Name: Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: Aprende a preparar muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica usando FIB-SEM en ratón. Este protocolo optimizado permite reconstruir estructuras 3D de terminales de fotorreceptores con alta resolución nanométrica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualización de estructuras sinápticas de la retina en 3D con microscopía electrónica volumétrica

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+in+molecular+structural+biology%3A+A+historical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).</li>
<li>Varsano, N., Wolf, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+cellular+ultrastructure+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions.</a> Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).</li>
<li>Briggman, K. L., Bock, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+electron+microscopy+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structure and function of ribbon synapses.</a> Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+at+rod+and+cone+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).</li>
<li>Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+immunoprecipitated+synaptic+ribbons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Prot+Res%22%5BJournal%5D)">Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons.</a> J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).</li>
<li>Zampighi, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conical+tomography+of+a+ribbon+synapse%3A+structural+evidence+for+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion.</a> PLoS One. 6 (3), e16944(2011).</li>
<li>Barnes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+diversity+of+the+rod+spherule%3A+A+study+of+serially+reconstructed+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs.</a> Plos One. 11 (3), e0150024(2016).</li>
<li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, e25916(2017).</li>
<li>Crewe, A. V., Lin, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+backscattered+electrons+for+imaging+purposes+in+a+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope.</a> Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).</li>
<li>Richards, R. G., Gwynn, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Backscattered+electron+imaging+of+the+undersurface+of+resin-embedded+cells+by+field-emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy.</a> J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).</li>
<li>Wergin, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+thin+and+thick+sections+of+biological+tissue+with+the+secondary+electron+detector+in+a+field-emission+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope.</a> Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+of+specimen+preparation+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy.</a> Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity in the retina.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).</li>
<li>Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+EM+reconstruction+of+spinal+cord+reveals+wiring+specificity+in+speed-related+motor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits.</a> Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).</li>
<li>Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+electron+microscopy+and+neural+microcircuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis.</a> Front Neural Circuits. 12, 98(2018).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+approach+using+cryofixation+for+high-resolution+3D+analysis+by+FIB-SEM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM.</a> J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid-containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide-fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide+%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH).</a> J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,2,2-tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td>Ciencia de</tr><tr><td>la microscopía electrónica</td> de<td>acetona</td><td>10000</td><td></td></tr><tr><td>Amira 6.8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-2661</td><td></td></tr><tr><td>Molde de incrustación</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Tecnología</td><td>GP10590</td><td></td></tr><tr><td>Epon resina</td><td>Microscopía Electrónica Ciencia</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Microscopía Electrónica Ciencia</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>Helios NanoLab 600i doble haz SEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sigma</td><td>56-84-8</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de plomo</td><td>Sigma</td><td>10099-74-8</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Un componente del tampón de fosfato</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Un componente del tampón de fosfato</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Microscopía electrónica Ciencia</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro de potasio</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de sodio</td><td>Sigma</td><td>6131-99-3</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento por pulverización catódica</td><td>Leica</td><td>ACE200</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbohidrazida</td><td>Sigma</td><td>2231-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>TED PELLA</td><td>CA96049</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

La Figura 1A muestra la imagen de los terminales fotorreceptores de la retina preparados utilizando el método tradicional de doble fijación química, y la Figura 1B muestra la imagen de los terminales de los fotorreceptores de la retina preparados utilizando el método OTO. Ambos fueron muestreados por FIB-SEM. Se puede ver claramente que la estructura de la membrana celular se puede retener tanto como sea posible mediante el uso del método OTO, e incluso se puede ver claramente el contorno de las vesículas. Además, el contraste de las imágenes obtenidas mediante el método OTO también es más claro.
La Figura 2 ilustra el flujo de trabajo experimental empleado para reconstruir las características ultraestructurales de los terminales fotorreceptores. La reconstrucción se centró en cuatro tipos de terminales fotorreceptores, incluidos los pedículos del cono M, los pedículos del cono S, las esférulas de la varilla 1 y las esférulas de la varilla 2. El énfasis principal se centró en los componentes esenciales, como las mitocondrias, las cintas sinápticas y los grupos de vesículas sinápticas dentro de las terminales fotorreceptoras.
La Figura 3 muestra las mitocondrias reconstruidas y las cintas sinápticas en los terminales de los fotorreceptores de bastones. En particular, las cintas sinápticas de las esférulas de la varilla 2 exhiben una forma de herradura distintiva, generalmente con una sola cinta por esférula. Además, en la Figura 2 se destaca la presencia de dos mitocondrias en esférulas de bastones, con una posición consistente dentro del espacio central de los terminales, ubicadas por encima de las cintas sinápticas. Todas las estructuras fueron trazadas manualmente, página a página.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig01.jpg"> Figura 1: Ejemplos de imágenes muestreadas utilizando FIB-SEM para el método tradicional de doble fijación química y el método OTO. (A) Método tradicional de doble fijación química. (B) Método OTO. Barra de escala: 1000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig02.jpg"> Figura 2: Flujo de trabajo de reconstrucción 3D para terminales fotorreceptores mediante FIB-SEM. Después de la alineación utilizando un software de visualización de datos en 3D, las imágenes en serie se segmentaron y renderizaron manualmente para su posterior análisis. (A) Imágenes originales en serie. (B) Imágenes alineadas. (C) Imágenes segmentadas. (D) Imágenes reconstruidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig03.jpg"> Figura 3: Reconstrucción 3D. Las imágenes representativas de la reconstrucción 3D muestran los terminales fotorreceptores en blanco, las mitocondrias en naranja y las cintas sinápticas en azul. Barra de escala: 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

preparation-of-retinal-samples-for-volume-electron-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Proyección de imagen del tejido retiniano puede proporcionar información de unicelulares que no se desprende de los métodos bioquímicos tradicionales. Este protocolo describe la preparación de rodajas de retinales de pez cebra para la proyección de imagen confocal. Fluorescentes genéticamente codifican sensores o indicador tintes permiten visualización de numerosos procesos biológicos en los tipos de células retinianas distintas.

Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos

Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.

Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

Describimos un método para separar eficientemente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) de la retina en los ojos humanos y generar montones planos completos de EPR / coroides para análisis histológicos y morfométricos del EPR.

Generación eficiente y consistente de epitelio pigmentario retiniano/cordoides de montaje plano a partir de ojos humanos para análisis histológico

Este trabajo presenta una preparación alternativa de retina de montaje plano en la que la eliminación de los cuerpos de las células fotorreceptoras permite una difusión más rápida de los anticuerpos y un mejor acceso de la pipeta de parche a las neuronas internas de la retina para experimentos de inmunohistoquímica, hibridación in situ y electrofisiología.

Retina dividida como una preparación mejorada de montaje plano para estudiar las neuronas de la capa nuclear interna en la retina de vertebrados

Este protocolo describe los pasos detallados de la microscopía inmunoelectrónica previa a la incorporación, con un enfoque en la exploración de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas en la retina.

Investigación de circuitos retinianos y localización molecular mediante microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión

Este protocolo proporciona un procedimiento de preparación optimizado y elaborado para muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión. Es adecuado para aplicaciones que involucran el análisis de sinapsis en organoides retinianos maduros.

Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

Los pericitos de la vasculatura de la retina se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β después de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate. La retina marcada se trató posteriormente con el método de limpieza de tejidos y se montó completa para visualizar las vistas tridimensionales de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina bajo un microscopio confocal.

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

Aprende a preparar muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica usando FIB-SEM en ratón. Este protocolo optimizado permite reconstruir estructuras 3D de terminales de fotorreceptores con alta resolución nanométrica.

Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

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