Name: Un modelo fotopolimerizable de ácido hialurónico-colágeno del microambiente de glioma invasivo con flujo intersticial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Aprende a replicar el microambiente tumoral de glioma con flujo intersticial usando un hidrogel de ácido hialurónico-colágeno. Este modelo permite cuantificar la invasión celular y estudiar mecanismos de progresión del glioblastoma.

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<meta charset="utf8"></head><body>Replicación de la invasión del glioblastoma con el sistema de hidrogel de hialuronano-colágeno I

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El glioblastoma es una enfermedad devastadora, caracterizada por una supervivencia corta1 que se prolonga solo moderadamente con los tratamientos clínicamente disponibles 2,3. Este impedimento para una terapia eficaz se debe en gran medida a la naturaleza altamente infiltrativa de las células madre de glioma quimiorresistente (GSC) que son inaccesibles para la resección y la siembra de tumores recurrentes4. Al mismo tiempo, las GSC son altamente plásticas, respondiendo a diversos estímulos en el microambiente tumoral (TME) para sobrevivir e invadir 5,6. Específicamente, el tumor densamente poblado y la vasculatura permeable producen un diferencial de presión pronunciado en el borde tumoral, aumentando el flujo de líquido intersticial (IFF) en distintas regiones que se correlacionan con la invasión de GSC7. Este aumento de la IFF influye en 8,9,10 y, a menudo, mejora la invasión de 8,9 GSC a través de vías moleculares que son susceptibles de inhibición farmacológica. Sin embargo, este proceso se confunde por la influencia de la glía en el TME en la invasión del glioma; de hecho, se ha descrito que la glía modula la invasión del glioma en numerosos contextos11, y la evidencia preliminar en nuestro laboratorio indica una influencia similar de la glía en la invasión del glioma realzado con IFF12. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo TME 3D ajustable que replica estas regiones fronterizas tumorales invasivas mediante la incorporación de interacciones IFF y glia-GSC para cuantificar la invasión de GSC y otros resultados (es decir, expresión de proteínas de superficie o intracelulares, expresión de ARN, etc.) según la influencia de IFF, glía y / o terapias candidatas12 (Figura 1).
El modelo TME es similar a otros ensayos de flujo de fluido intersticial basados en insertos de cultivo de tejidos (es decir, ensayos estáticos/de flujo) que han sido ampliamente publicados 8,9,10,13,14,15,16,17,18. Las principales distinciones de este modelo son la incorporación de una matriz de colágeno-ácido hialurónico no patentada y sintonizable, la inclusión de astrocitos y microglía en la matriz en proporciones representativas de los TME del paciente12, y el sistema está completamente encerrado en una placa de pocillo, sin tubos externos, depósitos o bombas. El ácido hialurónico es uno de los principales componentes de la matriz extracelular del cerebro19, pero no es suficiente para permitir el flujo de líquidos; por lo tanto, el colágeno I se incluye en la mezcla. La reticulación se produce en dos pasos: una polimerización de crecimiento en cadena iniciada por radicales libres, en la que, tras la exposición a la luz ultravioleta (UV), se producen radicales libres a partir del fotoiniciador y generan enlaces cruzados químicos entre las moléculas de ácido hialurónico metacrilato20, y la neutralización del colágeno conservado en ácido y la exposición al calor para formar fibras de colágeno 21,22,23.
Varios parámetros que fueron optimizados para este ensayo han sido descritos en trabajos previamente publicados en hidrogeles de hialuronano-colágeno modificados con tiol 8,12. En concreto, las células (GSCs24 humanas primarias, astrocitos corticales humanos primarios y microglía humana inmortalizada) utilizadas para este ensayo son al menos un 60% viables durante 3 días en geles compuestos por medios astrobasales suplementados con factores de crecimiento GSC, 0,5% v/v N-2 y 1% v/v B-27 sin vitamina A12. En los casos en los que los geles deben degradarse (por ejemplo, para la extracción de proteínas o la citometría de flujo), se utilizan colagenasa y dispasa, que mantienen una viabilidad suficiente (Figura 2).
Para cuantificar la invasión, las GSC deben marcarse con fluorescencia antes de que se combinen con la glía en la matriz. Esto se puede lograr mediante el marcaje con Hoechst 33342 (como se describe a continuación), rastreadores celulares12, modificación genética o transducción. En cualquier caso, se debe medir la viabilidad de las células marcadas con nuevos marcadores antes de incorporarlas al modelo TME. Alternativamente, si la invasión no se cuantificará pero los geles se cosecharán para extracciones de proteínas, extracciones de ARN u otros resultados, las células a menudo no necesitan ser marcadas con fluorescencia durante el proceso de preparación del gel. En ese caso, los geles pueden fijarse en formol para la obtención de imágenes, degradarse y lisarse las células para la extracción de ARN, o degradarse utilizando proteasas para la citometría de flujo y posteriormente lisarse con tampones de lisis de proteínas para Western blots u otro trabajo con proteínas.
Aquí, presentamos un protocolo para incorporar astrocitos humanos, microglía y GSC derivadas del paciente en una proporción definida por el paciente, 4:1:112, en una matriz de colágeno I de 1,2 mg/mL y 4 mg/ml de hialuronano en condiciones estáticas de flujo. Los parámetros específicos utilizados para un ensayo (es decir, proporciones celulares, rigidez, tipos de células, etc.) pueden modificarse para representar diferentes contextos si la viabilidad es adecuada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama del modelo TME que consta de GSC, astrocitos y microglía en un hidrogel bajo una cabeza de presión de fluido. Las células están incrustadas en un hidrogel de colágeno y ácido hialurónico dentro de un inserto de cultivo de tejidos. La fuerza gravitacional impulsa el flujo neto hacia abajo. Los poros de la membrana del inserto de cultivo de tejidos permiten que las células que invaden hacia abajo se adhieran a la superficie inferior del inserto de cultivo de tejidos, y estas células se pueden fijar, obtener imágenes y cuantificar. Creado con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig02.jpg"> Figura 2: Viabilidad celular tras la degradación del hidrogel. Las G34s (GSCs), los astrocitos y la microglía se sembraron en el modelo TME a 4:1:1 y se incubaron durante 21 h a 37 °C. Los geles se eliminaron y degradaron utilizando 0,3 mg/mL de colagenasa + 0,02 mg/mL de dispasa durante un total de 30, 45 o 60 min, pipeteando para mezclar cada 15 min (condición de 30 min) o a los 30 min y luego cada 15 min (condiciones de 45 min y 60 min). Después de degradar los geles, las células se tiñeron con naranja de acridina (todas las células) y yoduro de propidio (células muertas) y se contaron utilizando un contador de células automatizado. Se informa de la viabilidad de todas las células dentro del modelo TME. Las células mantuvieron al menos un 70% de viabilidad durante 30-60 min. Los datos se presentan como media ± SEM; n = 3 réplicas biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos, productos científicos estériles</td><td>Celltreat&nbsp;</td><td></td><td></td>229112</tr><tr><td>Filtro de 250 mL&nbsp; Sistema, material de filtro PES, 0.22 y micro; m, 50 mm, estéril</td><td>DOT Scientific</td><td>667706</td><td></td></tr><tr><td>385 nm, 1650 mW (min) LED montado, 1700 mA&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>M385LP1-C1</td><td></td></tr><tr><td>75cm2 Matraz de cultivo de tejidos - Tapón de ventilación, Celltreat</td><td>Scientific Products</td><td>estéril 229341</td><td></td></tr><tr><td>8.0 &mu; m Inserto de placa de cultivo celular de 12 mm</td><td>de diámetro Millicell</td><td>PI8P01250</td><td></td></tr><tr><td>etanol absoluto, 200 pruebas, grado de biología molecular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T038181000CS</td><td>etanol para el control de células muertas por citometría de flujo.</td></tr><tr><td>Medio de astrocitos (Astrofull)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>1801</td><td>Contiene astrobasal, FBS y penicilina/estreptomicina.&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplemento de B-27 (50x), menos vitamina A (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BSA (MACS)</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD71 (eBioscience, Invitrogen)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>25-0719-41</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos con cámara de recuento de células</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-PD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Raspadores de células</td><td>Biologix USA&nbsp;</td><td>70-1250</td><td></td></tr><tr><td>celómetro K2 contador de células fluorescentes (Nexelcom Bioscience)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>Centrífuga NEXCCMK2-SK150-FCS</td><td></td></tr><tr><td>- Eppendorf de baja velocidad</td><td>&nbsp;</td><td>5702 R</td><td>Centrífuga para cultivo celular.</td></tr><tr><td>Microplacas de poliestireno transparente de 96 pocillos, Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-108</td><td>placas de fondo en V para tinción por citometría de flujo.</td></tr><tr><td>CO2&nbsp; Incubadora, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, Alta Concentración,</td><td>Cola de Rata Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, Cola de Rata</td><td>Corning</td><td>354236</td> <td>Concentración "Baja" para el recubrimiento de matraces adherentes.</td></tr><tr><td>Colagenasa (CAS# 9001-12-1)</td>Adaptador de colimación biológico <td>C7511-30</td><td></td>de <td>los Estados Unidos</td></tr><tr><td>para Olympus BX & IX, AR Recubrimiento: 350 - 700 nm</td><td>Thorlabs</td><td>COP1-A</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos de algodón, Q-tips Precision Tips&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B01KCJB3R2</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa (CAS# 9001-92-7)&nbsp;</td><td>Estados Unidos Biológico</td><td>D3760</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>Para el cultivo de microglía.</td></tr><tr><td>Solución de formalina, tamponada neutra, 10% (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / Juego de tampones de tinción de factor de transcripción (eBioscience, Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Células madre de glioma</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Pueden ser líneas de células madre de glioma comerciales o derivadas de pacientes.&nbsp;</td></tr><tr><td>Guava easyCyte HT System</td><td>Millipore Sigma</td><td>0500-4008</td><td>Citómetro de flujo.</td></tr><tr><td>HBSS (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M) (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Controlador LED de 1 canal de alta potencia con modulación de pulsos, 10,0 A máx., 50,0 V máx.&nbsp;</td><td>Interfaz Thorlabs</td><td>DC2200</td><td>para lámpara UV.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Solución (20 mM) (Thermo Scientific)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Astrocitos humanos</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>1800</td><td>Astrocitos primarios derivados de la corteza cerebral.</td></tr><tr><td>Proteína recombinante EGF humana (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF-básico humano (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Proteína recombinante (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>Microglía humana inmortalizada - Materiales</td><td>biológicos aplicados hTERT&nbsp;</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>Incu-mixer MP Vórtice de microplaca calentada, 2 posiciones</td><td>Benchmark Scientific&nbsp;</td><td>H6002</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 REAfinity, Anticuerpo PerCP-Vio 700</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-420</td><td></td></tr><tr><td>LED Medidor de curado UV</td><td>Gigahertz-Optik</td><td>X1-RCH-116</td><td>Optómetro para medir la intensidad de la luz UV.</td></tr><tr><td>Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP)&nbsp;</td><td>Biomatrix Avanzado</td><td>5269-100MG&nbsp;</td><td>Fotoiniciador.</td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Infrarrojo cercano reparable (Invitrogen)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L24975</td><td></td></tr><tr><td>Ácido hialurónico metacrilato (photoHA)</td><td>Microcentrífuga Advanced Biomatrix</td><td>5212-100MG</td><td></td></tr><tr><td>, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-997-203</td><td>Centrífuga para tinción por citometría de flujo.</td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100X) (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal-A (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7,4 sin Ca & Mg</td><td>Calidad Biológico</td><td>119-069-101</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, pellets ACS (CAS# 1310-73-2)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>97064-476</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain AOPI Solución de tinción</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CS2-0106</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo fotopolimerizable de ácido hialurónico-colágeno del microambiente de glioma invasivo con flujo intersticial

A Photopolymerizable Hyaluronic Acid-Collagen Model of the Invasive Glioma Microenvironment with Interstitial Flow

Se proporcionan datos representativos de la invasión (Figura 3), la viabilidad y la expresión de Ki67 y CD71 a través de citometría de flujo (Figura 4) para las líneas GSC publicadas anteriormente para un hidrogel de hialurónico-colágenotiomodificado 12. La presencia de astrocitos y microglía dentro del modelo TME tiene un efecto diferencial en la invasión de GSC dependiendo de la línea celular (Figura 4). En...

Un modelo fotopolimerizable de ácido hialurónico-colágeno del microambiente de glioma invasivo con flujo intersticial

Glioblastoma recurrence is a major hindrance to treatment success and is driven by the invasion of glioma stem cells (GSCs) into healthy tissue that are ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video demuestra cómo las gliomasferas, derivadas de tumores cerebrales, se separan en células individuales y se encapsulan en un hidrogel a base de ácido hialurónico. Este proceso promueve las interacciones célula-célula, formando un modelo de glioblastoma estructurado y tridimensional.

Un hidrogel a base de ácido hialurónico para el cultivo tridimensional de células de glioblastoma

En este video, las células de glioblastoma y microglía se mezclan con una solución de matriz polimérica y se transfieren a un inserto de cámara porosa donde se forma un gel que incrusta las células. La microglía estimula la migración de las células del glioblastoma a través del inserto poroso, imitando la invasión de las células tumorales en el tejido circundante, las células se fijan y se preparan para su posterior análisis.

Modelo de invasión tumoral basado en matriz mediante cocultivo de glioblastoma de microglía

Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo tridimensional de células de glioblastoma derivados del paciente dentro de biomateriales ortogonalmente ajustables diseñados para imitar la matriz del cerebro. Este enfoque proporciona una en vitro, plataforma experimental que mantiene muchas características de en vivo células de glioblastoma normalmente perdidas en cultura.

Ácido hialurónico basado en hidrogeles de 3 dimensiones cultura de células de Glioblastoma derivados del paciente

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

El presente protocolo describe una plataforma experimental para evaluar los efectos de las señales mecánicas y bioquímicas en las respuestas quimioterapéuticas de las células de glioblastoma derivadas de pacientes en cultivos miméticos de matriz 3D utilizando un dispositivo de iluminación UV hecho a medida que facilita la fotoreticulación de alto rendimiento de hidrogeles con características mecánicas sintonizables.

Las matrices de hidrogel permiten un mayor rendimiento para los efectos de detección de los componentes de la matriz y la terapéutica en modelos tumorales 3D

El presente protocolo establece un modelo post-resección de recaída de glioblastoma (GBM) utilizando microscopía para investigar el efecto terapéutico de un hidrogel inyectable y biosensible in vivo.

Modelo post-resección de la recaída del glioblastoma para investigaciones terapéuticas de hidrogel

Aquí, presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y barata de esferoides tumorales seguida de encapsulación de hidrogel. Es ampliamente aplicable ya que no requiere equipo especializado. Sería particularmente útil para explorar las interacciones esferoides-matrices y construir modelos de fisiología tisular o patología in vitro .

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Presentamos un modelo de migración de glioblastoma 3D utilizando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes generadas a partir de tumores recién diagnosticados y recurrentes. Esta plataforma permite visualizar la dinámica migratoria específica del paciente y evaluar la eficacia terapéutica. El ensayo puede multiplexarse tras la migración para evaluar la localización y los patrones de expresión de proteínas.

Ensayo reproducible de migración de glioblastoma 3D con localización esferoide mediada por nanopartículas magnéticas bajo condiciones hipóxicas

Un nuevo enfoque que permite el análisis de la alta resolución de las interacciones de célula de cáncer con exógena de ácido hialurónico (HA) se describe. Superficies modeladas se fabrican mediante la combinación de la química y la impresión por microcontacto carbodiimida.

Superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer

El flujo de fluido intersticial es elevada en los tumores sólidos y puede modular la invasión de células tumorales. Aquí se describe una técnica para aplicar el flujo de fluido intersticial a las células embebidas en una matriz y luego medir sus efectos sobre la invasión de células. Esta técnica se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sistemas.

Tridimensional de la célula modelo de cultivo para medir los efectos del flujo del fluido intersticial en la invasión de células tumorales

Aprende a replicar el microambiente tumoral de glioma con flujo intersticial usando un hidrogel de ácido hialurónico-colágeno. Este modelo permite cuantificar la invasión celular y estudiar mecanismos de progresión del glioblastoma.

Un modelo fotopolimerizable de ácido hialurónico-colágeno del microambiente de glioma invasivo con flujo intersticial

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