda normal de amida I) y 13Proteína C (1612 cm-1, banda I de amida desplazada) y se adquirieron imágenes OPTIR en estos dos números de onda. También se muestran las imágenes de campo claro correspondientes para demostrar la morfología de las células (Figura 3B,E). Las bacterias en forma de bastoncillos pueden resolverse claramente a nivel de una sola célula tanto en imágenes de campo claro como en imágenes OPTIR, lo que confirma la alta resolución espacial de la técnica OPTIR (Figura 3B-G). En el caso de las células incubadas con 12C-glucosa (Figura 3B-D), una intensidad mayor a 1656 cm-1 mientras que una mayor 1612 cm-1 se observó intensidad en las células incubadas con 13C-glucosa (Figura 3E-G). Este cambio máximo indica la incorporación de isótopos de carbono más pesados en la masa proteica17. La evaluación se amplió para evaluar la capacidad de OPTIR-FISH para discriminar taxones bacterianos y sus actividades metabólicas en muestras de múltiples especies. Mezclamos artificialmente dos especies bacterianas que prevalecen en el microbioma intestinal humano: E. coli y B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli células incubadas con 13La C-glucosa se hibridó con una sonda Gam42a-Cy5, dirigida al ARNr 23S de las Gammaproteobacterias10. B. theta células incubadas con 12La C-glucosa se hibridó con la sonda Bac303-Cy3, dirigiéndose al ARNr 16S de la mayoría de las especies de Bacteroidaceae11. Es muy difícil diferenciar las dos especies basándose en las imágenes de campo claro, ya que ambas tienen forma de bastón (Figura 4A). Por lo tanto, las imágenes de fluorescencia multicolor de sondas hibridadas fueron esenciales para asignar una identidad taxonómica a cada célula bacteriana analizada (Figura 4B). Al restar las imágenes OPTIR adquiridas a 1612 cm-1 de la de 1656 cm-1, observamos que un segmento de células en esta muestra de biespecie mostró valores de resta positivos (Figura 4C), lo que indica la incorporación de 13Isótopos de C. En función de las condiciones de cultivo, asignamos las celdas con valor de sustracción positivo para que sean E. coli, y el valor de resta negativo debe ser B. theta. La asignación de especies bacterianas se confirma mediante los resultados de las imágenes de fluorescencia: las células que producen valores de sustracción positivos producen contraste Cy5, que es específico de E. coli, y las celdas que producen valores de resta negativos producen B. theta-Contrastes específicos de Cy3. A continuación, se calculó la relación de reemplazo isotópico, en este caso, recién sintetizada 13Proteína C de 13C-glucosa (Figura 4D). Como era de esperar, se observó una diferencia significativa en la relación de reemplazo isotópico entre las dos especies bacterianas (prueba t por pares, p = 9,74 x 10-33) se observó. Este conjunto de datos subraya la viabilidad de aplicar la plataforma OPTIR-FISH para estudiar el metabolismo en un entorno complejo donde están presentes múltiples especies de muestras.
<img alt="Análisis microbiano; hibridación de fluorescencia, marcaje de isótopos, imágenes OPTIR, fenotipo genotipo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Esquema de la plataforma OPTIR-FISH para la identificación simultánea de especies y el análisis del metabolismo. Diferentes miembros de la comunidad microbiana pudieron ser identificados por la unión específica de las sondas de ARN ribosómico microbiano a través de la hibridación fluorescente in situ y detectados por imágenes de fluorescencia de los fluoróforos unidos. La actividad metabólica pudo analizarse mediante cultivo con sustratos isotópicos y detectarse mediante imágenes OPTIR. Las imágenes OPTIR detectan el cambio de dispersión inducido por la absorción de IR, y OPTIR es inherentemente compatible con herramientas fluorescentes ampliamente utilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama del proceso de etiquetado de isótopos: FISH microbiano, análisis OPTIR, determinación de identidad, proporciones." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Flujo de trabajo general para el análisis de la actividad metabólica de una sola célula con identificación genética por OPTIR-FISH. (A) Las células bacterianas se cultivaron con sustratos marcados isotópicamente. (B) A continuación, se realizó la hibridación fluorescente in situ (FISH). (C) Preparación de la muestra en portaobjetos transparente IR. (D) Las imágenes de campo claro identifican las regiones con una densidad celular óptima. (E, H) Las imágenes de fluorescencia multicolor de diferentes fluoróforos FISH revelan la identidad genética de las células individuales según lo especificado por las sondas FISH o sigue siendo desconocida. (F,G) Las imágenes multiespectrales posteriores de OPTIR en el pico normal y desplazado revelan la incorporación isotópica a la biomasa microbiana. Tomando como referencia los espectros OPTIR para muestras no marcadas y completamente marcadas (coeficiente h), se pudo cuantificar la contribución relativa de los componentes biológicos regulares (cr) e isotópicos (ci). La síntesis de proteínas a partir de sustratos metabolizados marcados isotópicamente se cuantificó utilizando la "relación de reemplazo isotópico". (I) Mediante OPTIR-FISH, se puede obtener un análisis de alto rendimiento de la actividad metabólica de las especies microbianas en una población compleja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Espectroscopia de E. coli utilizando 12C/13C-glucosa; espectros OPTRIR; imágenes de campo claro y OPTIR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Espectros representativos de OPTIR y resultados de imagen. (A) Espectros de OPTIR para células de E. coli cultivadas con 12C-glucosa (cian) y 13C-glucosa (naranja) que cubren la región de amida I y amida II. Se observa un pico claro de amida I desplazado al rojo (1656 cm-1 a 1612 cm-1) para 13células cultivadas con C-glucosa. Imágenes representativas de campo claro y OPTIR de células de E. coli en la banda normal de amida I y amida I desplazada en condiciones de cultivo de (B-D) 12C-glucosa y (E-G) 13C-glucosa. Barras de escala: 10 μm. Esta figura fue modificada con permiso de Bai et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imágenes de microscopía de campo claro y FISH con resta OPTIR, E. coli y tabla de cuantificación de B. theta." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Imágenes representativas y resultados de cuantificación de mezclas bacterianas. Las células de E. coli se incubaron con 13C-glucosa, seguidas de hibridación con la sonda de oligonucleótidos Gam42a-Cy5. Las células B. theta se incubaron con 12C-glucosa, seguidas de hibridación con la sonda de oligonucleótidos Bac303-Cy3. (A) La imagen de campo claro muestra la morfología de la mezcla de células. (B) La imagen de fluorescencia a dos colores muestra la distribución de E. coli (rojo) y B. theta (verde). (C) El resultado de la sustracción de OPTIR (1612 cm-1-1656 cm-1) muestra el metabolismo proteico de las células bacterianas. (D) Cuantificación de la tasa de reemplazo isotópico que representa la proteína 13C recién sintetizada a partir de la glucosa 13C. (Prueba t por pares: p = 9,74 x 10-33). Barras de escala: 10 μm. Esta figura fue modificada con permiso de Bai et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

optical-photothermal-infrared-fluorescence-situ-hybridization-optir

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Aquí se describe un fluorescente de todo el...

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Se describe aquí un fluorescencia simple en la hibridación in situ (FISH) método para la localización de virus y bacterias en los tejidos de insectos y plantas. Este protocolo se puede ampliar para la visualización de mRNA en todo el montaje y secciones microscópicas.

Fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; Las hibridaciones (FISH) para la localización de los virus y las bacterias endosimbióticas en plantas e insectos tejidos

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

Este manuscrito presenta un detallado método para la generación X-cromosoma brazo sondas y rendimiento en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para examinar el estado de la hermana cohesión de cromátidas hermanas en Prometafase y metafase detenido  Drosophila ovocitos. Este protocolo es adecuado para determinar si cohesión brazo meiótica es intacta o interrumpida en diferentes genotipos.

Con fluorescencia In Situ hibridación (pescado) para supervisar el estado de la cohesión de brazo en Prometafase y metafase I ovocitos de Drosophila

Las tecnologías de edición de genes han permitido a los investigadores generar mutantes de peces cebra para investigar la función génica con relativa facilidad. Aquí, proporcionamos una guía para realizar el genotipado de embriones paralelos y la cuantificación de señales de hibridación in situ en peces cebra. Este enfoque imparcial proporciona una mayor precisión en los análisis fenotípicos basados en la hibridación in situ.

Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Resolución óptica de microscopía fotoacústica (O-PAM) es una tecnología emergente capaz de absorción de imágenes ópticas...

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Aprende el método OPTIR-FISH para identificar células individuales y analizar su metabolismo a nivel de célula única en entornos complejos. Esta técnica combina imagen infrarroja fototérmica con hibridación in situ de fluorescencia.

Hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH)

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