Name: Reconstitución del canal receptor de glutamato bacteriano mediante encapsulación de un sistema de expresión libre de células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprende a reconstituir proteínas de membrana en células sintéticas mediante el método de emulsión de gotas invertidas. Este protocolo utiliza un sistema de expresión libre de células para sintetizar canales iónicos y estudiar potenciales de acción.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

APL agradece el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (EF1935265), los Institutos Nacionales de Salud (R01-EB030031 y R21-AR080363) y la Oficina de Investigación del Ejército (80523-BB)

Los reactivos y equipos utilizados para este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Reacciones masivas de CFE en presencia de pequeñas vesículas unilaminares (SUV)
<ol><li>Preparación para SUV NOTA: Este paso debe realizarse en una campana extractora siguiendo las instrucciones de seguridad para trabajar con cloroformo.<ol><li>Prepare 5 mM de SUV de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) en un vial de vidrio transfiriendo 76 μL de solución madre de POPC de 25 mg/mL disuelta en cloroformo.</li>
		<li>Mientras gira suavemente el vial de vidrio, sople un suave chorro de argón en el vial para formar una película de lípidos secos en el fondo. A continuación, transfiera el frasco de vidrio a un desecador con la tapa sin enroscar para evaporar el exceso de cloroformo.</li>
		<li>Mantenga el vial de vidrio en el desecador durante 1 h. A continuación, añada 0,5 ml de agua desionizada ultrapura para disolver la película lipídica y el vórtice durante aproximadamente 2 minutos.</li>
		<li>Configure un mini aparato de extrusión sumergiendo dos soportes de filtro en agua desionizada y colocándolos en cada uno de los soportes de membrana interna. A continuación, empapa un filtro de policarbonato de 100 nm y colócalo entre los dos soportes de membrana interna unidos por la carcasa exterior del extrusor y la tuerca de retención. Coloque esta configuración en el soporte del extrusor.</li>
		<li>Enjuague dos jeringas herméticas al gas de 1 ml 3 veces con agua desionizada ultrapura.</li>
		<li>Cargue la muestra de mezcla de lípidos y agua en una de las jeringas herméticas a gas de 1 ml y colóquela en un extremo del mini extrusor utilizando los clips del brazo oscilante para mantener la jeringa en su lugar. Inserte la segunda jeringa en el otro extremo del miniextrusor y asegúrese de que esté completamente presionada. NOTA: Cuando cargue la jeringa con la mezcla de lípidos y agua, asegúrese de que no haya aire en la jeringa antes de pasarla a través de la miniextrusora.</li>
		<li>Pase suavemente la mezcla de lípidos y agua de la jeringa original a la jeringa vacía a través del aparato miniextrusor. Repita este paso 11 veces para formar SUV. Transfiera los SUV a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: La solución para SUV puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Conjunto de reacción CFE<ol><li>Ensamble la reacción CFE siguiendo el protocolo de expresión libre de células proporcionado por el fabricante con ligeras modificaciones que se detallan a continuación.</li>
		<li>Mezclar 10 μL de Solución 1 (que contiene aminoácidos, NTPs, ARNt y sustratos para enzimas, y el tampón necesario), 1 μL de Solución 2 (proteínas en glicerol al 20%), 2 μL de Solución 3 (ribosoma (20 μM)), cantidad adecuada de ADN que codifica para sfGFP-sfCherry(1-10)27 soluble (referido sfGFP soluble en adelante), WT-GluR0-sfGFP o PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 pares de bases), 1 μL de inhibidor de la ARNasa murina y 4 μL de solución SUV de 5 mM para proteínas de membrana o 4 μL de agua para proteínas solubles.</li>
		<li>Lleve el volumen final de la reacción a 20 μL añadiendo agua desionizada ultrapura. NOTA: Al ensamblar el sistema CFE, todos los componentes deben mantenerse en hielo. Todos los materiales son sensibles a la temperatura y pueden degradarse si alcanzan la temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubación y monitoreo de reacciones de CFE<ol><li>Transfiera la solución de CFE a una placa cónica de fondo en V de 96 pocillos. Para evitar la evaporación durante el curso de la reacción, cubra la placa con una película de sellado.</li>
		<li>Cocine la placa a 37 °C en un lector de placas durante 4-5 h mientras supervisa la reacción CFE midiendo la señal GFP con una ganancia de 100 a longitudes de onda de excitación/emisión de 488 nm/528 nm cada 2 minutos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Reacciones de CFE encapsuladas en GUVs
<ol><li>Preparación de la solución tampón externa GUV<ol><li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, mezcle 1,5 μL de 1 M de espermidina, 37,5 μL de 100 mM de ATP, 25 μL de 100 mM de GTP, 12,5 μL de 100 mM de CTP, 12,5 μL de 100 mM de UTP, 25 μL de fosfato de creatina 1 M, 18 μL de acetato de magnesio 1 M, 93,33 μL de glutamato de potasio 3 M, 50 μL de 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL de ácido folínico 332 mM, 100 μL de glucosa 2 M y 50 μL de solución madre de mezcla de 6 mM de cada uno de los 20 aminoácidos (preparados siguiendo el protocolo descrito por Sun et al.28).</li>
		<li>Lleve el volumen final de la solución a 1 mL agregando agua desionizada ultrapurificada. NOTA: Todos los componentes deben mantenerse en hielo. Agregue la mezcla de aminoácidos al final para evitar el agotamiento de aminoácidos28. La solución puede alícuota en alícuotas de 330 μL y almacenarse a -20 °C hasta su uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la mezcla de lípidos en aceite NOTA: este paso debe realizarse en una campana extractora siguiendo las instrucciones de seguridad para trabajar con cloroformo.<ol><li>En una campana extractora, mezcle 17,3 μL de 25 mg/mL de solución madre POPC y 1,08 μL de 50 mg/mL de copolímero de poli(butadieno)-b-poli(óxido de etileno) (PEO-b-PBD) en un vial de vidrio de 15 mL. NOTA: La solución final de lípidos en aceite contiene 0,5 mM de lípidos con 95% y 5% de POPC y PEO-b-PBD, respectivamente. El PEO-b-PBD se utilizó para mejorar la estabilidad de la membrana durante la expresión de proteínas, pero se mantuvo en una proporción molar baja para reducir la tendencia del copolímero a agregarse en micelas separadas de las moléculas lipídicas29,30.</li>
		<li>Sople con cuidado un suave chorro de gas argón en el vial de vidrio mientras gira el vial para evaporar el cloroformo.</li>
		<li>Pipetear 1,2 mL de aceite mineral ligero en el vial de vidrio de 15 mL que contiene los lípidos secos.</li>
		<li>Mezclar los lípidos y el aceite mediante vórtice a velocidad máxima durante 10-20 s. La mezcla de lípidos y copolímeros disueltos tendrá un aspecto turbio.</li>
		<li>Para asegurarse de que todos los posibles agregados lipídicos en el aceite se disuelvan y dispersen completamente por todo el aceite, coloque el vial de vidrio en un horno a unos 50 °C durante 20 minutos antes de vórtice durante 10-20 s adicionales a velocidad máxima.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensamblaje y encapsulación de la reacción CFE (la Figura 1 resume los siguientes pasos).<ol><li>Prepare 300 μL de la solución externa de GUV en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL mezclando 270 μL de solución tampón externa de CFE preparada en el paso 2.1, 15 μL de 5 M de NaCl y 15 μL de 4,5 M de KCl. NOTA: En este paso, agregue 0,45 μL de 1,4-ditiotritol (DTT) de 1 M a la solución externa de GUV. El propósito de agregar NaCl y KCl es ajustar la osmolalidad de la solución externa para que coincida con la solución CFE interna. El volumen exacto de NaCl y KCl depende del ajuste de osmolalidad deseado. Se puede añadir NaCl o KCl o ambos para ajustar la osmolalidad.</li>
		<li>Pipetear suavemente 300 μL de mezcla de lípidos en aceite sobre la solución externa de GUV. NOTA: Al agregar la mezcla de lípidos y aceite, es importante que el aceite no se mezcle con la solución externa acuosa. Después de la adición, debe haber una interfaz visible entre la mezcla de lípidos en aceite y la solución externa de GUV.</li>
		<li>Incubar la interfaz aceite-agua a temperatura ambiente durante 2 h para permitir que se forme la monocapa lipídica y se estabilice en la interfaz.</li>
		<li>Mientras tanto, siga la sección 1.2.1 para ensamblar una reacción CFE que contenga el ADN plásmido que codifica las variantes de proteínas de membrana o GFP soluble. Reemplace los 4 μL de solución SUV de 5 mM o el agua con 4 μL de sacarosa 1 M. Esta reacción será la solución interna de GUV. NOTA: Se utilizó un osmómetro para medir la osmolalidad de las soluciones internas y externas. A continuación, la osmolalidad de la solución exterior se ajustó en consecuencia mediante la adición de NaCl o agua. La osmolalidad de la reacción CFE suele ser de alrededor de 1600 mOsm/Kg. La adición de sacarosa a la reacción aumenta la densidad de la solución interna, permitiendo así que las vesículas viajen a través de la interfaz aceite-agua durante la etapa de centrifugación. Una alternativa a la sacarosa es la solución de gradiente de densidad Opti-Prep.</li>
		<li>Agregue 600 μL de mezcla de lípidos y aceite al tubo de microcentrífuga que contiene la reacción CFE y pipetee hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante ~ 1 minuto para emulsionar la reacción en solución de lípidos en aceite y formar la monocapa de lípidos alrededor de las células sintéticas. NOTA: La solución final no debe tener burbujas y debe tener un aspecto opaco.</li>
		<li>Pipetear suavemente la emulsión de solución interna sobre la capa de aceite en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml donde se instaló la interfaz aceite-agua. NOTA: Tenga cuidado de no perturbar o desestabilizar la interfaz.</li>
		<li>Centrifugar durante 10 min a 2.000 x g a 4 °C. NOTA: La velocidad de centrifugación se optimizó para este protocolo. Adir et al.31 reportaron una velocidad de centrifugación diferente.</li>
		<li>Una vez finalizada la centrifugación, retire con cuidado el exceso de aceite y la solución exterior del tubo de microcentrífuga con una pipeta. Retire la solución exterior hasta que el volumen restante sea de alrededor de 100 μL. NOTA: Un pellet de GUV suele ser visible en la parte inferior del tubo de la microcentrífuga. Sin embargo, la falta de un pellet visible no significa necesariamente que no haya rendimiento de GUV. En lugar de usar una pipeta, el exceso de aceite en la parte superior de la solución exterior se puede eliminar por aspiración. Es fundamental asegurarse de que la solución de lípidos en aceite se elimine por completo. La contaminación del aceite en la solución GUV puede causar imágenes de baja calidad.</li>
		<li>Vuelva a suspender el gránulo de GUV en la solución restante de 100 μl pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, transfiera la solución GUV a una placa de fondo plano limpia de 96 pozos para incubar.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Incubación e imagen encapsuladas de la reacción CFE
<ol><li>Cubra la placa con una película de sellado para evitar la evaporación. Incubar la placa a 37 °C durante 5-6 h. Se puede utilizar un lector de placas y seguir el paso 1.3.2 para preparar el lector de placas para la etapa de incubación.</li>
	<li>Una vez finalizada la incubación, coloque la placa de 96 pocillos en la platina de imagen de un microscopio invertido equipado con una cámara EMCCD (o una cámara sCMOS), un láser controlado por DAQ-MX (o un sistema combinado de láser integrado) y un disco giratorio CSU-X1 confocal (o un confocal de escaneo láser). Concéntrese en cualquier ROI que contenga GUV y capture imágenes a una longitud de onda de excitación de 488 nm utilizando un objetivo Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.</li>
	<li>Guarde imágenes de GUV en formato .tiff.</li>
	<li>Abra las imágenes en un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ o Fiji). Abra el panel de configuración de Brillo/Contraste . Ajuste el brillo y el contraste a la configuración adecuada que haga visibles las proteínas fluorescentes.</li>
	<li>Si el objetivo es comparar la intensidad de la señal de diferentes proteínas expresadas, primero apile imágenes individuales de GUV que contengan diferentes proteínas utilizando el panel Imágenes para apilar ubicado en el submenú Imagen > Pilas . A continuación, ajusta el brillo y el contraste de todas las imágenes con el panel Brillo/Contraste .</li>
</ol>

Expresión libre de células de proteínas de membrana en vesículas unilamelares gigantes

<ol><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li>
<li>Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tissue-scale+properties+with+synthetic+cells%3A+Forging+one+from+many%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many.</a> ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).</li>
<li>Powers, J., Jang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+biomimetic+functions+of+synthetic+cells+through+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis.</a> Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: Past, present and future.</a> ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).</li>
<li>Groaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+spatiotemporal+organization+and+dynamics+in+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Nanomed+Nanobiotech%22%5BJournal%5D)">Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells.</a> WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685(2021).</li>
<li>Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cell+as+a+platform+for+understanding+membrane-membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions.</a> Membranes. 11 (12), 912(2021).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+crosslinker+competition+and+sorting+drive+emergent+GUV+size-dependent+actin+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture.</a> Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2021).</li>
<li>Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+photosynthetic+cell+producing+energy+for+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 1325(2019).</li>
<li>Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-regulated+and+bidirectional+communication+in+synthetic+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities.</a> ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).</li>
<li>Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+juxtacrine+signaling+between+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+tunable+performance+of+a+cell-free+biosensor+encapsulated+in+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles.</a> Science Advances. 9 (1), 6605(2023).</li>
<li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Protein+expression+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane Protein expression in cell-free systems.</a> Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).</li>
<li>Noireaux, V., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+age+of+cell-free+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">The new age of cell-free biology.</a> Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).</li>
<li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-sized+mechanosensitive+and+biosensing+compartment+programmed+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA.</a> Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).</li>
<li>Poddar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+stretching+activates+calcium+permeability+of+a+putative+channel+Pkd2+during+fission+yeast+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22MBoC%22%5BJournal%5D)">Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis.</a> MBoC. 33 (14), (2022).</li>
<li>Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+synthesis+in+cell-free+systems%3A+From+bio-mimetic+systems+to+bio-membranes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).</li>
<li>Dondapati, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+membrane+proteins+derived+from+eukaryotic+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems.</a> Front Pharmacol. 10, 917(2019).</li>
<li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis+and+reconstitution+using+mammalian+cell-free+lysates+enables+the+systematic+study+of+the+regulation+of+LINC+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly.</a> Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).</li>
<li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+study+of+liposome-assisted+synthesis+of+membrane+proteins+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system.</a> Sci Rep. 5 (1), 18025(2015).</li>
<li>Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+platforms+of+mammalian+cell-free+expressed+membrane+proteinsmembrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins.</a> Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).</li>
<li>Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+recruitment+of+ribosomes+in+protocells+recreates+a+translocon-independent+mechanism+of+proteorhodopsin+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis.</a> iScience. 24 (5), 102429(2021).</li>
<li>Steinküher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell-free+expression+of+membrane+proteins+by+tuning+ribosome+cotranslational+membrane+association+and+nascent+chain+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+potassium-selective+prokaryotic+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor.</a> Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hsu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-triggered+DNA-mediated+membrane+fusion+in+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells.</a> Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).</li>
<li>Moghimianavval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+functional+membrane-membrane+interfaces+by+interspy%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy.</a> Small. 19 (13), 2202104(2023).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762(2013).</li>
<li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li>
<li>Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+conjugation+of+%28tri-%29+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li>
<li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts%2C+liposomes+and+emulsion+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829(2020).</li>
<li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416(2023).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+Not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li>
<li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332(2021).</li>
<li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509(2023).</li>
<li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+polymersomes%3A+a+comparative+review+towards+cell+mimicking%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li>
<li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse-phase+method+revisited%3A+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+%28GUVs%29+using+emulsification+followed+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+A%3A+Physicochem+Eng+Asp%22%5BJournal%5D)">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li>
<li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li>
<li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells%3A+A+membrane+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Prácticamente cualquier proceso celular que dependa de la transferencia de moléculas o información a través de la membrana celular, como la señalización celular o la excitación celular, requiere proteínas de membrana. Por lo tanto, la reconstitución de proteínas de membrana se ha convertido en el principal cuello de botella en la realización de varios diseños de células sintéticas para diferentes aplicaciones. La reconstitución tradicional mediada por detergentes de proteínas de membrana en membranas biológicas requiere métodos de generación de GUV, como el hinchamiento suave o la electroformación. Los enfoques de hinchamiento suelen producir vesículas de pequeño tamaño, y el rendimiento de la electroformación disminuye significativamente cuando se encapsulan soluciones complicadas, que suele ser el caso cuando se generan células sintéticas32. Además, los detergentes solubilizan la proteína de membrana, y su eliminación durante el proceso de reconstitución puede causar un mal plegamiento de la proteína33,34. Por otro lado, el enfoque presentado aquí se basa en la incorporación cotranslational de la proteína de membrana en la bicapa lipídica, que se asemeja más a la vía de biogénesis de proteínas naturales en las células22.
Desde un punto de vista técnico, el protocolo presentado es ventajoso frente a otros métodos de encapsulación comunes, como la electroformación y la encapsulación continua de cruce de interfaces de gotas 7,8,35,36 (cDICE), para una implementación más fácil ya que el único equipo de laboratorio necesario para la generación de GUV es una centrífuga. A diferencia de la electroformación, el método de emulsión invertida permite la encapsulación de diferentes combinaciones de moléculas con varias concentraciones. Además, en comparación con la técnica original de emulsión invertida25, este enfoque genera GUV más estables que son adecuados para la encapsulación de lisados de CFE o sistemas PURE. La mayor estabilidad del GUV se debe a la presencia de copolímero diblock en la composición de la membranaGUV 37, así como a la larga incubación de la interfaz aceite-agua que permite que la interfaz se sature con moléculas lipídicas. Por último, a diferencia de los enfoques microfluídicos, el protocolo presentado aquí no requiere pequeños canales y tubos. Por lo tanto, la reacción CFE se puede encapsular tan pronto como se ensambla, y el menor tiempo de ensamblaje GUV debido a la falta de flujo y la posible obstrucción evita el inicio prematuro de la reacción CFE. Si bien la demostración de la expresión de proteínas de membrana en este protocolo es exclusiva de las reacciones PUREfrex, se puede ampliar este método para sintetizar proteínas utilizando diferentes sistemas CFE disponibles, como los sistemas CFE bacterianos basados en lisado o mamíferos.
El enfoque presentado aquí tiene limitaciones que son causadas por la naturaleza dependiente del petróleo del proceso de formación de GUV y la intención de tener GUV estables. Este enfoque suele ser más largo en comparación con otros métodos, como cDICE o microfluídica, debido al largo tiempo de incubación de la interfaz aceite-agua que se requiere para la estabilización de la interfaz y el alto rendimiento de GUV. Además, la composición lipídica se limita principalmente a POPC con pequeñas dosis de otros lípidos o copolímeros en bloque, mientras que otros métodos, como la electroformación, son más adecuados para la incorporación de lípidos con diferentes propiedades físicas y químicas. Si bien la composición de la membrana GUV en este método es una mezcla de POPC y PBD-PEO para maximizar el rendimiento de CFE, se pueden probar las posibles variaciones en la composición de la membrana GUV. Sin embargo, podría ser necesaria una mayor optimización de los parámetros para otras proteínas de membrana. Dado que la emulsificación de las gotas se produce mediante pipeteo manual, los GUV generados mediante este método son polidispersos y de tamaño bastante heterogéneo. Además, el hecho de que los lípidos se disuelvan en la fase orgánica puede causar ocasionalmente una capa de aceite entre las dos valvas de la membrana GUV o contaminar la cámara de imagen con aceite que puede ser perjudicial para la calidad de la imagen. Una posible solución para el desafío del aceite residual es reemplazar el aceite mineral con un solvente orgánico volátil, como el éter dietílico, como lo muestran Tsumoto et al.38, para confiar en la evaporación del solvente junto con la centrifugación durante la formación de GUV.
Si bien no hay una demostración de la función del canal en este trabajo, inspirado en ensayos anteriores utilizados para sondear la funcionalidad del canal mecanosensible o sensible a la luz reconstituido, se describe un ensayo basado en microscopía de fluorescencia. Se ha informado que la apertura del canal GluR0 aumenta la conductividad de la membrana para los iones K+ 24. Debido a que las reacciones CFE ya contienen una alta concentración de K+, los indicadores típicos de potasio no serán adecuados para evaluar la funcionalidad del canal. Sin embargo, debido a que la afluencia de potasio cambia el potencial de membrana, los indicadores sensibles de potencial de membrana como DiBAC4(3)22 o BeRST 139 podrían informar de la actividad de GluR0 en presencia de glutamato.
La reconstitución exitosa de proteínas de membrana en células sintéticas abre numerosas posibilidades para crear células sintéticas con capacidades sin precedentes que imitan más de cerca a las células naturales. Una de las principales desventajas actuales de las células sintéticas es su incapacidad para reproducirse y reciclar energía. Sin embargo, con esquemas de regeneración de energía dependientes de la luz y los productos químicos que dependen en gran medida de las proteínas de membrana, se pueden imaginar células sintéticas duraderas40. El uso de sistemas CFE permite la reconstitución de múltiples proteínas de membrana que pueden realizar colectivamente ciertas tareas. Por ejemplo, la reconstitución de un canal iónico activado por un ligando similar al GluR0 descrito aquí, junto con diferentes canales iónicos activados por voltaje, puede conducir a la construcción de una célula sintética excitable similar a una neurona.

La biología sintética ascendente ha ganado un interés creciente en la última década como un campo emergente con numerosas aplicaciones potenciales en bioingeniería, administración de fármacos y medicina regenerativa 1,2. El desarrollo de células sintéticas como piedra angular de la biología sintética ascendente, en particular, ha atraído a una amplia gama de comunidades científicas debido a las prometedoras aplicaciones de las células sintéticas, así como a sus propiedades físicas y bioquímicas similares a las de las células que facilitan los estudios biofísicos in vitro 3,4,5,6 . Las células sintéticas a menudo se diseñan en vesículas unilaminares gigantes (GUV) del tamaño de una célula en las que se recrean diferentes procesos biológicos. La reconstitución del citoesqueleto celular 7,8, la regeneración de energía dependiente de la luz9, la comunicación celular10,11 y la biodetección12 son ejemplos de los esfuerzos realizados para reconstruir comportamientos similares a los de las células en células sintéticas.
Si bien algunos procesos celulares dependen de proteínas solubles, muchas características de las células naturales, como la detección y la comunicación, a menudo utilizan proteínas de membrana, incluidos canales iónicos, receptores y transportadores. Un desafío importante en el desarrollo de células sintéticas es la reconstitución de las proteínas de membrana. Aunque los métodos tradicionales de reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas se basan en la purificación mediada por detergentes, estos métodos son laboriosos, ineficaces para proteínas que son tóxicas para el huésped de expresión o, a menudo, no son adecuados para la reconstitución de proteínas de membrana en GUV13.
Un método alternativo para la expresión de proteínas son los sistemas de expresión libre de células (CFE). Los sistemas CFE han sido una poderosa herramienta en biología sintética que permite la expresión in vitro de diversas proteínas utilizando lisado celular o maquinaria de transcripción-traducción purificada14. Los sistemas CFE también pueden encapsularse en GUVs, permitiendo así reacciones de síntesis de proteínas compartimentadas que pueden programarse para diversas aplicaciones, como la creación de células sintéticas de captación de luz9 o biosensores mecanosensibles15,16. De manera análoga a los métodos de expresión de proteínas recombinantes, la expresión de proteínas de membrana es un desafío en los sistemas CFE17. La agregación, el plegamiento incorrecto y la falta de modificación postraduccional en los sistemas CFE son cuellos de botella importantes que dificultan la síntesis exitosa de proteínas de membrana utilizando sistemas CFE. La dificultad de la reconstitución de proteínas de membrana de abajo hacia arriba utilizando sistemas CFE se debe en parte a la ausencia de una vía compleja de biogénesis de proteínas de membrana que se base en péptidos señal, partículas de reconocimiento de señales, translocones y moléculas acompañantes. Sin embargo, recientemente, múltiples estudios han sugerido que la presencia de estructuras membranosas como microsomas o liposomas durante la traducción promueve la expresión exitosa de proteínas de membrana 18,19,20,21. Además, Eaglesfield et al. y Steinküher et al. han descubierto que la inclusión de dominios hidrofóbicos específicos conocidos como péptidos señal en el extremo N-terminal de la proteína de membrana puede mejorar significativamente su expresión22,23. En conjunto, estos estudios sugieren que el desafío de la reconstitución de proteínas de membrana en células sintéticas puede superarse si la traducción de proteínas se produce en presencia de la membrana GUV y si se utiliza el péptido señal N-terminal adecuado.
En este trabajo se presenta un protocolo para la encapsulación de la síntesis de proteínas utilizando reacciones CFE de elementos recombinantes (PURE) para la reconstitución de proteínas de membrana en GUVs. Se selecciona el receptor bacteriano de glutamato24 (GluR0) como proteína modelo de membrana y se estudia el efecto de su péptido señal N-terminal en la reconstitución de su membrana. Se investiga el efecto del péptido señal de proteorrodopsina, que Eaglesfield et al.22 demostraron mejorar la eficiencia de la reconstitución de proteínas de membrana, mediante la construcción de una variante mutada de GluR0 denominada PRSP-GluR0 y se compara su expresión y localización en la membrana con GluR0 de tipo salvaje (en adelante, WT-GluR0) que alberga su péptido señal nativo. Este protocolo se basa en el método de emulsión invertida25 con modificaciones que lo hacen robusto para la encapsulación de CFE. En el método presentado, las reacciones de CFE se emulsionan primero utilizando una solución de lípidos en aceite que genera gotas del tamaño de una micra que contienen el sistema CFE y son estabilizadas por la monocapa de lípidos. A continuación, las gotas de emulsión se colocan sobre una interfaz aceite-agua que está saturada con otra monocapa lipídica. A continuación, las gotas de emulsión se ven obligadas a viajar a través de la interfaz aceite-agua mediante la fuerza centrífuga. A través de este proceso, las gotas obtienen otra monocapa, generando así una vesícula lipídica bicapa. A continuación, se incuban los GUV que contienen la reacción CFE, durante la cual se expresa la proteína de membrana y se incorpora a la membrana GUV. Aunque este protocolo está especificado para la expresión libre de células de GluR0, puede utilizarse para la síntesis libre de células de otras proteínas de membrana o para diferentes aplicaciones de células sintéticas, como la reconstitución de citoesqueletos o los estudios de fusión de membranas26.

<table><tbody><tr><td>Filtro de policarbonato de 100 nm</td><td>STERLITECH</td><td>1270193</td><td></td></tr><tr><td>96 Placa inferior transparente de 96 pozos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1M Lector multimodo híbrido</td><td>Agilent</td><td>11-120-533</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de creatina</td><td>Millipore Sigma</td><td>10621714001</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Unidad de escáner confocal</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente de densidad medio (Optiprep)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556</td><td>Opcional para cambiar con sacarosa en solución interna</td></tr><tr><td>Soportes de filtro</td><td>Microtubos Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico, sal, sal, hidrato</td>, <td>Millipore Sigma</td><td>F7878</td><td></td></tr>, <tr><td>Glucosa</td>, <td>Millipore Sigma</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 cámara&nbsp;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico sal de potasio monohidrato</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral ligero</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de magnesio tetrahidratado;</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>Kit de miniextrusora (incluye soporte para jeringa y soporte para extrusora)</td><td>Microscopio</td> invertido Avanti <td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX21</td><td></td></tr><tr><td>Olympus PlanApo N 60x Microscopio de aceite Objetivo&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>1-U2B933&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PEO-b-PBD</td><td>Fuente de polímero</td><td>P41745-BdEO</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP ADN plásmido</td><td>casero</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-sfGFP-sfCereza (1-10) ADN plásmido</td><td>casero</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP ADN plásmido</td><td>casero</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lípido POPC en cloroformo&nbsp;</td><td>Avanti</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>PUREfrex 2.0</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>GFK-PF201</td><td></td></tr><tr><td>Juego de soluciones de ribonucleótidos</td><td>New England BioLabs</td><td>N0450</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa, Murine</td><td>New England BioLabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>RTS Muestreador de aminoácidos</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>VAPRO Osmómetro de Presión de Vapor modelo 5600</td><td>ELITechGroup</td><td>VAPRO 5600</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitución del canal receptor de glutamato bacteriano mediante encapsulación de un sistema de expresión libre de células

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

Los sistemas de expresión libre de células (CFE) son herramientas poderosas en biología sintética que permiten la biomímesis de funciones celulares como la biodetección y la regeneración de energía en células sintéticas. Sin embargo, la reconstrucción de una amplia gama de procesos celulares requiere la reconstitución exitosa de las proteínas de membrana en la membrana de las células sintéticas. Si bien la expresión de proteínas solubles suele tener éxito en los sistemas CFE comunes, la reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas de células sintéticas ha demostrado ser un desafío. Aquí, se demuestra un método para la reconstitución de una proteína de membrana modelo, el receptor bacteriano de glutamato (GluR0), en vesículas unilaminares gigantes (GUVs) como células sintéticas modelo basado en la encapsulación e incubación de la reacción CFE dentro de células sintéticas. Utilizando esta plataforma, se demuestra el efecto de la sustitución del péptido señal N-terminal de GluR0 por el péptido señal de proteorrodopsina en la translocación cotraduccional exitosa de GluR0 en membranas de GUV híbridos. Este método proporciona un procedimiento robusto que permitirá la reconstitución libre de células de varias proteínas de membrana en células sintéticas.

Antes de la encapsulación de las reacciones CFE, dos variantes de GluR0-sfGFP que albergaban péptidos señal nativos y proteorrodopsina (las secuencias de péptidos señal se presentan en la Tabla Suplementaria 1), y el sfGFP soluble se expresaron individualmente en reacciones masivas, y su expresión se monitoreó mediante la detección de la señal de sfGFP utilizando un lector de placas (Figura 2A). Las proteínas de membrana se expresaron en ausencia o presencia de SUV de 100 nm. Además, utilizando una curva de calibración que correlaciona la señal de sfGFP con su concentración (Figura Suplementaria 1), se estimaron las concentraciones de proteínas sintetizadas (Tabla Suplementaria 2). Claramente, la sfGFP soluble tuvo la expresión más alta entre las tres proteínas, lo que sugiere que la expresión de proteínas de membrana impone una carga al sistema CFE, lo que ralentiza la reacción y reduce su rendimiento. Además, en promedio, las reacciones que expresan proteínas de membrana en presencia de SUV mostraron una señal de sfGFP más alta en comparación con las reacciones sin SUV. Esta observación se alinea con los hallazgos de Steinküher et al., quienes demostraron que la expresión de proteínas de membrana reduce la capacidad de los sistemas CFE para producir proteínas23. Sin embargo, dada la demostración exitosa de la expresión de proteínas en la reacción de CFE a granel, se puede razonar que la CFE encapsulada también sintetizará proteínas dentro de GUV. 
A continuación, las reacciones individuales de CFE se encapsularon en GUV utilizando el método de emulsión invertida para expresar variantes de GluR0, a saber, WT-GluR0, PRSP-GluR0 y sfGFP soluble. Mientras que WT-GluR0, que alberga el péptido señal nativo de GluR0, demostró una excelente expresión y localización de la membrana (Figura 2B, panel izquierdo), su contraparte, PRSP-GluR0, que tiene un péptido señal N-terminal de proteorrodopsina, no mostró una localización de membrana fuerte similar. Se encontró que PRSP-GluR0 es más propenso a la agregación y a la formación de puntos (Figura 2B, panel central). Como se esperaba, la sfGFP soluble se expresó en GUVs y permaneció en el lumen de GUVs (Figura 2B, panel derecho; ver Figura 2 Suplementaria para imágenes de cohortes de GUVs).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66595/66595fig01.jpg"> Figura 1: Pasos experimentales de la emulsión invertida. (1) Se visualizan los pasos 2.3.1 a 2.3.3 del protocolo para demostrar el ensamblaje de la monocapa lipídica en la interfaz de la mezcla de lípidos-aceite y la solución tampón externa. (2) Aquí se muestra la visualización del paso 2.3.5 del protocolo para representar la formación de la monocapa lipídica alrededor de las gotas emulsionadas que encapsulan la solución CFE interna. (3) El paso 2.3.6 del protocolo muestra la adición de los GUV monocapa al tubo de microcentrífuga con la monocapa lipídica en la interfaz de una mezcla de lípidos y aceite y una solución tampón externa. (4) Aquí se representa el paso 2.3.7, en el que la centrifugación conduce a la formación de un pellet GUV en la solución exterior. (5) Aquí se muestra el paso 2.3.8, que indica el proceso de eliminación del exceso de mezcla de lípidos en aceite y la solución exterior. (6) Finalmente, aquí se representa el paso 2.3.9, donde el pellet de GUV se resuspende en la solución exterior y los GUV están listos para la incubación, seguida de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/66595fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66595/66595fig02.jpg"> Figura 2: Expresión de proteínas en reacciones CFE a granel y en GUVs que encapsulan reacciones CFE. (A) Lecturas de fluorescencia de reacciones CFE masivas individuales que expresan WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP y sfGFP soluble. El gráfico de sfGFP soluble representa la señal de una reacción de 2,5 μL (el volumen de reacción estándar es de 20 μL) para evitar la sobresaturación de las mediciones del lector de placas. Los datos se presentan como media ± S.D, n = 3. (B) Izquierda: Una imagen confocal representativa de una reacción CFE encapsulada por GUV que expresa WT-GluR0-sfGFP. Centro: Una imagen confocal representativa de GUVs encapsulando la reacción CFE que expresa PRSP-GluR0-sfGFP. Derecha: Una imagen confocal representativa de una reacción CFE encapsulada por GUV que expresa sfGFP soluble. Barras de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/66595fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: La curva de calibración de la señal sfGFP y su correspondiente análisis de regresión lineal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Imagen confocal representativa de cohortes de GUVs que expresan (izquierda) WT-GluR0-sfGFP, (centro) PRSP-GluR0-sfGFP y (derecha) sfGFP soluble. Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 1: Secuencia de aminoácidos de los péptidos señal de tipo salvaje y proteorrodopsina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 2: Concentración de proteínas sintetizadas en reacciones CFE a granel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe el método de emulsión invertida utilizado para encapsular un sistema de expresión libre de células (CFE) dentro de una vesícula unilaminar gigante (GUV) para la investigación de la síntesis e incorporación de una proteína de membrana modelo en la bicapa lipídica.

Reconstitución del canal receptor de glutamato bacteriano mediante encapsulación de un sistema de expresión libre de células

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

Nuestro protocolo aborda la reconstitución de una proteína de membrana dentro de la bicapa lipídica de una célula sintética elaborada mediante el método de emulsión de gota invertida. La ventaja de utilizar el método de emulsión de gotas invertidas es su capacidad para generar células sintéticas que proporcionan un entorno estable para la expresión libre de células de proteínas de membrana. Nuestro protocolo ofrece un método robusto para que los investigadores en el campo sinteticen proteínas de membrana dentro de células sintéticas utilizando un sistema de expresión libre de células.Mi laboratorio está trabajando en la reconstitución de varios canales iónicos en células sintéticas a través de la reconstitución del potencial de acción por un conjunto bien definido de canales iónicos.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.

La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Este artículo describe métodos para el etiquetado de espín dirigido al sitio y la reconstitución de canales pentaméricos activados por ligandos para estudios de Resonancia Paramagnética Electrónica. Este protocolo se puede adaptar a cualquier proteína de membrana. El método de reconstitución descrito aquí también se puede utilizar para mediciones de patch-clamp de corrientes macroscópicas y de un solo canal en un sistema lipídico definido.

Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones

Se presenta un protocolo de expresión libre de células fácil de usar para la incorporación específica de residuos de análogos de aminoácidos no canónicos en proteínas, incluido el análisis posterior, para estudios médicos, farmacéuticos, estructurales y funcionales.

La incorporación de residuos específicos de no canónicos aminoácidos en las proteínas modelo usando una<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sistema de transcripción-traducción libre de células

Aquí se presenta un protocolo para experimentos FRET de alta precisión en el nivel de una sola molécula. Además, esta metodología puede usarse para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar las distancias exactas es el primer paso hacia la construcción de modelos estructurales basados ​​en experimentos FRET.

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

Se presenta un procedimiento para el refolding el dCACHE periplasmic dominio obligatorio del ligand del jejuni del Campylobacter quimioreceptor Tlp3 de cuerpos de inclusión y de la purificación para producir cantidades de miligramos de proteína.

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Este artículo presenta un método para estudiar el tráfico de receptores de glutamato (GluR) en cultivos hipocampales primarios disociados. Utilizando un enfoque de alimentación de anticuerpos para etiquetar receptores endógenos o sobreexpresados en combinación con enfoques farmacológicos, este método permite la identificación de mecanismos moleculares que regulan la expresión superficial de GluR modulando procesos de internalización o reciclaje.

Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados

En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.

Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

Este estudio presenta un procedimiento detallado para realizar experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) en receptores acoplados a proteínas G (GPCR) utilizando el etiquetado específico del sitio a través de la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA). El protocolo proporciona una guía paso a paso para la preparación de muestras smFRET, experimentos y análisis de datos.

Visualización de la dinámica conformacional de los receptores de membrana utilizando FRET de molécula única

Este protocolo describe el sistema de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) utilizado en la construcción de células sintéticas. Describe las etapas clave con resultados representativos en diferentes microcompartimentos. El protocolo tiene como objetivo establecer las mejores prácticas para diversos laboratorios en la comunidad de células sintéticas, avanzando en el desarrollo de células sintéticas.

Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas

Aprende a reconstituir proteínas de membrana en células sintéticas mediante el método de emulsión de gotas invertidas. Este protocolo utiliza un sistema de expresión libre de células para sintetizar canales iónicos y estudiar potenciales de acción.

Reconstitución del canal receptor de glutamato bacteriano mediante encapsulación de un sistema de expresión libre de células

Explorar más videos