Name: Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a ensamblar nucleosomas in situ para microscopía de fuerza y fluorescencia de una sola molécula. Este protocolo reduce el uso de reactivos y el tiempo de preparación en biología de cromatina.

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<meta charset="utf8"></head><body>Reconstitución de nucleosomas in situ para estudios de moléculas individuales

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+A+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+dynamics+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and dynamics are coming of age.</a> Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nucleosome+recognition+by+chromatin+factors+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes.</a> Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).</li>
<li>Fierz, B., Poirier, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biophysics of chromatin dynamics.</a> Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-molecule+techniques%3A+A+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: A laboratory manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Chua, G. N. L., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+force+met+fluorescence%3A+Single-molecule+manipulation+and+visualization+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions.</a> Annu Rev Biophys. , (2024).</li>
<li>Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+biological+single-molecule+applications+of+optical+tweezers+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy.</a> Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Opt Lett. 11, 288(1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+nucleosome+assembly+onto+oligomers+of+the+sea+urchin+5+S+DNA+positioning+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence.</a> J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).</li>
<li>Salt Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gradient+dialysis+reconstitution+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">gradient dialysis reconstitution of nucleosomes.</a> CSH Protoc. 2008, 5113(2008).</li>
<li>Leicher, R., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+interaction+between+chromatin+and+chromatin-associated+complexes+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers.</a> Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442, 772-778 (2006).</li>
<li>Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+positions+predicted+through+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleosome positions predicted through comparative genomics.</a> Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).</li>
<li>Chipev, C. C., Wolffe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+organization+of+Xenopus+laevis+oocyte+and+somatic+5S+rRNA+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo.</a> Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181, 1380-1394 (2020).</li>
<li>Vlijm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+assembly+and+handedness+dynamics+of+%28H3.3-H4%292+tetrasomes+to+canonical+tetrasomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes.</a> PLoS One. 10, e0141267(2015).</li>
<li>Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+nucleosome+assembly+by+histone+chaperone+NAP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1.</a> J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).</li>
<li>Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+chromatin+assembly+on+supercoiled+plasmid+DNA+by+nucleosome+assembly+protein-1+and+ATP-utilizing+chromatin+assembly+and+remodeling+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor.</a> J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).</li>
<li>Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+chaperone+Nap1+promotes+nucleosome+assembly+by+eliminating+nonnucleosomal+histone+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions.</a> Mol Cell. 37, 834-842 (2010).</li>
<li>Wu, R., Taylor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+analysis+of+DNA.+II.+Complete+nucleotide+sequence+of+the+cohesive+ends+of+bacteriophage+lambda+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA.</a> J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).</li>
<li>King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+structural+plasticity+of+stretched+DNA+under+torsional+constraint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint.</a> Nat Commun. 7, 11810(2016).</li>
<li>Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsionally+constrained+DNA+for+single-molecule+assays%3A+An+efficient%2C+ligation-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method.</a> Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).</li>
<li>Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+in+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers in single-molecule biophysics.</a> Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).</li>
<li>Diaz-Celis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+structural+transitions+during+mechanical+unwrapping+of+nucleosomes+and+their+disassembly+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+in+silico+dissection+of+the+interaction+between+Polycomb+repressive+complex+2+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).</li>
<li>Chua, G. N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+specify+MeCP2+function+at+methylated+DNA+and+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Brower-Toland, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+disruption+of+individual+nucleosomes+reveals+a+reversible+multistage+release+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).</li>
<li>McCauley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+FACT+subunits+coordinate+to+catalyze+both+disassembly+and+reassembly+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes.</a> Cell Rep. 41, 111858(2022).</li>
<li>Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+force+on+mononucleosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Effect of force on mononucleosomal dynamics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-directed+replication+origin+licensing+independent+of+a+consensus+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence.</a> Nat Commun. 13, 4947(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+recognition+complex+harbors+an+intrinsic+nucleosome+remodeling+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).</li>
<li>Harada, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+nucleosome+translocation+by+RSC+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes.</a> Elife. 5, e10051(2016).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).</li>
<li>Rogge, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nucleosomal+arrays+from+recombinant+core+histones+and+nucleosome+positioning+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA.</a> J Vis Exp. (79), e50354(2013).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+nucleic+acid+binding+and+coacervation+by+linker+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1.</a> Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x Tampón HR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>30 mM&nbsp; tris&nbsp; acetato pH 7,5, 20 mM acetato de magnesio, 50 mM cloruro de potasio, 0,1 mg/mL BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>1x PBS (solución salina tamponada con fosfato)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>137 mM cloruro de sodio, 2,7 mM cloruro de potasio, 10 mM fosfato de sodio dibásico, 1,8 mM fosfato de potasio monobásico&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0074-6</td><td>Úselo para hacer acetato de tris</td></tr><tr><td>Biotina-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-BIOX-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-dATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-835-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-dCTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-956-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Disolver en H2O y se ejecuta a través de un filtro de mmm de 0,22</td></tr><tr><td>Cy3 Maleimida Colorante mono-reactivo</td><td>Cytiva</td><td>PA23031</td><td>Maleimida funcionalizado Fluoróforo</td></tr><tr><td>Cy3 dGTP</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5425 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-414-051</td><td>Centrífuga de sobremesa con</td></tr><tr><td>alcohol etílico</td> refrigerante, <td>Millipore Sigma</td> puro <td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9884</td><td>Se disuelve en H2O a 0,5 M</td></tr><tr><td>Octámero de histonas humanas (H4, L50C; H2A, K119C)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A Las</td><td>proteínas histonas recombinantes y las que albergan mutaciones de marcaje se purificaron internamente como se describió anteriormente (ver refs. 33, 34, 35, 36). Brevemente, las histonas recombinantes se expresaron en células BL21 (De3) pLySS (Promega). Los cuerpos de inclusión se aislaron después de la sonicación y las histonas se extrajeron en condiciones de desnaturalización. Las histonas se dializaron en tampón A (7 M de urea, 10 mM de clorhidrato de tris pH 8.0, 100 mM de cloruro de sodio, 1 mM de EDTA y 5 mM de 2-mercaptoetanol), y la solución se agregó a una columna de gravedad cargada con Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). A continuación, el flujo se añadió a una columna de gravedad cargada con SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), y las histonas se eluyeron de la columna añadiendo tampón A suplementado con cloruro de sodio de 600 mM. Las histonas que albergan mutaciones de marcaje (H4, L50C; H2A, K119C) se purificaron y luego se conjugaron con el fluoróforo deseado a través de colorantes funcionalizados con maleimida (Cytiva, Lumidyne) utilizando una relación molar de colorante a proteína de 20:1 (ver refs. 33, 34). Los octámeros de histonas se ensamblaron agregando una proporción molar igual de cada histona de tipo salvaje o marcada con fluoróforos en condiciones de desnaturalización, se dializaron en un tampón con alto contenido de sal que contenía cloruro de sodio 2 M y luego se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño como se describió anteriormente (ver refs. 36, 37). Alternativamente, las proteínas de histonas individuales y los octámeros de histonas listos para usar se pueden comprar comercialmente (por ejemplo, Epicypher).&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón de imagen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>20 mM clorhidrato de tris pH 8.0, cloruro de sodio de 100</td></tr><tr><td>mM Fragmento de Klenow (3' a 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA (dam-, dcm-)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SD0021</td><td>Libre de metilación y lambda; ADN</td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne Technologies</td><td>9</td><td>Maleimida funcionalizada Fluoróforo LD655</td></tr><tr><td>Enlazador histona H1.4 (A4C)</td><td>N/A</td><td>N/A Proteína</td><td>recombinante purificada de fabricación propia (ver ref. 38)</td></tr><tr><td>LUMICKS C-Trap Dymo</td><td>LUMICKS</td><td>N/A</td><td>Configuración de doble trampa; materiales estándar para el instrumento proporcionados por el fabricante</td></tr><tr><td>Solución de acetato de magnesio</td><td>Millipore Sigma</td><td>63052-100ML</td><td>Úselo para hacer tampón HR</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Incluido con el kit de fragmentos Klenow</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Disolver en H2O y pasar a través de un filtro de 0,22 mmm</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>Úselo para hacer PBS y tampón HR</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0662</td><td>Uso para hacer PBS</td></tr><<tr><td>em>S. cerevisiae Nap1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Nap1 se purificó internamente como se describió anteriormente (ver refs. 33, 34). Alternativamente, Nap1 se puede comprar comercialmente (por ejemplo, Active Motif).</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>241245</td><td>Disolver en H2O a 3 M</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>Úselo para hacer PBS y tampón de imagen</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9763</td><td>Úselo para hacer</td></tr><tr><td>partículas recubiertas de biotina PBS SPHERO (3.0-3.4 y micro; m)</td> <td>Spherotech</td><td>TP-30-5</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Espectrofotómetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>NanoDrop Tris</td></tr><tr><td>Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Disolver en H2O y ajustar al pH apropiado; úselo para hacer tampón de imagen y acetato de tris</td></tr></tbody></table>

ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Usando la configuración descrita en el paso 3 (Figura 1A), la formación de nucleosomas a lo largo de la atadura de ADN se visualizó como la aparición de focos fluorescentes rojos en un escaneo 2D (Figuras 1B, izquierda) o trayectorias a lo largo del tiempo en un quimógrafo (Figura 1B, derecha). Los nucleosomas correctamente envueltos produjeron trayectorias de fluorescencia que permanecieron estacionarias en el tiempo dentro del límite de difracción de la detección confocal (~300 nm). En particular, los múltiples nucleosomas formados cerca unos de otros por debajo del límite de difracción no pueden resolverse espacialmente y aparecen como focos o trayectorias más brillantes. Sin embargo, se analizaron los pasos de fotoblanqueo de las trayectorias nucleosómicas individuales y con frecuencia mostraron eventos de fotoblanqueo de 1 paso (Figura 1C) o 2 pasos (Figura 1D), lo que indica que los focos contenían principalmente mononucleosomas dada la tasa de marcaje de aproximadamente el 70% de la proteína H4 en esta muestra. Además, sobre la base del recuento promedio de fotones para un solo fluoróforo LD655 en esta condición experimental, se estimó el número de copias de H4 marcadas en cada trayectoria de nucleosoma y se mostró que los loci de nucleosomas predominantemente (&gt;75%) contenían 1 o 2 copias de H2A marcadas (Figura 1E), nuevamente consistente con la noción de que estaban cargados principalmente como mononucleosomas separados espacialmente. Los otros focos más brillantes contenían más de 3 copias de H4 marcado, probablemente representando múltiples nucleosomas dentro del límite de difracción.
La formación de nucleosomas también se monitoreó mediante un aumento en la tensión a lo largo de la correa cuando las posiciones de los OT permanecieron constantes a medida que más ADN se envolvía alrededor de los octámeros de histonas (Figura 1B, abajo). En ausencia de Nap1, los octámeros de histonas aún pueden unirse al ADN, pero permanecen en su mayoría sin envolver, ya que la tensión asociada cuando se mantuvieron las posiciones de OT permaneció constante (Figura 1F). Es posible que la unión no específica de los octámeros de histonas al ADN ocurra incluso en presencia de Nap1. En otro experimento, se realizó el mismo protocolo para formar nucleosomas que contienen H2A marcado con Cy3, que arrojó resultados similares a los realizados con H4 marcado con LD655 (Figura 1G), lo que indica el ensamblaje de octámeros intactos en nucleosomas.
Usando la configuración descrita en el paso 4 (Figura 2A), el desenvolvimiento de nucleosomas se visualizó a lo largo del tiempo en un quimógrafo a medida que aumentaba la distancia de amarre (Figura 2B). Se informó previamente que los octámeros de histonas a menudo permanecen unidos al ADN después de ser desenvueltos30,31 y, por lo tanto, las trayectorias fluorescentes a menudo persisten incluso a altas tensiones. También se monitorizó el desenvolvimiento de nucleosomas en la curva FD asociada (Figura 2C). Las características cuantificables de la curva FD incluyen la fuerza a la que los nucleosomas se desenvuelven (ver "Transición F" en el recuadro de la Figura 2C), así como la longitud del ADN que se liberó del octámero de histonas (ver "ΔL" en el recuadro de la Figura 2C), que existe en múltiplos de ~24 nm, consistente con el desenvolvimiento independiente de las vueltas internas del ADN de los nucleosomas individuales27, Artículo 30. Estos parámetros se pueden utilizar para estimar el número de nucleosomas formados en cada atadura o para un análisis posterior adicional de la mecánica de los nucleosomas. Como tal, el número de rupturas de giro interno obtenidas de experimentos de tracción mecánica se comparó con el número estimado de copias de H4 marcadas en cada trayectoria de nucleosoma en función de la intensidad del monómero, lo que mostró que los números son en gran medida consistentes (ejemplos mostrados en las Figuras 2D-G). Sin embargo, se observó que no coinciden perfectamente debido a la eficiencia marcada de ~ 70% de la proteína H4 en la muestra y cualquier histona residual independiente de Nap1 que se une al ADN, como se muestra en la Figura 1F. Finalmente, como se esperaba, el estiramiento de las ataduras de ADN desnudo unidas a Nap1 (sin histonas) no genera transiciones inducidas por la fuerza (Figura 2H), lo que indica que Nap1 por sí sola no distorsiona significativamente el ADN.
Empleando la configuración descrita en el paso 5 (Figura 3A), la unión de la histona enlazadora H1 a la cromatina se visualizó como la aparición de focos fluorescentes verdes a lo largo de la atadura de la cromatina (Figura 3B). En particular, los nucleosomas unidos a H1 generaron trayectorias de doble color (véanse las flechas blancas en la Figura 3B) que parecían estacionarias a lo largo del tiempo. Además, se observaron trayectorias difusas de H1 a través de regiones de ADN libres de nucleosomas (ver estrellas verdes en la Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig01.jpg"> Figura 1: Formación de nucleosomas in situ mediada por Nap1. (A) Esquema de la configuración experimental descrita en el protocolo de formación de nucleosomas in situ mediado por Nap1 (paso 3). Un par de perlas quedaron atrapadas ópticamente en el canal 1, y una sola molécula de ADN λ se ató entre las perlas a través de un enlace biotina-estreptavidina en el capítulo 2. A continuación, el cable se trasladó al canal 4, que contenía octámeros de histonas marcados con LD655 (rojo) y Nap1 para la formación en tiempo real de nucleosomas en todo el ADN. (B) Escaneo 2D representativo (izquierda) y cimógrafo (derecha) de un anillo de ADN que contiene nucleosoma marcado con LD655-H4. La lectura de fuerza asociada (abajo) muestra un aumento en la fuerza inmediatamente a medida que la correa se mueve al canal 4 cuando las posiciones de OT se mantienen constantes, lo que indica envoltura de nucleosomas. Las trayectorias más brillantes significan múltiples nucleosomas adyacentes ubicados dentro del límite de difracción de ~300 nm. (C) Ejemplo de quimógrafo que muestra un evento de fotoblanqueo de 1 paso (flecha blanca) de un nucleosoma que contiene LD655-H4. (D) Ejemplo de quimógrafo que muestra un evento de fotoblanqueo de 2 pasos (flechas blancas) de un nucleosoma que contiene LD655-H4. (E) Frecuencia relativa del número de H4 marcados con DL655 por trayectoria estimada a partir de su intensidad de fluorescencia. (F) Quimógrafo representativo de una correa unida con octámeros de histonas en ausencia de Nap1. La lectura de fuerza asociada (abajo) permanece sin cambios incluso cuando los octámeros de histonas se unen al ADN. (G) Quimógrafo representativo de una correa de ADN que contiene nucleosoma marcada con Cy3-H2A. La lectura de fuerza asociada (abajo) muestra un aumento de fuerza inmediatamente a medida que la correa se mueve al canal 4 (que contiene octámeros y Nap1), ya que se forman nucleosomas cuando las posiciones de OT se mantienen constantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig02.jpg"> Figura 2: Ensayo de desenvoltura de nucleosomas. (A) Esquema de la configuración experimental descrita en el protocolo de desenvoltura de nucleosomas (paso 4). El lazo de ADN que contiene nucleosomas se movió al canal 3 que contiene un tampón de imagen libre de proteínas, donde se aumentó la distancia entre cuentas y se desenvolvieron los nucleosomas. (B) Quimógrafo representativo de un lazo de ADN que contiene nucleosoma tirado a altas fuerzas al aumentar gradualmente la distancia entre cuentas. La disminución de la intensidad de la fluorescencia hacia la cuenta inferior probablemente se debió a que el ADN se inclinó ligeramente fuera del enfoque de escaneo de línea. (C) La curva FD asociada que muestra transiciones inducidas por la fuerza del desenvolvimiento del giro interior que ocurren entre 8-37 pN. El recuadro muestra una vista ampliada de un ejemplo de transición para el que se puede registrar y analizar más a fondo la distancia no envuelta (ΔL = ~24 nm para el giro interno del ADN de los nucleosomas individuales) y la fuerza de transición (Transición F). Para esta correa, se desenvolvieron 26 nucleosomas y la atadura se rompió a ~ 65 pN, como lo denota la línea punteada blanca en el quimógrafo. (D,E) Ejemplo de amarre que contiene nucleosomas LD655-H4 tirado a fuerzas altas donde el número de H4 por trayectoria se estima a través de la intensidad de fluorescencia (indicada en el cimograma, D) y el número de nucleosomas envueltos se estima a través del tamaño del cambio de distancia inducido por la fuerza (indicado en la curva de fuerza-distancia asociada, E). (F,G) Otro ejemplo como en (D,E). (H) Las ataduras de ADN (n = 5) se atraen a altas fuerzas después de ser incubadas en un canal que contiene Nap1 solamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig03.jpg"> Figura 3: Visualización de la interacción proteína-cromatina. (A) Esquema de la configuración experimental descrita en el protocolo de visualización de la unión de proteínas a la cromatina (paso 5). El lazo de ADN que contiene nucleosomas se movió al canal 5, que contiene 10 nM de histona enlazadora H1 marcada con Cy3 (verde). (B) Quimógrafo representativo de dos colores de la unión de H1 a una atadura de ADN que contiene nucleosomas. Los eventos de colocalización de nucleosomas H1 se indican con flechas blancas. La trayectoria de los nucleosomas no unidos se denota con la flecha magenta. Las moléculas H1 que se difunden en el ADN desnudo se denotan con estrellas verdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

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